分离小鼠脂肪组织来源的微血管片段作为组织工程中的血管化单元

摘要

我们提出一种用于分离脂肪组织来源的微血管片段的方案，这些微血管片段是极具前景的血管化单元。它们可被快速分离，且无需 体外 处理，因此可用于组织工程不同领域的一体化预血管化。

摘要

功能性微血管网络对于工程化组织构建物的存活与整合至关重要。为此，已建立多种促血管生成和预血管化策略。然而，大多数基于细胞的方法均包含耗时的步骤 体外 微血管网络形成的步骤。因此，它们不适用于术中一步式操作。脂肪组织来源的微血管片段（ad-MVF）是具有前景的血管化单元。它们可从脂肪组织中轻松分离，并具有功能性微血管形态。此外，在移植后可迅速重组形成新的微血管网络 在体 植入。此外，研究表明ad-MVF能够诱导淋巴管生成。最后，它们还是间充质干细胞的丰富来源，这可能进一步增强其高血管化潜能。在先前的研究中，我们已证实ad-MVF在工程化骨和皮肤替代物中具有显著的血管化能力。在本研究中，我们报道了一种从小鼠脂肪组织中酶法分离ad-MVF的标准化操作流程。

引言

组织工程致力于制造能够维持、恢复或增强无法手术修复的组织和器官功能的替代物 体内 对应物^1,2工程化组织构建物的存续命运在很大程度上取决于充分的血管化³这些结构中的微血管网络应具有层次化结构，包含小动脉、毛细血管和小静脉，以便在与受体血管吻合后实现有效的血液灌注⁴此类网络的构建是组织工程中的关键挑战之一。为此，过去二十年中已提出了一系列广泛的实验性血管化策略。^5,6.

促血管生成方法通过结构或理化支架修饰（例如加入生长因子⁷）来刺激受体微血管向工程化组织内生长。然而，对于大体积三维结构的血管化，依赖血管生成的策略明显受限于新生微血管生长速度缓慢的问题⁸。

相比之下，预血管化的概念旨在组织工程构建物植入前，于其内部形成具有功能的微血管网络⁹。传统的预血管化方法涉及在支架中共同培养成血管细胞，例如内皮细胞、壁细胞或干细胞¹⁰。在微血管网络形成后，可将预血管化的构建物植入组织缺损部位。值得注意的是，这种预血管化策略在临床应用中较为困难，因其依赖于复杂且耗时的体外（in vitro）操作过程，并受到重大监管障碍的限制⁹。因此，仍需开发更适合广泛临床应用的新型预血管化策略。

这种预血管化策略可能采用脂肪组织来源的微血管片段（ad-MVF）。ad-MVF 是一种高效的血管化单元，可从大鼠^11,12和小鼠¹³的脂肪组织中大量获取。它们由小动脉、毛细血管和小静脉段组成，具有生理性微血管形态，包含管腔及起稳定作用的血管周围细胞^14,15。这一独特特性使得接种 ad-MVF 的支架无需预培养即可立即植入组织缺损部位。在体内，ad-MVF 能迅速重组成功能性的微血管网络。此外，ad-MVF 还是间充质干细胞的丰富来源¹⁶，这可能进一步增强其显著的再生能力。因此，ad-MVF 已越来越多地应用于组织工程的多个领域^{14,15,17,18,19,20,21}。

ad-MVF 的分离最初在大鼠中建立^11,12。本文描述了一种从小鼠附睾脂肪垫中标准化分离 murine ad-MVF 的方案。该方法可借助转基因小鼠模型，进一步揭示 ad-MVF 功能背后的分子机制。

