本研究描述了一种采用组分解析方法的实验方案，用于研究中国南方一群过敏性鼻炎和/或哮喘患者对禾本科花粉过敏原的致敏情况。
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方法文章
针对中国南方过敏性鼻炎和/或哮喘患者进行禾本科花粉过敏原研究的组分解析诊断方法
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
对禾本科花粉致敏是导致过敏性气道疾病的一个全球性风险。尽管预防依赖于对花粉变应原的本地化调查，但中国南方地区关于此问题的数据十分有限。现有的数据多来自自填式问卷、皮肤点刺试验以及使用粗提物进行的总IgE或特异性IgE检测。由于多种原因，这些方法并不可靠。本研究采用全自动免疫分析仪作为组分解析诊断（CRD）工具，检测了来自大广州地区（中国南方最大城市及其周边地区）的一组过敏性鼻炎和/或哮喘患者血清中针对狗牙根草、梯牧草和Humulus scandens变应原的特异性IgE反应性。
首次发现，中国南方过敏性鼻炎和/或哮喘患者中对百慕大草花粉sIgE阳性率显著较高。在这些患者中，对梯牧草和Humulus scandens的致敏阳性率较低，这可能源于交叉反应，因为后两种草类在该地区并不常见。这一推论也得到了过敏原组分检测结果的支持。
全自动免疫分析仪可能在不同地区、实验室、机构之间以及随时间推移提供令人满意的检测一致性。该仪器的自动化特性可实现标准化检测，而在CRD出现之前，这种标准化检测难以轻易实现。
本研究采用成分解析诊断（CRD）方法，探讨中国南方地区对禾本科花粉过敏原的致敏情况，为现有文献证据提供了补充。未来仍需进一步研究以验证这些发现。然而，尽管CRD是一种有用的工具，但使用全自动免疫分析仪所得出的结果不应取代其他实验室检查、临床评估以及医生的专业判断。
引言
草本植物花粉导致近50%的免疫球蛋白E（IgE）相关过敏反应，由于其可通过空气传播，对全球范围内的过敏性气道疾病（尤其是哮喘和过敏性鼻炎）构成普遍风险1,2,3,4。某一地区预防草本花粉过敏依赖于当地花粉过敏原分布的信息。然而，致敏过敏原的谱型在不同地区之间存在差异，这一现象通常被称为区域特异性。
在中国这一广阔的东亚地区，由于过去几十年中来自该国南部地区的数据有限，草花粉致敏的地域特异性问题变得更加复杂5。数据的严重匮乏导致难以全面呈现这个大国草花粉致敏的整体情况6。此外，有关中国南方人群的极少量数据主要来源于自报问卷、皮肤点刺试验（而非实验室血清检测）、总IgE测定（而非过敏原特异性IgE（sIgE）），以及针对过敏原的sIgE检测（而非针对过敏原组分分子的检测）。
当涉及特定过敏原时，患者对过敏症状的自我报告可能并不可靠。皮肤点刺试验虽然广泛可用，但使用的是非标准化的粗制过敏原提取物，这些提取物本身可能含有其他致敏成分，从而干扰结果的解读。皮肤点刺试验的可靠性还高度依赖于过敏专科医生或专业护士的操作技巧、近期是否使用抗组胺药物以及患者的配合程度（对于年幼儿童有时极为困难）。总IgE水平有助于过敏的筛查，但无法准确判断患者体内具体的致敏过敏原。此外，几乎所有的过敏原都包含多种过敏原组分分子。对主要组分（即屋尘螨中的Der p 1和Der p 2）致敏可能提示存在"真正"的过敏（针对特定过敏原的过敏，而非因与其他过敏原发生交叉反应导致的假阳性），但对某些组分（即具有交叉反应性的Der p 10，一种原肌球蛋白）致敏则可能并非如此7。
在组分解析诊断（CRD）技术出现之前，这些令人失望的挫折阻碍了中国过敏原研究的进展。CRD利用重组或纯化的过敏原分子，精确检测过敏原的组分，从而使检测结果易于量化和表征8。在过去几十年中，过敏研究常使用粗制的过敏原提取物，而这些提取物不可避免地含有多种无关成分。其中许多成分为惰性物质，但偶尔某些成分可能导致干扰性的假阳性反应。CRD采用重组或纯化的过敏原分子，可避免此类问题，从而提高检测的准确性。当应用于微阵列技术时，CRD方法能够快速筛查或鉴定个体对数百种过敏原分子的致敏情况。目前，中国南方地区尚缺乏一项设计完善的关于草花粉致敏的CRD研究。理想的研究应涵盖具有较大地理代表性的本地人群，纳入中国常见报道的草花粉种类，并解决上述技术问题。为了达到具有实际意义的临床相关性，并便于血清样本的收集，早期针对吸入性草花粉过敏原的致敏性研究可集中于患有过敏性呼吸道疾病的患者，而非普通人群。
本研究描述了一种利用成分解析诊断（CRD）方法检测中国广州大都市区（中国南方最大城市及其郊区）过敏性鼻炎和/或哮喘患者血清中针对百慕大草、梯牧草和Humulus scandens的sIgE反应性的实验方法5。该研究关于中国南方地区对这些亚热带和温带草类花粉致敏性的发现，为现有文献提供了重要的补充证据。
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方案
研究方案（包括人血清样本的使用）已获得广州医科大学附属第一医院伦理委员会批准。所有参与者均提供了书面知情同意书，可由本人独立签署或 通过 其父母（针对儿童受试者）。该方案已在网络注册（中国临床试验注册中心，注册号：ChiCTR-DCC-13004003，参见 http://www.chictr.org/cn/）。
