小肠依赖性的胆汁酸重吸收及其对肝脏胆汁酸合成的反馈抑制作用，对于机体系统稳态和健康至关重要。在本研究中，我们描述了一种用于回肠切除的小鼠模型，以评估回肠切除所引起的胆汁酸吸收不良、过度蓄积及其在小鼠肠道中的毒性作用。
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摘要
摘要
肠道切除术是治疗肥胖、炎症性肠病、克罗恩病和结肠癌等人类疾病的常用疗法，但常导致严重的类似短肠综合征的不良反应，包括胆汁酸性腹泻、脱水、电解质紊乱和营养吸收不良。本文介绍一种小鼠回肠切除模型，称为回肠切除术（ileectomy），用于评估组织间通讯及全身稳态的维持机制。回肠切除后，循环血液中将永久缺乏回肠特异性的内分泌激素成纤维细胞生长因子15（FGF15），从而解除其对肝脏中胆汁酸合成的内分泌抑制作用。结合回肠切除后胆汁酸生成增加以及重吸收功能丧失，手术小鼠会出现胆盐在肠道内过度积聚，并伴随腹泻、发病和死亡。本研究中所介绍的手术模型的新应用，可能为回肠在生理与疾病状态下对全身代谢调控的机制和功能提供新的见解。
引言
在现代生物医学研究中，基因改造动物模型被广泛用于揭示人类疾病的机制。特别是，基因的组织或细胞特异性功能获得与功能缺失已被用于研究分子调控机制以及诱导产生的生物学效应。尽管在靶基因操作技术方面已取得显著进展 体内，仍存在一些局限性。首先，许多细胞或组织特异性的基因删除会影响多个器官。例如，上皮细胞基因的删除将导致多种组织上皮中该基因表达的丧失。此外，即使基因删除局限于特定组织，也很难实现空间上的精确控制。例如，在肠道这类组织中，不同节段具有高度特异的功能，而目前难以对其进行精确调控 体内在这些情况下，切除含该基因的组织被认为是研究组织间通讯机制和功能意义的更有效方法。
回肠切除术主要用于累及回肠远端的克罗恩病和炎症性疾病患者1,2,3。回肠通常产生多种能量代谢相关激素，如成纤维细胞生长因子15/19（FGF15/19）、肽YY（PYY）以及胰高血糖素样肽1/2（GLP1/2）；这些激素在多种生物学功能中发挥重要的局部和内分泌作用4,5,6。其中，FGF15被确认为肝脏胆汁酸....
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方案
动物实验方案经凯斯西储大学医学院机构动物护理和使用委员会审查并批准，并依照美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》（第8版，2011年）进行。小鼠的安乐死方法符合美国兽医医学协会（AVMA）《动物安乐死指南》（2013年版）的要求。本实验使用C57BL/6J品系雄性小鼠，年龄为8至16周。小鼠饲养于12小时明暗循环环境中。
1. 术前准备
- 手术前24小时将小鼠转移至清洁的笼子中，自由饮水。术前4-6小时将普通饲料替换为软质食物（凝胶饮食补充剂），以减少小肠内容物，便于手术操作。
- 对所有手术器械进行灭菌，并准备一次性无菌手术材料。使用70%乙醇清洁手术区域及麻醉面罩。
- 准备解剖显微镜、异氟烷麻醉蒸发器、手术器械以及可调控温度的小动物手术台，以维持动物体温。将手术器械、缝线和注射器有序摆放，确保术中取用方便。
- 设置光源，为手术区域提供充足的照明。
- 准备含有5 mL无菌0.9%生理盐水的注射器，用于肠道及腹腔冲洗。
2. 回肠切除术与吻合术
- 将小鼠置于小型动物麻醉舱中，使用异氟烷（2 - 3%）进行麻醉。在异氟烷维持麻醉状态下，通过脚趾夹捏法判断麻醉是否充分。
- 使用脱毛剂去除腹部毛发，并用外科海绵擦拭清除毛发，同时维持麻醉状态。将小鼠置于温控小型动物手术....
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结果
回肠切除术的操作步骤如图1所示。第一步包括准备小鼠腹部皮肤，做腹部切口，并使用拉钩充分暴露肠管（图1A-C）。接着定位小鼠盲肠（图1D），由于其大小和形状明显，易于识别。将盲肠、回肠及部分远端空肠从腹腔中暴露并移出（图1D）。确定需切除的回肠节段后，结扎供应该节段的肠系膜上动脉，回肠节段颜色迅速变为深紫色（图1E - F），而其余肠段仍保持正常的粉红色。随后完全切除整个缺血的回肠节段，并用0.9%生理盐水冲洗断端（图1G）。然后通过三步缝合法将两回肠断.......