方案

所有操作均按照美国国立卫生研究院关于实验动物使用指南进行，并遵循机构指南（德国萨尔布吕肯市社会、健康与消费者保护局食品与兽医事务部门中央机构）。

1. 外科手术器械的准备

1. 准备好解剖剪、手术镊、小型解剖剪、精细镊子，以及一个含有15 mL达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM；10% 胎牛血清（FCS）、100 U/mL 青霉素、0.1 mg/mL 链霉素）的无菌培养皿，用于采集附睾脂肪垫。
2. 将手术器械浸入消毒液中处理5分钟。或者，进行灭菌处理（蒸汽灭菌；121 °C，20分钟）。

2. 动物与麻醉

1. 根据研究目的和研究对象仔细选择小鼠品系。
   注意：本研究中，我们选用雄性野生型 C57BL/6 小鼠作为供体，以获取附睾脂肪。值得注意的是，血管基质片段（ad-MVF）也可从转基因绿色荧光蛋白（GFP）阳性供体动物（C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J）²²中分离获得。其主要优势在于，将这些片段植入GFP阴性的野生型小鼠后，可通过GFP的免疫组织化学染色轻松检测到移植的片段¹⁴。
2. 通过腹腔注射赛拉嗪（15 mg/kg）和氯胺酮（75 mg/kg）对动物进行麻醉。通过夹趾试验确认动物已进入深度麻醉状态，无任何反应。由于供体动物在脂肪采集后将被处死，因此无需使用眼部润滑剂。
   注意：确保镇痛措施和手术无菌操作符合实验所在国家和机构的相关指南要求。

3. 收集附睾脂肪垫

1. 将动物转移至手术台，在手术体视显微镜下使其呈仰卧位，并通过夹捏脚趾确认深度麻醉状态。
2. 用胶带将动物四肢固定于手术单上，并用消毒液对腹部进行消毒。
3. 使用解剖剪将腹部皮肤与下方肌肉层分离。
4. 使用解剖剪沿中线行腹腔切开术，并将腹壁瓣向两侧展开。
5. 借助精细镊子辨认双侧睾丸、附睾及附睾脂肪垫（图1）。操作时避免损伤肠管结构，以防粪便污染脂肪垫。
6. 在体视显微镜下使用小型解剖剪和精细镊子采集附睾脂肪垫。应在附睾与脂肪之间保留数毫米的安全距离，以降低误采附睾组织的风险。
   注意：此操作也可不使用体视显微镜进行，但可能进一步增加附睾及精索意外损伤的风险。
7. 将采集的附睾脂肪垫转移至含有15 mL预热至37 °C的DMEM培养基的培养皿中，用于转运至细胞实验室。
8. 通过腹主动脉切开或颈椎脱位法处死动物。

