用于电生理研究的小鼠短轴心室心脏切片

摘要

在此，我们描述了成年小鼠心室切片的制备方法及其在尖电极动作电位记录中的应用。这些多细胞制备物提供了结构完整的 体内 类似组织的结构，使其成为电生理学和药理学研究的有价值模型 体外.

摘要

小鼠心肌细胞已被广泛用于 体外 心脏生理学研究及新治疗策略。然而，分离的心肌细胞多细胞样本并不能代表复杂的 体内 心肌细胞、非肌细胞及细胞外基质的结构，这些结构影响心脏的机械和电生理特性。本文介绍一种制备成年小鼠心脏存活心室切片的技术，该切片可保持原有的 体内 类似组织结构，并证明其适用于电生理记录。心脏切除后，心室与心房分离，用 Ca²⁺不含2,3-丁二酮单肟的溶液，并包埋于4% 低熔点 琼脂糖块。将该琼脂糖块置于带有振动刀片的切片机上，调整刀片振动频率为60–70 Hz，并以尽可能缓慢的速度推进刀片，制备厚度为150–400 µm的组织切片。切片厚度取决于后续应用。切片保存于冰冻的Tyrode溶液中，其中含0.9 mM Ca²⁺ 以及2,3-丁二酮单肟（BDM）中孵育30分钟。随后将组织片转移至37 °C的DMEM培养基中孵育30分钟，以洗去BDM。组织片可用于锋电极或微电极阵列的电生理研究、心肌收缩功能的力学测量，或用于研究移植的干细胞来源心肌细胞与宿主组织之间的相互作用。进行锋电极记录时，将一片组织置于倒置显微镜加热板上的3 cm细胞培养皿中，通过单极电极刺激组织，同时使用锋利的玻璃微电极记录组织片内心肌细胞的细胞内动作电位。

引言

自1966年Yamamot和Mcllwain证明脑组织切片的电活动可在体外（in vitro）维持以来，薄组织切片已广泛应用于基础科学研究¹。此后，研究人员已在来自脑²、肝³、肺⁴和心肌组织^5,6,7的切片上开展电生理学和药理学研究。1990年首次报道了对新生大鼠心脏心室切片进行的膜片钳记录⁸，但该技术一度被弃用。十余年之后，我们课题组建立了一种制备小鼠胚胎期⁹、新生期¹⁰和成年期¹¹心脏切片的新方法。这些具有活性的组织切片可用于急性实验（成年切片可培养数小时）或短期培养实验（胚胎期和新生期切片可培养数天）。通过锐利微电极动作电位记录和微电极阵列检测发现，这些切片表现出类似体内（in vivo）的电生理特性，并具有均匀的兴奋传导¹¹。由于其"二维"结构形态，记录电极可直接接触心室所有区域，使其成为电生理研究的有力工具，并相较于Langendorff灌流的整体心脏提供了新的实验可能性。切片对离子通道阻滞剂的药物反应，如维拉帕米（L型Ca²⁺通道阻滞剂）、利多卡因（Na⁺通道阻滞剂）、4-氨基吡啶（非选择性电压依赖性K⁺通道阻滞剂）和林诺吡啶（KCNQ K⁺通道阻滞剂）^9,11，与已知的分离心肌细胞反应一致。等长收缩力测量显示存在正性频率-收缩力关系，并强烈提示其收缩功能保持完整¹⁰。这些结果表明，小鼠心室切片可作为生理学和药理学研究的体外（in vitro）组织模型。此外，受体心脏的心室切片结合锐利微电极记录已被证实为一种非常有用的工具，可用于表征移植胎儿^12,13,14和干细胞来源¹⁵心肌细胞的电整合、机械整合及成熟过程。

总之，心室切片是一种有价值且成熟的多细胞组织模型，在心血管研究中应被视为离体心肌细胞和Langendorff灌流心脏模型的补充。其主要优势在于既能提供类似in vivo的组织结构（与离体细胞相比），又能使测量技术（如尖锐电极记录）直接接触心脏各个区域（与完整心脏制备相比）。