1. 研究人群的确定
注意：国家呼吸系统疾病临床医学研究中心过敏信息库（AIR-SKLRD）是患者招募的主要来源，因为AIR是中国南方记录最完整的大型过敏原检测患者数据库9,10。AIR已保存患者血清样本近十年。简言之，这些储存的样本此前通过采集静脉血5 mL，以3,000 × g离心10分钟，收集上清液制备而成。血清样本置于-80 °C冰箱中长期保存。符合患者纳入标准的样本可直接用于本研究中的所有检测。
- 从 AIR 数据库中检索 2013 年 1 月至 2015 年 6 月（预设研究期间）接受过草类过敏原特异性 IgE（sIgE）血清检测的过敏性鼻炎和/或哮喘患者的资料。
- 根据《过敏性鼻炎及其对哮喘的影响》（Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma, ARIA）11 和全球哮喘防治倡议（Global Initiative for Asthma, GINA）12 指南，筛选患有轻度至中度过敏性鼻炎和/或哮喘的患者，并将其指定为"研究组"。
- 排除病历资料不完整、失访、拒绝签署关于使用其血清样本用于科研目的知情同意书、已确诊免疫缺陷、正在接受免疫治疗或免疫调节药物治疗，或发现存在寄生虫感染的患者。
- 根据相同的排除标准，选择同期患有非呼吸道过敏（即湿疹、过敏性皮炎和食物过敏）的患者队列，并将其指定为"对照组"。
- 确保血清样本在任何处方或治疗开始前采集，以尽量减少对实验室检测结果的混杂影响；排除不符合此要求的任何血清样本。
- 确保所有受试者均为大广州地区（即出生地或在当地居住超过 10 年）的常住居民。
2. 研究流程与关注的测量指标
- 从生物样本库中提取符合条件的患者血清样本。检测过敏原/过敏原组分时，使用140 µL血清（包括用于填充死体积的100 µL）。
注意：本研究中每位患者所需的最大总血清量为：3种特异性过敏原和8种过敏原组分，sIgE检测共需140 µL × 11 = 1,540 µL。 - 使用该仪器时，首先检测血清样本中针对百慕大草、梯牧草和Humulus scandens完整过敏原的sIgE。操作请遵循第3节说明。
注意：选择这些花粉进行检测的原因是，百慕大草13,14,15和Humulus scandens16在中国已有广泛报道，而梯牧草17,18,19是一种分布于热带至温带环境的典型植物，在全球范围内研究最为充分。 - 其次，对步骤2.3中已确定对完整过敏原存在sIgE的血清样本，进一步检测其对百慕大草[Cyn d 1 (g216)]、梯牧草[Phlp 1 (g205)、Phl p 4 (g208)、Phl p 5 (g215)、Phl p 6 (g209)、Phl p 7 (g210)、Phl p 11 (g211)和Phl p 12 (g212)]以及交叉反应性碳水化合物决定簇[CCD (o214)]等过敏原组分的sIgE。操作请遵循第3节说明。
3. 使用免疫分析系统进行全自动测试程序
注意：变应原sIgE检测的整个过程是完全自动化的，具体步骤已在其他文献中描述7,8,9,10，并遵循制造商的操作说明。
- 启动全自动免疫分析仪（例如， ImmunoCAP1000）并用于整个研究过程中的免疫测定。打开内置的信息数据管理系统（IDM）计算机。
注意：免疫分析仪通常处于待机模式。 - 随着 "初级电源" 开启，打开 "系统电源" 等待3分钟，直到内置软件启动。单击 "加载冲洗液" 和 "加入洗涤液。"
- 向每个过敏原/过敏原组分检测的样品管中加入 140 µL 血清。用每位患者唯一的识别编号标记含有 140 µL 血清的每个样品管。
- 在 IDM 界面中，通过点击菜单执行以下步骤。
- 检查 "请求列表" 通过 IDM 窗口确保 "sIgE" 是首选的检测方法。
- 将样本管连同条形码一起放入样本架中，质控管连同条形码一起放入质控架中。
注意：每位患者最初计划检测3种特异性过敏原和8种过敏原组分的sIgE，共需346×11（3,806）个样本管。每个样本管均匹配3个质控管，分别含有低、中、高浓度的sIgE质控品（详见材料表）。最终仅对初筛试验（步骤2.3）结果呈阳性的58例患者进行复测（步骤2.3）。试管上样可通过计算机控制台自动设置。 - 选择 "加载试剂" 在 "检测处理" 屏幕。根据仪器要求，完成样本架和质控品架、显色液、结合物、校准品、载体、移液吸头、终止液及洗涤液的装载。 "加载列表" （参见 材料表 详情请参见）。
- 在 "加载并启动，" 按压 "好的。"
注意：测量结束后，结果将显示在 IDM 上。 - 从 IDM 界面中选择要导出的数据。单击 "菜单，" "批准" 和 "另存为" 并将sIgE检测结果导出为电子表格文件。
- 将电子表格文件导入统计软件（例如， SPSS10使用 SPSS 菜单中专门用于 Spearman 系数的模块，分析这些禾本科花粉（对完整变应原呈阳性的特异性 IgE）与花粉组分（对变应原分子呈阳性的特异性 IgE）之间致敏性的相关性。