4. ad-MVF 的分离

1. 准备三个无菌培养皿，每个培养皿中加入15 mL磷酸盐缓冲液（PBS），无菌14 mL聚丙烯（PP）管、无菌50 mL锥形瓶、无菌1.5 mL锥形微量离心管以及已灭菌的精细剪刀。
2. 在超净工作台中，用15 mL PBS将脂肪垫在培养皿中洗涤三次。
3. 将脂肪转移至一个14 mL聚丙烯（PP）管中。通过管上的刻度确定所采集脂肪组织的体积（以mL计）。使用精细剪刀对脂肪组织进行机械剪切，直至获得均一的组织悬液。
4. 将切碎的组织用两倍体积的胶原酶NB4G（0.5 U/mL PBS）通过10 mL量筒转移至50 mL锥形瓶中。总体积为步骤4.3中测得脂肪组织体积的三倍。在37 °C、5% CO₂湿润大气条件下，使用自动搅拌器（磁力搅拌棒尺寸：25 mm）剧烈搅拌，于培养箱中消化组织10分钟。₂.
5. 在显微镜下观察少量消化组织（10 µL），以判断消化是否可以终止。确认消化液主要含有 "自由" 单个细胞旁出现ad-MVF，表明应在此时停止酶消化过程（图2).
   注意：此步骤需要操作者具备相关实验经验，对分离的脂肪微血管片段（ad-MVF）质量至关重要。脂肪消化时间过长会导致形成单细胞悬液，而无法获得ad-MVF。
6. 用两倍体积的PBS/20% FCS中和酶。总体积变为第4.4步中细胞-血管悬液体积的三倍。将细胞-血管悬液转移回新的PP管中。
7. 在37 °C下孵育悬浮液5分钟，通过重力作用使腺泡状微血管片段（ad-MVF）与残留脂肪分离。然后使用1 mL精密移液器小心移除主要的脂肪上清液。再使用100 µL精密移液器重复此步骤数次，直至悬浮液看起来无脂肪残留。
8. 将一个500 µm滤膜置于50 mL锥形离心管上方。使用10 mL量筒将细胞-血管悬液从14 mL聚丙烯（PP）管转移至滤膜上，以去除残留的脂肪凝块。根据计划实验所需的单个ad-MVF分离物数量，将滤过的悬液转移至新的14 mL PP管中。
   注意：对于 体外 在关注微血管网络形成的实验中，为进一步纯化细胞-血管悬液以提高显微分析过程中的成像质量，可能具有积极意义。为此，可使用20 µm滤膜对悬液进行额外一次过滤，以去除滤膜上截留的附着型微血管片段（ad-MVF）中的单个细胞。
9. 将细胞-载体悬浮液离心（600 × g，5 分钟，室温），以获得含有 ad-MVF 的沉淀。
10. 离心后，弃去上清液，保留1 mL。用1 mL ad-MVF重悬沉淀，并将悬液转移至1.5 mL锥形微量离心管中。
11. 将微离心管中的 ad-MVF 悬液离心（600 × g，5 分钟），以获得沉淀。
12. 去除上清液，用所需终体积的 PBS / 20% FCS 重悬沉淀。
    注意：可通过显微镜计数评估每个分离株中附着性微血管片段（ad-MVF）的数量。为此，将终末细胞-血管悬液的1/10体积用PBS按1:10比例稀释，取100 µL该稀释液加入96孔板的一个孔中。随后计数所有呈现血管样形态的ad-MVF，并据此推算整个分离株中的总数。所需的ad-MVF浓度及纯化程度可根据具体实验需求 individually adapted to the respective 体外 或 在体 ad-MVF 的应用。这包括将 ad-MVF 包埋于胶原凝胶中 体外 微血管网络形成的分析或在支架上接种ad-MVF 体内 植入组织缺损处。

结果

在本研究中，我们使用7至12月龄雄性野生型C57BL/6小鼠（平均体重：35 ± 1 g）的脂肪组织进行了六次ad-MVF分离操作。图1展示了小鼠附睾脂肪垫的采集过程，以及随后的机械法和酶解法ad-MVF分离。脂肪组织采集耗时30分钟，ad-MVF分离耗时120分钟，整个操作共耗时150分钟。

每只供体动物收获 1.2 ± 0.1 mL 脂肪组织。该脂肪量可每毫升分离出 42,000 ± 2,000 个 ad-MVF。分离得到的 ad-MVF 平均长度为 42 ± 1 µm（图 2A）。酶消化时间通过显微镜观察控制，如图 2B所示。ad-MVF 呈现出典型的微血管形态，具有层级分明的血管节段（图 2C）。

