小肠依赖性的胆汁酸重吸收及其对肝脏胆汁酸合成的反馈抑制作用，对于机体系统稳态和健康至关重要。在本研究中，我们描述了一种用于回肠切除的小鼠模型，以评估回肠切除所引起的胆汁酸吸收不良、过度蓄积及其在小鼠肠道中的毒性作用。
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摘要
摘要
肠道切除术是治疗肥胖、炎症性肠病、克罗恩病和结肠癌等人类疾病的常用疗法，但常导致严重的类似短肠综合征的不良反应，包括胆汁酸性腹泻、脱水、电解质紊乱和营养吸收不良。本文介绍一种小鼠回肠切除模型，称为回肠切除术（ileectomy），用于评估组织间通讯及全身稳态的维持机制。回肠切除后，循环血液中将永久缺乏回肠特异性的内分泌激素成纤维细胞生长因子15（FGF15），从而解除其对肝脏中胆汁酸合成的内分泌抑制作用。结合回肠切除后胆汁酸生成增加以及重吸收功能丧失，手术小鼠会出现胆盐在肠道内过度积聚，并伴随腹泻、发病和死亡。本研究中所介绍的手术模型的新应用，可能为回肠在生理与疾病状态下对全身代谢调控的机制和功能提供新的见解。
引言
在现代生物医学研究中，基因改造动物模型被广泛用于揭示人类疾病的机制。特别是，基因的组织或细胞特异性功能获得与功能缺失已被用于研究分子调控机制以及诱导产生的生物学效应。尽管在靶基因操作技术方面已取得显著进展 体内，仍存在一些局限性。首先，许多细胞或组织特异性的基因删除会影响多个器官。例如，上皮细胞基因的删除将导致多种组织上皮中该基因表达的丧失。此外，即使基因删除局限于特定组织，也很难实现空间上的精确控制。例如，在肠道这类组织中，不同节段具有高度特异的功能，而目前难以对其进行精确调控 体内在这些情况下，切除含该基因的组织被认为是研究组织间通讯机制和功能意义的更有效方法。
回肠切除术主要用于累及回肠远端的克罗恩病和炎症性疾病患者1,2,3。回肠通常产生多种能量代谢相关激素，如成纤维细胞生长因子15/19（FGF15/19）、肽YY（PYY）以及胰高血糖素样肽1/2（GLP1/2）；这些激素在多种生物学功能中发挥重要的局部和内分泌作用4,5,6。其中，FGF15被确认为肝脏胆汁酸合成的强效内分泌抑制因子。胆汁酸被回肠肠上皮细胞重吸收后，可激活核受体法尼醇X受体（FXR），从而促进Fgf15的表达，继而反馈性抑制肝脏胆汁酸的合成7。在最近的一项研究中，我们引入了小鼠回肠切除模型，用于研究调控肝脏胆汁酸昼夜节律性生成的回肠Kruppel样因子15（KLF15）-Fgf15信号轴8。尤为重要的是，我们将Kruppel样因子这一转录因子家族，特别是KLF15，首次引入胆汁酸生物学领域。通过包括回肠切除术在内的功能研究，我们确定KLF15通过一种非肝脏来源的间接机制上调胆汁酸的合成。最终，回肠KLF15也被确认为Fgf15首个内源性的负调控因子。
从近端到远端的肠段负责吸收不同的营养物质。回肠是吸收胆汁酸和维生素B12（VB12）的主要肠段9。早期一项研究采用小鼠近端肠道切除模型来研究短肠综合征，提出了不同的切除长度、饮食方案和缝合类型，以维持术后最佳存活率10。此外，最近的一篇综述指出，由于残余肠道的适应能力降低，回肠切除通常比其他胃肠道（GI）节段切除导致更严重的疾病11。这一课题已引起基础与临床研究团队的广泛关注，但对恢复机制的理解以及有效的治疗策略仍十分有限。
胆汁酸性腹泻是由于肠肝循环中胆汁酸稳态失衡所致12,13。该病症可继发于回肠切除术、胃肠道疾病，或特发性胆汁酸吸收不良。研究发现，超过80%的患者在接受回肠切除术后会出现腹泻症状14。回肠切除术可作为研究胆汁酸性腹泻的重要手术模型。本研究通过一系列不同程度的回肠切除，对FGF15缺乏以及肠道胆盐吸收不良、过度蓄积和毒性损伤进行梯度评估。
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方案
动物实验方案经凯斯西储大学医学院机构动物护理和使用委员会审查并批准，并依照美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》（第8版，2011年）进行。小鼠的安乐死方法符合美国兽医医学协会（AVMA）《动物安乐死指南》（2013年版）的要求。本实验使用C57BL/6J品系雄性小鼠，年龄为8至16周。小鼠饲养于12小时明暗循环环境中。