4. sIgE 反应性的定义
注意：对于未稀释的血清样本，特异性 IgE 的检测范围为 0.35 至 100 kU/L。
- 用sIgE值稀释样本 >100 kU/L 时按1:5稀释并重新检测。若数值仍高于100 kU/L，则继续进行稀释，直至达到最高1,000 kU/L的终点水平。
- 根据0.35 kU/L的阈值，将sIgE水平超过0.35 kU/L视为阳性5,7,10. 将sIgE检测的反应性评级为：1级（≥0.35且＜0.70 kU/L）、2级（≥0.70且＜3.5 kU/L）、3级（≥3.5且＜17.5 kU/L）、4级（≥17.5且＜50 kU/L）、5级（≥50且＜100 kU/L）和6级（≥100 kU/L） <0.70 kU/L），2级（≥0.70 且 <3.50 kU/L），3类（≥3.50 且 <17.50 kU/L），4级（≥17.50 且 <50.00 kU/L），5级（≥50.00 且 <100.00 kU/L）以及6级（≥100.00 kU/L）。
5. 统计分析
- 使用统计软件（例如，SPSS）10分析数据。定量数据以均值和标准差表示，定性数据以中位数和四分位距（IQR）表示，分类数据以阳性结果的比例表示。
- 组间比例比较采用卡方检验，定量数据采用非配对t检验，定性数据采用秩和检验。
- 参数数据之间的相关性分析采用Pearson检验，相关系数表示为"r"；非参数数据采用Spearman检验，相关系数表示为"rs"。当P值<0.05时，认为差异具有统计学意义。
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结果
本研究中使用的全自动免疫分析仪具有固相结构，其表面共价结合了过敏原或过敏原组分，可与患者血清样本中的目标分子（sIgE）发生反应。仪器通过自动程序使用150 µL冲洗液洗去所有非特异性IgE，并重复此步骤5次。随后加入酶标记的抗IgE抗体（50 µL）以形成复合物。该酶标记抗IgE抗体（偶联物）为可结合特异性IgE的二抗。未结合的抗IgE抗体通过150 µL洗涤液洗涤去除（重复3次）。结合形成的复合物在37 °C条件下与显色剂（50 µL）反应9分钟。显色剂是一种酶解试剂，可切断所有已结合的抗IgE抗体，后者在碱性条件下发出荧光。反应通过加入碱性终止液终止。随后，仪器压缩固相结构以挤出洗脱液，并在470 nm波长下测定所得洗脱液的荧光强度。荧光强度与洗脱液中目标分析物分子的绝对含量呈线性相关。荧光值越高，表明血清样本中sIgE含量越多。为解读检测结果，系统会自动利用校准曲线将样本的响应信号转换为浓度值。测量数据被电子传输至IDM软件，该软件集成了分析结果计算、统计分析及报告生成等功能。
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讨论
全自动免疫分析仪在不同地区、实验室和机构之间以及随时间变化可能提供令人满意的检测一致性。这种自动化流程已被证实能显著支持基础研究和临床研究，实现对多种过敏原和/或过敏原组分的标准化检测，并识别出在组分解析诊断（CRD）出现之前难以发现的潜在过敏原交叉反应性。此外，整个检测过程可在严格的质控条件下完成，满足大范围地理区域调查所需的高通量检测方法。尽管检测过程主要由计算机控制运行，但仍需注意若干关键问题。必须严格按照用户手册操作仪器，任何偏差都可能导致不必要的检测错误、机械损坏，或因激光束或高电压引发的人身伤害。务必确保系统中已存储正确且适当的校准曲线，因为这直接关系到检测结果的准确性。若未存储，则应在血清样本检测前先测定特定校准品的sIgE浓度，随后系统可自动计算并存储校准曲线以供后续使用。与其他实验室技术一样，还必须重视人血清操作的安全性，以保护技术人员免受感染，并防止环境污染。
在中国南方广州市，本研究首次采用全自动免疫分析仪作为成分解析诊断（CRD）方法，发现过敏性鼻炎和/或哮喘患者中 Bermuda 草花粉特异性IgE阳性率较高（22.5%）。由于梯牧草和Humulu...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢苏跃明在准备图示方面提供的帮助。本研究由广东省科学技术基金（项目编号：2014A020212352）资助， 广州市教育局（1201630044；1201630393）和国家自然科学基金委员会（NSFC 81572063；NSFC 81601394）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ImmunoCAP 1000 仪器 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 12-3800-01 | |
| Phadia 信息数据管理软件包 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 12-3801-11 | |
