方法文章

中国南方与过敏性鼻炎和/或哮喘的花粉过敏原研究的成分分析诊断方法

DOI：

10.3791/55723

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2017年6月4日

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1State Key Laboratory of Respiratory Disease, 2National Clinical Research Center of Respiratory Disease, 3Guangzhou Institute of Respiratory Diseases, 4Department of Allergy and Clinical Immunology, First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 5Department of Respiratory Medicine, Sixth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作描述了一个方案，使用组分解决的方法来研究来自华南地区患有过敏性鼻炎和/或哮喘的患者对草花粉过敏原的敏化。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

对草花粉的致敏对全球过敏性气道疾病造成风险。虽然预防依赖于当地对花粉过敏原的调查，但在华南地区，这一问题的数据有限。任何可用的数据都是通过自我报告调查表，皮肤刺痛试验和使用粗提取物进行的全部或特异性IgE测试获得的。由于很多原因，这些方法是不可靠的。使用全自动免疫测定分析仪作为组分，检测来自大广州（华南最大城市及其郊区）患有过敏性鼻炎和/或哮喘的患者的百日草，提摩西草和葎草 ens过敏原的血清sIgE反应性解决诊断（CRD）工具。

在过敏性鼻炎和/或哮喘的中国南方人中，首次证实了百慕大草药阳性的相当高的流行率。在这些患者中，敏感感染的微妙流行也提到了提摩太草和葎草钪，这可能是由交叉反应性引起的，因为后两者在该地区不常见。过敏原成分的检测也得到了支持。

全自动免疫分析仪可以在区域，实验室和机构之间以及随着时间的推移提供令人满意的一致性。仪器的自动化可以实现在CRD出现之前不容易揭示的标准化检测。

这是一项研究，使用CRD方法调查中国南方对草花粉过敏原的敏感性。它增加了文献中的现有证据。需要未来的研究来验证这些发现。然而，虽然CRD是一个有用的工具，但使用全自动免疫分析仪进行的研究结果不能取代其他实验室调查，临床评估和医师专业知识。

引言

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草花粉占免疫球蛋白E（IgE）相关过敏的近50％，由于其空气传播性质，引起过敏性气道疾病的全球风险，特别是哮喘和过敏性鼻炎1,2,3,4 。防止一个地区的草花粉过敏依赖于有关花粉过敏原局部分布的信息。不幸的是，致敏过敏原的光谱范围因地而异，一般称为区域特异性。

在中国，广泛的东亚地区，过去几十年来，该国南部目前有限的数据，草地花粉敏感的区域特异性进一步复杂化5 。这样的数据缺乏导致了显示整个草花粉感觉的困难这个大国的化身6 。另外，中国南方人的非常有限的数据主要来自自我报告问卷，皮肤刺痛试验（而不是实验室血清检测），总IgE测量（而不是变应原特异性IgE（sIgE））和sIgE检测对变应原而不是变应原成分分子）。

过敏性症状的自我报告在特定过敏原时可能不可靠。皮肤刺痛试验尽管可以广泛使用，但涉及使用非标准化的粗过敏原提取物，它们本身可能含有混合结果解释的其他致敏组分。皮肤刺痛试验的可靠性也在很大程度上取决于过敏者或专科护士，近期组胺使用和患者依从性（有时幼儿很难）的巧妙操作。总IgE对筛选过敏是有用的，但不明智地确定e患者的过敏原。而且，几乎所有的过敏原都含有许多变应原成分分子。对主要成分（ 即 Der p 1和Der p 2来自房屋尘螨）的敏化可能表明"真正的"过敏（对特定过敏原过敏，而不是由于与其他过敏原的交叉反应而引起的假阳性），而是致敏对于某些（ 即，交叉反应性Der p 10，原肌球蛋白）可能不是7 。

在组件解析诊断（CRD）被引入之前，这些令人失望的挫折阻碍了中国的过敏原研究。 CRD通过使用重组或纯化的过敏原分子精确检测变应原的成分，从而使测量容易量化和表征8 。过去几十年来，过敏研究经常使用不可避免地含有一些不相关成分的过敏原粗提取物。这些公司中的许多组合物是惰性的，但偶尔也会导致混淆的积极反应。在CRD中使用重组或纯化的过敏原分子可以避免这种情况，从而提供更好的测试准确性。当在微阵列中进行处理时，CRD方法可快速筛选或鉴定个体受试者中数百种变应原分子的致敏性。目前，中国南方草坪花粉敏感性研究较为完善。理想情况下，这样的研究应该包括当地人口相当广泛的地理覆盖，占中国常见的草花粉，并解决上述技术问题。为了达到临床相关性的实用水平并促进血清样品的募集，早期研究对作为吸入性过敏原的草花粉敏感，也可能集中于患有过敏性呼吸系统疾病的患者，而不是一般人群。