方案

动物操作必须符合当地动物福利委员会的指南以及欧洲议会的2010/63/EU指令。

1. 准备溶液

1. 制备无 Ca²⁺ 的 Tyrode 溶液（成分单位为 mM）：NaCl 136、KCl 5.4、NaH₂PO₄ 0.33、MgCl₂ 1、葡萄糖 10、HEPES 5、2,3-丁二酮单肟（BDM）30。在 4 °C 下用 NaOH 调节 pH 至 7.4。
2. 制备含 Ca²⁺ 的 Tyrode 溶液（成分单位为 mM）：NaCl 136、KCl 5.4、NaH₂PO₄ 0.33、MgCl₂ 1、葡萄糖 10、HEPES 5、BDM 30、CaCl₂ 0.9。在 4 °C 下用 NaOH 调节 pH 至 7.4。
3. 制备 4% 低熔点琼脂糖：将 0.6 g 低熔点琼脂糖加入 15 mL 无 Ca²⁺ 的 Tyrode 溶液中。在微波炉中以 750 W 功率加热两次，每次 10–15 秒，直至琼脂糖完全溶解。将溶液保持在 37 °C 恒温，并持续搅拌。
4. 将无血清的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）在 37 °C 下用碳氧混合气（5% CO₂、95% O₂）持续通气维持。

2. 准备切片机

1. 打开切片机。
2. 将冰填入切片机的外室。
3. 用冰冷的无钙台罗德液填充切片机内腔²⁺ 并用100%氧气持续充氧溶液₂.
4. 将钢制刀片放入切片机的刀片架中。

3. 小鼠心脏分离

1. 皮下注射 2,500 U 肝素。等待 15 分钟。
2. 通过颈椎脱位处死动物。
3. 通过胸骨切开术打开胸腔。
4. 使用小型剪刀和5号镊子仔细解剖心包膜。
5. 将套管插入升主动脉并灌注冠状动脉 原位 用不含钙的冰冷Tyrode溶液²⁺ 直至残留血液被完全清除。
6. 用镊子和剪刀小心地切除心脏，并将心脏转移至不含钙的冰冻台氏液中²⁺.
7. 用手术刀或剪刀将心房与心室分离。

4. 使用4%低熔点琼脂糖包埋心室

1. 将心室尖端朝上放置于琼脂糖模具中（图1）。将针头插入模具中央的左心室腔内。
2. 用37 °C的4%低熔点琼脂糖填充模具，直至完全覆盖心脏组织。
3. 将模具置于冰上，以加快琼脂糖凝固，防止组织漂浮。
4. 用解剖刀将含有心室的琼脂糖块从模具中取出。
5. 将琼脂糖块倒置，使用带有20 G针头的注射器，向心室腔及模具针头留下的背面空隙中填充4%低熔点琼脂糖。
6. 用解剖刀修整琼脂糖块，使其底部平整，并确保心尖垂直向上。

5. 心室组织切片

1. 用一滴氰基丙烯酸酯胶水将组织块固定在切片机的样品夹持器上，使心尖朝上。
2. 将样本架放入切片机的内样本室中，内样本室已充满无钙的冰冻Tyrode液²⁺用 Tyrode 溶液完全浸没琼脂糖块。
3. 根据后续应用需求制备150-400 µm厚度的短轴切片（用于尖电极记录时为150-200 µm），将刀片振动频率保持在60-70 Hz，并以尽可能慢的速度向前推进刀片。
4. 使用细毛刷小心地将琼脂糖从切片上彻底清除。
5. 用巴斯德移液管将切片轻柔转移至含有 0.9 mM Ca 的台罗德液中²⁺ 以100% O₂通气₂ 并在冰上保存至少30分钟，以使组织从切片过程中恢复。
6. 随后，将脑片置于37 °C、通入碳氧混合气（carbogen）的DMEM中孵育30分钟，以洗去BDM，再进行后续实验。

6. 准备尖端电极装置

1. 预热时，在开始记录前30分钟打开所有电子设备。
2. 将一个3 cm的细胞培养皿放置在倒置显微镜上的加热板上。
3. 将定制的环形电极（图2）放入培养皿中，并连接前置放大器和刺激电极的接地线。
4. 将灌流系统的柔性管路连接到培养皿上。
5. 用经碳氧混合气（carbogen）饱和的DMEM填充灌流系统的储液罐。
6. 启动灌流泵，并将灌流速度设定为2–3 mL/min。
7. 通过调节流路加热器和加热板，将培养皿中DMEM的温度调整至37 °C。