| ImmunoCAP 1000 软件包 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 12-3801-12 | |
| g2 （百慕大草） | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4131-01 | |
| g6 （梯牧草） | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4100-01 | |
| w22 （葎草） | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4452-01 | |
| g216 （nCyn d 1） | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4972-01 | |
| g205 （rPhl p 1） | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5234-01 | |
| g208 （nPhl p 4） | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5288-01 | |
| g215 （rPhl p 5b） | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5338-01 | |
| g209 （rPhl p 6） | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5289-01 | |
| g210 （rPhl p 7） | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5290-01 | |
| g211 （rPhl p 11） | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5291-01 | |
| g212 （rPhl p 12） | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5292-01 | |
| o214 交叉反应性碳水化合物决定簇（CCDs） | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-5339-01 | |
| 特异性 IgE 结合物 400 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9310-08 | |
| 特异性 IgE 校准条带 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9459-08 | |
| 特异性 IgE 曲线对照条带 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9312-08 | |
| 特异性 IgE 抗-IgE ImmunoCAP | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 14-4417-01 | |
| ImmunoCAP 特异性 IgE 阴性对照 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9445-01 | |
| ImmunoCAP 特异性 IgE 低值对照 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9528-01 | |
| ImmunoCAP 特异性 IgE 中值对照 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9529-01 | |
| ImmunoCAP 特异性 IgE 高值对照 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9530-01 | |
| 显色液 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9439-08 | |
| 终止液 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 34-2271-58 | |
| 洗涤液 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9202-08 | |
| FluoroC | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9264-01 | |
| 维护溶液试剂盒 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden) | 10-9476-01 |
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