这项工作描述了一种方法用于使用CRD方法检测来自大广州（华南最大的城市及其郊区）患有过敏性鼻炎和/或哮喘的百慕大草，提莫西草和葎草的血清sIgE反应性5 。这些对中国南方亚热带和温带草花粉敏感的研究结果为文献中现有的重要证据提供了重要依据。

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方案

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包括人血清样本使用在内的研究方案由广州医科大学第一附属医院伦理委员会批准。所有参与者独立或通过父母提供书面知情同意书（对于儿童）。协议已在线注册（中国临床试验注册机构，注册号:ChiCTR-DCC-13004003，参见http://www.chictr.org/cn/）。

1.研究人口的确定

注意:呼吸疾病国家重点实验室（AIR-SKLRD）的过敏信息库是患者招募的主要来源，因为AIR是中国南方9,10号变应原检测患者文献最多的大型数据库。 AIR一直存储患者血清样本近十年。简言之，这些储存的样品预先通过离心5mL o而制备以3000×g静脉注射静脉血10分钟，并回收上清液。将血清样品置于-80℃冰箱中长期储存。满足患者入选标准的样本已准备好用于本研究中的所有测试。

  1. 从AIR数据库，检索2013年1月至2015年6月期间预设研究期间过敏性鼻炎和/或哮喘患者进行草过敏原sIgE血清检测的数据。
  2. 根据过敏性鼻炎及其对哮喘的影响（ARIA） 11和全球哮喘倡议（GINA） 12指南，选择轻度至中度过敏性鼻炎和/或哮喘患者。将它们分配为"研究组"。
  3. 排除患者不完整的病历，失踪者，拒绝给予知情同意使用血清样本用于科学用途的患者，目前使用免疫治疗或免疫调节剂的人，或发现有寄生虫感染的那些。
  4. 根据相同的排除标准，选择一个非呼吸过敏患者（ 即湿疹，过敏性皮炎和食物过敏）的现代队列，并将其分配为"对照组"。
  5. 在给予任何处方或处理之前，请确保收集血清样本，以尽量减少对实验室检查结果的混杂影响。排除不符合这一要求的血清样品。
  6. 确保所有科目都是大广州各地的永久居民（ 即出生或在那里居住十多年）。

2.研究流程和兴趣测量

  1. 从生物银行检索合格患者的血清样本。要测试过敏原/过敏原成分，请使用140μL血清（包括100μL填充）死亡空间）。
    注意:本研究中每名患者需要的最大血清总体积是:3种特异性过敏原和8种变应原组分，sIgE = 140μL* 11 = 1,540μL。
  2. 使用本仪器时，主要将百里草，蒂莫西草和葎草 to to to the the the the。。。。。。。。。。。。按照第3节中的说明进行操作。
    注意:这些花粉被选择用于测量，因为百慕大草13,14,15和Humulus scandens 16已经在中国被广泛报道，而Timothy草17,18,19是一种典型的植物物种，其生活在从热带到温带的环境中并在全球范围内进行了大量研究。
  3. 其次，测试步骤2.3中鉴定的血清样品sIgEs对百慕达[Cyn d 1（g216）]，Timothy [Phlp 1（g205），Phl p 4（g208），Phl p 5（g215），Phl p6（g209））的变应原成分存在的全身过敏原），Phl p7（g210），Phlp11（g211）和Phlp12（g212）]和交叉反应性碳水化合物决定簇[CCD（o214）]。按照第3节中的说明进行操作。