讨论

本研究介绍了一种成熟的ad-MVF分离方案。从小鼠脂肪组织中获取ad-MVF是一项操作简单但包含若干关键步骤的实验过程。小鼠具有不同的皮下和腹腔内脂肪沉积。如先前在大鼠中所述，最适合用于分离ad-MVF的脂肪来源是附睾脂肪垫，因其体积较大、结构均一，且较少受到大血管的污染^11,12。相比之下，小鼠的皮下脂肪沉积体积更小，且与周围组织粘连更紧密。然而，切除附睾脂肪垫时存在意外损伤附睾和精索的风险，可能导致收获的组织被精子污染。因此，在该操作中准确识别附睾、睾丸及精索至关重要。此外，脂肪垫在收获后应尽快处理，以最大限度减少离体（ex vivo）组织损伤。最后需注意，小鼠附睾脂肪垫的血管化程度存在显著的年龄依赖性差异²³。根据我们的经验，使用6至12月龄的雄性供体小鼠可获得足量的ad-MVF，适用于体外（in vitro）和体内（in vivo）研究。然而，也有可能从更年轻的小鼠中分离ad-MVF，这些小鼠的脂肪垫体积较小但血...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 锥形微量离心管	德国凯尔斯特巴赫 VWR	700-5239
100-µL型精密移液器	Eppendorf，德国汉堡	4920000059
10 mL 量筒吸管	Costar，康宁公司，纽约，美国	4488
14 mL PP 管	德国弗里克豪森，Greiner bio-one	187261
1 mL 精密移液器	Eppendorf，德国汉堡	4920000083
500-µm 滤器（pluriStrainer 500 µm)	HISS 诊断公司，德国弗赖堡	43-50500-03
50 mL 锥形离心管	德国弗里克豪森，Greiner bio-one	227261
50 mL 锥形瓶	VWR，凯尔斯特巴赫，德国	214-0211
96孔板	德国弗里克豪森，Greiner bio-one	65518
细胞解离液（Accutase）	eBioscience，美国加利福尼亚州圣地亚哥	00-4555-56
C57BL/6小鼠	查尔斯河，德国科隆	027
C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J 小鼠	美国巴港杰克逊实验室	003291
CD117-FITC	BD 生物科学公司，德国海德堡	553373
CD31-PE	BD 生物科学，德国海德堡	553354
胶原酶 NB4G	Serva Electrophoresis GmbH，德国海德堡	17465.02	制造商已对批次进行酶活性检测
解剖剪	Braun Aesculap AG &CoKG，德国梅尔松根	BC 601
DNA结合染料（Bisbenzimide H33342）	Sigma-Aldrich，德国陶夫基兴	B2261
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	PAN Biotech，Rickenbach，德国	P04-03600
胎牛血清（FCS）	Biochrom有限公司，德国柏林	S0615
精细镊子	S&T AG，瑞士诺伊豪森	FRS-15 RM-8
精细剪刀	美国佛罗里达州萨拉索塔，世界精密仪器公司	503261
真皮皮肤替代物（Integra）	Integra Life Sciences，Sain Priest，法国	62021
氯胺酮	德国贝尔恩堡血清工厂股份公司，贝尔恩堡，德国	7005294
M-IgG2akAL488	eBioscience，美国加利福尼亚州圣地亚哥	53-4724-80
Octeniderm（消毒液）	施ülke & Mayer，诺德斯特德，德国	118211
青霉素/链霉素	Biochrom，德国柏林	A2213
培养皿	德国弗里克豪森，Greiner bio-one	664160
磷酸盐缓冲液（PBS）	龙沙集团，巴塞尔，瑞士	17-516F
pluriStrainer 20-µ米（20 µm 滤膜	HISS 诊断公司，德国弗莱堡	43-50020-03
Rat-IgG2akFITC	BD 生物科学，德国海德堡	553988
Rat-IgG2akPE	BD 生物科学，德国海德堡	553930
小型解剖剪	S&T AG，瑞士诺伊豪森	SDC-15 R-8S
手术镊	Braun Aesculap AG &CoKG，德国梅尔松根	BD510R
医用胶带（Heftpflaster Seide）1.25 厘米	芬克 & Walter GmbH，德国梅赫魏勒	1671801
赛拉嗪	Bayer Vital GmbH，德国勒沃库森	1320422
α-SMA-AL488	eBioscience，美国加利福尼亚州圣地亚哥	53-9760-82	细胞内标记还需使用 Cytofix/Cytoperm（BD Biosciences，德国海德堡；#554722）