7. 动作电位记录

1. 将心室切片放入盛有DMEM的培养皿中。
2. 使用倒置显微镜检查组织的结构完整性和活性（基于收缩功能）。
3. 用3 M KCl填充记录玻璃电极。
4. 用DMEM填充刺激电极。
5. 将记录电极和刺激电极安装到电极夹持器上。
6. 小心地将刺激电极放置在切片上，并打开电刺激器。起始刺激频率设为1-2 Hz。
7. 使用显微操作器将记录电极移至目标记录位置上方。
8. 缓慢降低记录电极，直至其尖端接触组织。
9. 通过记录电极施加一个短暂的矩形电脉冲，以穿透细胞膜。
10. 仔细调整记录电极的位置，直至获得稳定的信号。
11. 开始记录动作电位。

结果

心肌梗死会导致心肌细胞几乎不可逆的丧失。利用干细胞衍生的心肌细胞进行外源性心脏再生的细胞替代疗法是一种有前景的治疗策略。移植细胞的电整合与成熟对于细胞替代疗法的安全性和有效性至关重要。

为评估细胞整合与成熟情况，我们将表达增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的诱导多能干细胞来源心肌细胞（iPSCM；每次注射0.5 × 10⁶个iPSCM/10 µL，共注射两次）移植到成年小鼠的健康心脏中（详见Peinkofer et al. 对实验方法的详细描述¹⁵）。移植后第六天，按照所述方案制备受体心脏的室壁切片。典型的记录结果如图3所示。将含有移植iPSCM的切片置于37 °C的DMEM培养基中，并通过置于宿主组织中的单极电极进行局部刺激（图3A，左图）。使用充满...

讨论

心室切片可实现电生理学、药理学和机械研究，同时保持组织结构的完整性 体内 如组织结构以及测量技术对心脏所有区域的直接可及性。已在胚胎期、新生期和成年期的心脏切片中证实了生理性的动作电位特性。 ^9,10,11除切片操作直接损伤的表面层外，其余组织的活性已通过活性染色得到证实 ⁹使用锐利的玻璃电极在脑片中记录动作电位，可用于研究移植心肌细胞的整合与成熟情况（如本文所述），或在添加心脏活性化合物后进行药理学研究。可在单个细胞中实现持续一小时或更长时间的长时程记录。该记录时长足以通过依次灌注和洗脱不同药理学化合物，来检测其对同一细胞的作用效果。

关键制备步骤

为优化切片质量，应避免缺血性组织损伤。因此，需对心脏进行灌注 原位 用Tyrode溶液进行灌注时，快速切除心脏并立即...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Leica VT 1000s	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany		带振动刀片的切片机。
不锈钢刀片	Campden Instruments, Loughborough, England	7550-1-SS
巴斯德移液管	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	Z627992
细毛刷，例如 6号（4/32"）	VWR, International, Radnor, USA	149-2125
制作用于琼脂糖包埋心室的准备台			自制
用于在琼脂糖中包埋心室的模具			自制
1 mL 注射器	Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA	300013
27 G × 3/4`` 针头	Braun, Melsungen, Germany	4657705
20 G 11/2`` 针头	4657519
小型剪刀	WPI, Sarasota, USA	501263
#5 镊子，尖端尺寸 0.1 × 0.06 mm	WPI, Sarasota, USA	500342
氧气（医用级 O2）	Linde, Munich, Germany
碳酰气（95% O2，5% CO2）	Linde, Munich, Germany
NaCl	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	7647-14-5
KCl	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	746436
CaCl2	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	746495
KH2PO4	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	NIST200B
HEPES	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	51558
NaHCO3	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	S5761
D(+)-葡萄糖	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	G8270
MgSO4	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	M7506
NaOH	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	S8045
氰基丙烯酸酯胶水	Henkel, Düsseldorf, Germany
低熔点琼脂糖	Roth, Karlsruhe, Germany	6351.2
肝素钠-25000 I.E./5 mL	Ratiopharm, Ulm, Germany
DMEM高糖培养基（含GlutaMAX）	ThermoScientific, Waltham, USA	10566016
SEC-10LX 放大器	npi electronic GmbH, Tamm, Germany	SEC-10LX
EPC 9	HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany
Zeiss Axiovert 200	Zeiss, Oberkochen, Germany
低倍镜用显微操作仪	Narashige, Tokyo, Japan	Nm-3
高倍镜用三轴显微操作仪	Narashige, Tokyo, Japan	MHW-3
蠕动灌流泵	Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	PPS2
双通道温度控制器	Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany	TCO02
方波刺激器	Natus Europe GmbH, Planegg, Germany	Grass SD9
玻璃毛细管	WPI, Sarasota, USA	1B150F-1