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讨论
为了成功实施回肠切除术，必须预先结扎肠系膜上动脉，以阻断待切除肠段的血液供应。结扎后，缺血的回肠段会变为深紫色。随后必须完全切除该回肠段，并确保保留的肠管断端具有正常的血液供应。这是避免术中出血和切除不当的关键，否则容易因吻合后发生缺血性坏死而导致手术失败。在进行吻合时，必须将回肠断端按其自然解剖位置对接。肠系膜被认为是初始缝合最可靠的解剖标志，可避免断端扭曲。在回肠断端对侧完成第二针缝合后，两个断端应根据其自然解剖结构准确对位。肠管吻合完成后，必须检查吻合区域的颜色，该区域通常呈现正常的粉红色。若术后吻合区域变为紫色，则缝合区域可能发生了缺血，原因可能是缺血肠段未完全切除，或在缝合过程中两断端发生扭转。在此情况下，必须立即纠正手术操作。
回肠切除术的主要并发症包括胆汁酸吸收不良引起的毒性、术后肠梗阻以及吻合口漏。与其他肠段相比，回肠具有多种结构和功能上的特异性，这些特性较难由肠道其他部分代偿。与年轻小鼠相比，相同的回肠切除术可能对年老小鼠造成更严重的损伤，这可能是因为年老小鼠产生的胆汁更多。例如，我们注意到16周龄小鼠的胆汁蓄积程度高于8周龄小鼠。性别差异是否影响回肠切除术所致的.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由汤姆·彼得森基金会和美国国立卫生研究院资助项目R01-HL119780（Jain, MK）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 解剖显微镜 | Olympus | SZ61 | 用于手术 |
| 动物体温控制器 | Physitemp Instruments, Inc. | TCAT-2LV | 用于体温控制 |
| 异氟烷麻醉蒸发器 | VetEquip | 911104 | 用于麻醉 |
| 解剖镊 | Fine Science Tools, Inc. | 11274-20 | 用于手术 |
| 剪刀 | Fine Science Tools, Inc. | 14084-08 | 用于手术 |
| 持针器 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-7882 | 用于手术 |
| 微型刀具-针状刀片 | Fisher Scientific | 10318-14 | 用于手术 |
| 6-0 单股缝合线 | Ethicon | 1698G | 用于腹部皮肤闭合 |
| 7-0 丝线缝合线 | Ethicon | 766G | 用于结扎 |
| 8-0 单股缝合线 | Ethicon | 1714G | 用于吻合 |
| 外科棉垫 | Dynarex Corp. | 3333 | 用于手术 |
| 小型棉签 | Fisher Scientific | 23-400-118 | 用于手术 |
| 异氟烷 | Piramal Healthcare Limited | 66794-013-25 | 用于麻醉 |
| 盐酸丁丙诺啡 | Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals | 12496-0757-1 | 用于镇痛 |
| 0.9% 氯化钠注射液 | B. Braun Medical Inc. | 0264-7800-10 | 用于冲洗/注射 |
| 聚维酮碘术前溶液 | Dynarex Corp. | 1413 | 用于皮肤准备 |
| Puralube vet 软膏 | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | 用于眼部保护 |
| 脱毛乳液 | Church & Dwight Co., Inc. | 用于皮肤准备 | |
| 重症监护单元 | ThermoCare | FW-1 | 用于术后恢复 |
| DietGel 恢复凝胶 | ClearH2O | 72-06-5022 | 用于术后恢复 |
| Aurum 总RNA脂肪与纤维组织试剂盒 | Bio-Rad | 7326830 | 用于RNA提取 |
| iScript 反转录超级混合液（用于RT-qPCR） | Bio-Rad | 1708841 | 用于反转录实验 |
| TaqMan Fast Advanced 主混合液 | Applied Biosystems/Life Technologies | 4444965 | 用于QPCR分析 |
| 总胆汁酸检测试剂盒 | Genzyme Diagnostic | DZ042A-K01 | 用于胆汁酸检测 |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory |
参考文献
- McLeod, R. S. Surgery for inflammatory bowel diseases. Dig Dis. 21, 168-179 (2003).
- Hancock, L., Windsor, A. C., Mortensen, N. J. Inflammatory bowel disease: the view of the surgeon. Colorectal Dis. 8, 10-14 (2006).
- Polle, S. W., Bemelman, W. A.
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重印与许可