3.使用免疫测定分析系统的全自动化测试程序

注意:完全自动化并已在其他地方描述的过敏原sIgE测试的整个过程遵循制造商的协议。

  1. 启动全自动免疫分析仪（ 例如 ImmunoCAP1000），并在整个研究中使用它进行免疫测定。打开内置的信息数据管理（IDM）计算机。
    注意:免疫测定法yzer通常处于待机模式。
  2. 打开"主电源"，打开"系统电源"，等待3分钟直到内置软件启动。点击"加载冲洗液"和"加载洗涤液"。
  3. 每个过敏原/变应原成分测试，向小瓶中加入140μL血清。标记每个含有140μL血清的小瓶，每个患者的识别号码是唯一的。
  4. 从IDM界面，通过单击菜单执行以下步骤。
    1. 检查IDM上的"请求列表"窗口，确保"sIgE"是选择的测试方法。
    2. 将样品管样品架和质量控制管装入质量控制机架，带条形码。
      注意:对于每个患者，最初计划将sIEE测试为3种特异性过敏原和8种变应原组分，或346×11（3,806）个样品管。每个样品管，3个质量控制管含有低，中，高水平的sIgE控制（参见材料表）。最后，在二次检查中进一步检查了仅有58例在初级检测中检测为阳性的患者（步骤2.3）（步骤2.3）。管的加载可以自动设置在计算机控制台上。
    3. 在"分析处理"屏幕中选择"加载试剂"。根据"加载表"，完成样品和质量控制机架，开发溶液，共轭，校准器，载体，移液管吸头，停止溶液和洗涤液的装载（详见材料表 ）。
    4. 在"加载和启动"中，按"确定"。
      注意:在测量结束时，结果将显示在IDM上。
    5. 从IDM界面，选择要导出的数据。点击"菜单"，"批准"和"另存为"，并将sIgE测量结果作为电子表格文件导出。
    6. 将电子表格文件导入统计软件（ 例如 SPSS） 10 。使用SPSS菜单中的Spearman系数的特定模块，分析这些草花粉（阳性sIgE与整个变应原）和花粉组分（阳性sIgE对变应原分子）之间的敏感性的相关性。

sIgE反应性的定义

注意:对于未稀释的血清样本，特异性IgE测量的范围为0.35至100 kU / L。

  1. 用sIgE值> 100 kU / L 1:5稀释样品并重新测定。当值保持在100 kU / L以上时，继续进行稀释，直到达到1000 kU / L的终点水平。
  2. 基于0.35 kU / L的阈值，考虑超过0.35 kU / L的sIgE电平为正值5，7，10。评价复活节sIgE测试为:1级（≥0.35和<0.70 kU / L），2级（≥0.70和<3.50 kU / L），3级（≥3.50和<17.50 kU / L），4级（≥ 17.50和<50.00 kU / L），5级（≥50.00和<100.00 kU / L）和6级（≥100.00kU / L）。

5.统计分析

  1. 用统计软件（ 如 SPSS）分析数据10 。报告定量数据为平均值和标准偏差，定性数据为中位数和四分位数范围（IQR），分类数据为阳性结果的比例。
  2. 使用卡方检验进行组间比较比较，定量数据的非配对t检验和定性数据的秩和检验。
  3. 使用Pearson的参数数据之间的相关性分析，相关系数表示为"r"，Spearman对非参数值的检验，t他的相关系数表示为" r s "。当P值<0.05时，考虑统计学意义。

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结果

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在本研究中使用的全自动免疫测定分析仪具有共价结合的共同结构，其中共价偶联过敏原或变应原成分，与来自患者的血清标本中感兴趣的分子（sIgE）反应。使用自动程序，分析仪用150μL冲洗溶液清洗所有非特异性IgE，并重复5次。然后加入酶标记的抗IgE抗体（50μL）以产生复合物。酶标记的抗IgE抗体（缀合物）是与特异性IgE结合的二抗。通过用150μL洗涤溶液洗涤（重复3次）来消除未结合的抗IgE抗体。将结合的复合物在37℃用显影剂（50μL）处理9分钟。显影剂是切断所有结合的抗IgE抗体的酶消化剂。后者在碱性条件下发射荧光。反应停止添加碱性停止溶液。此后，仪器将固相结构压缩以挤出洗脱液并测量所得洗脱液在470nm波长处的荧光。荧光与洗脱液中感兴趣的分析物分子的绝对水平线性相关。较高的荧光值意味着血清样本中的sIgE更高。为了解释测试结果，系统使用校准曲线自动将样品的响应转换为浓度。测量数据以电子方式传输到IDM软件，该软件集成了分析结果计算，统计计算和结果报告功能。

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讨论

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全自动免疫分析仪可以在区域，实验室和机构之间以及随着时间的推移提供令人满意的一致性。已经发现这种自动化程序基本上支持实验室研究和临床研究，能够对许多过敏原和/或变应原组分进行标准化检测，并鉴定在CRD出现之前不容易揭示的可能的变应原交叉反应性。此外，整个测试程序可以通过严格的质量控制完成，允许在大地理区域的调查中要求的高通量方法。虽然测试程序主要由计算机控制台运行，但应该引起几个关键问题的关注。严格按照用户手册使用仪器;任何像差可能导致不必要的测试误差，机械损坏或激光束或高电压的人身伤亡。永远在确保在系统中存储了正确和正确的校准曲线，因为这与测试的准确性有关。否则，应在血清样本测试之前测量指定校准品的sIgE浓度。之后，系统可以自动计算和存储校准曲线供后续使用。与其他实验室技术一样，观察人血清操作的安全性也是重要的，以保护技术人员免受感染，并避免污染环境。