1. 术前准备
- 手术前24小时将小鼠转移至清洁的笼子中，自由饮水。术前4-6小时将普通饲料替换为软质食物（凝胶饮食补充剂），以减少小肠内容物，便于手术操作。
- 对所有手术器械进行灭菌，并准备一次性无菌手术材料。使用70%乙醇清洁手术区域及麻醉面罩。
- 准备解剖显微镜、异氟烷麻醉蒸发器、手术器械以及可调控温度的小动物手术台，以维持动物体温。将手术器械、缝线和注射器有序摆放，确保术中取用方便。
- 设置光源，为手术区域提供充足的照明。
- 准备含有5 mL无菌0.9%生理盐水的注射器，用于肠道及腹腔冲洗。
2. 回肠切除术与吻合术
- 将小鼠置于小型动物麻醉舱中，使用异氟烷（2 - 3%）进行麻醉。在异氟烷维持麻醉状态下，通过脚趾夹捏法判断麻醉是否充分。
- 使用脱毛剂去除腹部毛发，并用外科海绵擦拭清除毛发，同时维持麻醉状态。将小鼠置于温控小型动物手术台（图1A）上，以维持体温在37 °C。通过面罩持续给予异氟烷（1 - 2%）维持麻醉。用眼用软膏处理小鼠眼睛。
- 使用聚维酮碘和70%酒精清洁皮肤，并用无菌外科纱布覆盖腹部手术区域（图1B）。
- 麻醉生效后，使用外科手术刀沿腹中线做切口。用棉签保护肠道，并用牵开器拉开小鼠腹肌，充分打开并暴露腹腔（图1C）。
- 定位盲肠。从盲肠开始，小心地将相连的回肠及部分空肠移出腹腔（图1D）。
注：即使经过禁食处理，盲肠因体积较大仍易于识别。 - 使用7-0丝线结扎肠系膜上动脉的上支，以阻断拟切除回肠段的血液供应。结扎后，回肠颜色由粉红色变为深紫色（图1E - F）。
- 根据实验目的，使用剪刀切除并移除50%或90%的回肠。
注：假手术组不进行肠系膜上动脉结扎，也不切除回肠。 - 用0.9%生理盐水冲洗两段回肠断端的管腔。
注：由于残留的完整回肠仍由肠系膜上动脉正常供血，冲洗过程中会有少量血液流出。这也表明回肠断端血供正常，可确保吻合过程中无缺血发生（图1G）。 - 定位两段回肠断端系膜侧的肠系膜。对齐系膜后，使用8-0缝线将回肠断端缝合在一起（图1G - H）。
- 缝合回肠对侧，以使回肠吻合保持自然状态（图1I）。
- 在原有两针缝线之间缝合上下两侧，彻底将两段回肠断端连接在一起（图1J）。
- 完成三步缝合后，确认吻合口无渗漏（图1G-I）。将盲肠和小肠复位至腹腔内的原始解剖位置。使用钝针以温热的0.9%生理盐水冲洗手术区域（图1K）。
- 使用6-0缝线缝合腹肌层切口。用镊子对齐腹部皮肤切口，并缝合皮肤以促进最佳伤口愈合（图1L）。
3. 术后护理
- 将术后小鼠转移至重症监护室进行恢复。将它们饲养在铺有纸垫料的笼子中，并置于温度可控的加热垫上，继续过夜术后恢复。除常规食物和水外，还需为小鼠提供软质食物。
- 通过皮下注射给予布托啡诺（0.05 - 0.1 mg/kg），每8-12小时一次，用于镇痛。
注意：若小鼠病情严重，应使用CO2实施安乐死。 - 在实验终点时，使用过量异氟烷处死小鼠，并根据需要采集样本（第4节）。
4. 回肠切除术诱导的胆汁过度积聚的评估
- 在切除小鼠0%（假手术）、50%或90%回肠后一天，称重并解剖小鼠。
- 取出胃肠道组织并称重，计算胃肠道重量与体重的比值，以评估胆盐吸收不良及过度积聚的严重程度。
- 将胃肠道组织转移至15 mL圆锥形离心管中，用剪刀剪成短段。剪切后，以3,000 × g离心10分钟，将上清液（含胆盐的胃肠道液体）转移至洁净的离心管中。
- 测量胃肠道液体的总体积和重量，并计算液体重量与胃肠道组织重量的比值，进一步评估胃肠道内胆盐的过度积聚情况。
- 通过胆酸测定法测定上清液中总胆汁酸含量，具体方法见参考文献8。
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结果
回肠切除术的操作步骤如图1所示。第一步包括准备小鼠腹部皮肤，做腹部切口，并使用拉钩充分暴露肠管（图1A-C）。接着定位小鼠盲肠（图1D），由于其大小和形状明显，易于识别。将盲肠、回肠及部分远端空肠从腹腔中暴露并移出（图1D）。确定需切除的回肠节段后，结扎供应该节段的肠系膜上动脉，回肠节段颜色迅速变为深紫色（图1E - F），而其余肠段仍保持正常的粉红色。随后完全切除整个缺血的回肠节段，并用0.9%生理盐水冲洗断端（图1G）。然后通过三步缝合法将两回肠断...
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讨论
为了成功实施回肠切除术，必须预先结扎肠系膜上动脉，以阻断待切除肠段的血液供应。结扎后，缺血的回肠段会变为深紫色。随后必须完全切除该回肠段，并确保保留的肠管断端具有正常的血液供应。这是避免术中出血和切除不当的关键，否则容易因吻合后发生缺血性坏死而导致手术失败。在进行吻合时，必须将回肠断端按其自然解剖位置对接。肠系膜被认为是初始缝合最可靠的解剖标志，可避免断端扭曲。在回肠断端对侧完成第二针缝合后，两个断端应根据其自然解剖结构准确对位。肠管吻合完成后，必须检查吻合区域的颜色，该区域通常呈现正常的粉红色。若术后吻合区域变为紫色，则缝合区域可能发生了缺血，原因可能是缺血肠段未完全切除，或在缝合过程中两断端发生扭转。在此情况下，必须立即纠正手术操作。
回肠切除术的主要并发症包括胆汁酸吸收不良引起的毒性、术后肠梗阻以及吻合口漏。与其他肠段相比，回肠具有多种结构和功能上的特异性，这些特性较难由肠道其他部分代偿。与年轻小鼠相比，相同的回肠切除术可能对年老小鼠造成更严重的损伤，这可能是因为年老小鼠产生的胆汁更多。例如，我们注意到16周龄小鼠的胆汁蓄积程度高于8周龄小鼠。性别差异是否影响回肠切除术所致的...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由汤姆·彼得森基金会和美国国立卫生研究院资助项目R01-HL119780（Jain, MK）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 解剖显微镜 | Olympus | SZ61 | 用于手术 |
| 动物体温控制器 | Physitemp Instruments, Inc. | TCAT-2LV | 用于体温控制 |
| 异氟烷麻醉蒸发器 | VetEquip | 911104 | 用于麻醉 |
| 解剖镊 | Fine Science Tools, Inc. | 11274-20 | 用于手术 |
| 剪刀 | Fine Science Tools, Inc. | 14084-08 | 用于手术 |
| 持针器 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-7882 | 用于手术 |
| 微型刀具-针状刀片 | Fisher Scientific | 10318-14 | 用于手术 |
| 6-0 单股缝合线 | Ethicon | 1698G | 用于腹部皮肤闭合 |
| 7-0 丝线缝合线 | Ethicon | 766G | 用于结扎 |
| 8-0 单股缝合线 | Ethicon | 1714G | 用于吻合 |
| 外科棉垫 | Dynarex Corp. | 3333 | 用于手术 |
| 小型棉签 | Fisher Scientific | 23-400-118 | 用于手术 |
| 异氟烷 | Piramal Healthcare Limited | 66794-013-25 | 用于麻醉 |
| 盐酸丁丙诺啡 | Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals | 12496-0757-1 | 用于镇痛 |
| 0.9% 氯化钠注射液 | B. Braun Medical Inc. | 0264-7800-10 | 用于冲洗/注射 |
| 聚维酮碘术前溶液 | Dynarex Corp. | 1413 | 用于皮肤准备 |
| Puralube vet 软膏 | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | 用于眼部保护 |
| 脱毛乳液 | Church & Dwight Co., Inc. | 用于皮肤准备 | |
| 重症监护单元 | ThermoCare | FW-1 | 用于术后恢复 |
| DietGel 恢复凝胶 | ClearH2O | 72-06-5022 | 用于术后恢复 |
| Aurum 总RNA脂肪与纤维组织试剂盒 | Bio-Rad | 7326830 | 用于RNA提取 |
| iScript 反转录超级混合液（用于RT-qPCR） | Bio-Rad | 1708841 | 用于反转录实验 |
| TaqMan Fast Advanced 主混合液 | Applied Biosystems/Life Technologies | 4444965 | 用于QPCR分析 |
| 总胆汁酸检测试剂盒 | Genzyme Diagnostic | DZ042A-K01 | 用于胆汁酸检测 |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory |
参考文献
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