这项研究首次通过使用全自动免疫分析仪作为CRD方法，显示在广州，华南地区，过敏性鼻炎和/或哮喘患者百慕大草药阳性率（22.5％）相当普遍。由于Timothy草和Humulus scandens在广州不常见，甚至...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有什么可以披露的。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢俞素明在准备这个数字方面的帮助。本研究由广东省科技基金（项目编号:2014A020212352），广州市教育局（1201630044; 1201630393）和国家自然科学基金（NSFC 81572063; NSFC 81601394）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ImmunoCAP 1000 仪器Thermo Fisher Scientific Inc.（Phadia AB，瑞典乌普萨拉）12-3800-01
Phadia 信息数据管理器软件包Thermo Fisher Scientific Inc.（Phadia AB，瑞典乌普萨拉）12-3801-11
软件包，ImmunoCAP 1000Thermo Fisher Scientific Inc.（Phadia AB，瑞典乌普萨拉）12-3801-12
g2
（百慕大草）		Thermo Fisher Scientific Inc.（Phadia AB， Uppsala Sweden）14-4131-01
g6
（Timothy grass）		Fisher Scientific Inc.（Phadia AB， Uppsala Sweden）14-4100-01
w22
（Japanese Hop）		Thermo Fisher Scientific Inc.（Phadia AB， Uppsala Sweden）14-4452-01
g216
（nCyn d 1）Thermo		Fisher Scientific Inc.（Phadia AB，瑞典乌普萨拉）14-4972-01
g205
（rPhl p 1）		Thermo Fisher Scientific Inc.（Phadia AB， Uppsala Sweden）14-5234-01
g208
（nPhl p 4）Thermo		Fisher Scientific Inc.（Phadia AB， Uppsala Sweden）14-5288-01
g215
（rPhl p 5b）Thermo		Fisher Scientific Inc.（Phadia AB， Uppsala Sweden）14-5338-01
g209
（rPhl p 6）		Thermo Fisher Scientific Inc.（Phadia AB， Uppsala Sweden）14-5289-01
g210
（rPhl p 7）Thermo		Fisher Scientific Inc.（Phadia AB， Uppsala Sweden）14-5290-01
g211
（rPhl p 11）		Thermo Fisher Scientific Inc.（Phadia AB， Uppsala Sweden）14-5291-01
g212
（rPhl p 12）		Thermo Fisher Scientific Inc.（Phadia AB， 瑞典乌普萨拉）14-5292-01
o214
交叉反应碳水化合物决定簇 （CCD）		Thermo Fisher Scientific Inc.（Phadia AB，瑞典乌普萨拉）14-5339-01
特异性 IgE 偶联物 400Thermo Fisher Scientific Inc.（Phadia AB，瑞典乌普萨拉）10-9310-08
特异性 IgE 校准试纸条Thermo Fisher Scientific Inc.（Phadia AB，瑞典乌普萨拉）10-9459-08
特异性 IgE 曲线对照条Thermo Fisher Scientific Inc.（Phadia AB，瑞典乌普萨拉）10-9312-08
特异性 IgE 抗 IgE ImmunoCAPThermo Fisher Scientific Inc.（Phadia AB，瑞典乌普萨拉）14-4417-01
ImmunoCAP 特异性 IgE 阴性对照Thermo Fisher Scientific Inc.（Phadia AB，瑞典乌普萨拉）10-9445-01
ImmunoCAP 特异性 IgE 对照品 LThermo Fisher Scientific Inc.（Phadia AB，瑞典乌普萨拉）10-9528-01
ImmunoCAP 特异性 IgE 对照品 MThermo Fisher Scientific Inc.（Phadia AB，瑞典乌普萨拉）10-9529-01
ImmunoCAP 特异性 IgE 对照品 HThermo Fisher Scientific Inc.（Phadia AB，瑞典乌普萨拉）10-9530-01
开发溶液Thermo Fisher Scientific Inc.（Phadia AB，瑞典乌普萨拉）10-9439-08
终止液Thermo Fisher Scientific Inc.（Phadia AB，瑞典乌普萨拉）34-2271-58
洗涤液Thermo Fisher Scientific Inc.（Phadia AB，瑞典乌普萨拉）10-9202-08
FluoroCThermoFisher Scientific Inc.（Phadia AB，瑞典乌普萨拉）10-9264-01
维护溶液套件Thermo Fisher Scientific Inc.（Phadia AB， Uppsala Sweden）10-9476-01
Thermo

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