本文介绍了一种体视学方法——光学分馏器法，用于定量分析电休克刺激后大鼠海马中新生神经元的形成及其存活情况。当正确实施时，体视学方法的高灵敏度和高效率可确保以固定且预先设定的精度获得准确的估算结果。
本文内容
摘要
摘要
体视学方法旨在描述定量参数，而无需对细胞或结构的大小、形状、方向和分布做出任何假设。这些方法对哺乳动物脑组织的定量分析具有革命性意义，因为在这些组织中，细胞群体的体积密度过高，无法通过人工计数完成；如今，每当需要从二维切片的测量中推断三维参数时，体视学便成为首选技术。原则上，所有体视学方法都是无偏的；然而，其准确性依赖于对目标结构及其组织特性的充分了解。体视学基于系统均匀随机取样（Systematic Uniformly Random Sampling, SURS），并通过调整取样水平以达到最优精度，从而提供有关整个目标结构的可靠定量信息。本文介绍采用光学分馏器法（optical fractionator）结合BrdU免疫组织化学技术，用于估计电休克刺激后大鼠海马齿状回颗粒细胞层（包括颗粒下区）中新生成神经元的生成与存活情况；电休克刺激是目前已知最强的神经发生诱导手段之一。光学分馏器技术旨在通过对整个结构中采集的厚切片进行取样，以估算细胞的总数。厚切片可使细胞在三维空间中的完整形态得以呈现，从而基于形态学标准对细胞进行简便且稳健的分类。若操作正确，光学分馏器具有高灵敏度和高效率，能够以固定且预先设定的精度提供准确的估算结果。
引言
对三维（3-D）结构中的细胞进行定量可能需要基于无偏原则获得估计值。即使在今天，许多研究仍经常使用二维（2-D）方法来报告三维结构的数据。然而，这些方法未考虑结构在细胞形态和分布上的异质性，因而存在方法学上的局限性；它们对所关注的三维结构做出假设，且结果并不反映整个结构的真实情况。这些局限性降低了方法的敏感性和准确性，同时也增加了出错的风险1。
通过应用基于设计的体视学方法，可以避免细胞计数中的偏差，这对于获取特定组织或结构中细胞数量的定量信息具有普遍重要意义。 尽管体视学过去是一种非常耗时的方法，但随着实验流程、软件和成像技术的进步，该方法已 变得高效得多，并具有更广泛的适用性。体视学结合了统计抽样原理和随机几何理论，通过在二维切片中进行采样，为估算三维结构中物体的体积、表面积、长度和数量提供有效的工具2。因此，体视学能够在无需全面分析的情况下，获得有关组织切片结构变化的无偏定量数据，从而对真实数值提供平均估计1。体视学被定义为从采样信息中进行几何参数的统计推断。这可以通过无偏采样实现，即系统性随机采样切片，以及采用确保所有物体被计数概率相等的计数规则3。虽然体视学结果的精确度可能因误差系数（CE）的不同而有所变化，但可通过调整采样量，使精度适应固有的生物学变异（变异系数（CV））4,5。 此前已有少数体视学研究探讨了电休克刺激（ECS）对啮齿类动物海马可塑性的短期影响6,7。这些研究的数据表明，在重复ECS后，神经元总数最初有所增加，同时突触分化水平升高。然而，这些研究并未直接估算神经发生，因为它们未使用细胞增殖的特异性标记物。
此处我们介绍一种体视学方法——光学分馏器技术的应用8,9，用于定量大鼠海马颗粒细胞层（GCL）中新生成神经元的总数，包括亚颗粒区（SGZ）及其长期存活情况10,11我们对大鼠采用了一种具有临床相关性的电休克治疗方案（ECS）（每周3次，持续3周），该方案是神经发生最强效的刺激方法之一。12对照动物采用相同的操作程序处理，但不通过电流。在21天实验期间的每一天，所有大鼠均通过腹腔注射5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU），该物质可在细胞分裂过程中掺入DNA，替代胸腺嘧啶13实验结束后，大鼠分别被维持了四个不同的时间段（24小时、3个月、6个月和12个月）。根据分体器原理，我们通过对切片进行系统随机取样，获得 hippocampus 的已知部分，并将光学分离器（三维探针）应用于所取样的、经免疫染色的厚组织切片。需特别指出的是，冷冻切片在处理过程中通常会在z轴方向发生塌陷，因此在此特定情况下，应使用基于数量加权平均切片厚度的光学分离器。14当光学分馏器的焦平面在切片中已知距离内向下移动时，一旦明确识别出BrdU阳性神经元的特征结构，即对其进行计数。在体视学领域，关于应计数的颗粒总数仍存在一些争议。15；通常需要计数目标结构中的150-200个神经元以获得足够的精确度 即 7-8% 的系数8使用配备相机的标准显微镜和以下物镜：2X、4X、10X以及100X油镜（数值孔径=1.40），并结合电动载物台，通过立体学软件完成BrdU阳性神经元的计数。Z轴方向的移动由数字测微计测量。最终放大倍数为3000X。
方案
所有动物实验均按照丹麦动物实验监察局的指南进行，并经实验动物本地伦理委员会批准。
1. 组织处理
注意：经心脏灌注后，将脑组织在4%多聚甲醛（PFA）中于4 °C下用0.2 M磷酸缓冲液固定过夜，随后转移至含30%蔗糖的磷酸盐缓冲液（PBS）中，4 °C下孵育三天。之后，将脑组织置于粉末状干冰上速冻，并在-80 °C下保存，直至切片。
- 使用解剖刀沿大脑正中线分离右半球和左半球，然后在第一个脑样本中随机选择一侧半球，之后在左右半球之间系统性交替选择（图 1A）。将所取的半球用包埋介质固定于样本盘上，使半球长轴与样本盘垂直。
- 将编号的多孔培养皿放入恒冷箱切片机中进行预冷。
- 将样本盘装入恒冷箱切片机，对整个海马结构（前囟 1.80 至 -7.0416）进行冠状面切片，切片厚度为 80 µm（图 1B）。
- 将所有切取的切片按顺序连续放入已冷却的多孔培养皿中，以确保切片保持切割时的顺序。
- 用冷冻保护液完全覆盖切片，并将培养皿置于 -20 °C 保存，待后续使用。
2. 免疫染色
注意：为在染色过程中追踪各个样本切片，将取样的切片置于25孔染色网板中。每间隔5个th 切片，最终每侧海马平均获得 12（8–16）片，用于免疫染色及后续细胞计数。
- 在进行次级取样之前，每隔 nth 在第一部分和第n部分之间随机选择一个起始部分图1C) 将容器从 -20 °C 至室温（RT）。
- 使用 例如 使用画笔将切片按顺序转移至置于盛有PBS的培养皿中的25孔染色网中。
注意：从此时起，将染色网置于相应的玻璃培养皿中，并将培养皿放置在轨道摇床（步骤 2.3 至 2.9）上。 - 将染色网转移至匹配的玻璃培养皿中，在室温下用 PBS 洗涤切片两次，每次 10 分钟，随后在 3% 过氧化氢（H₂O₂）中孵育2O2) 用蒸馏水（dH220 分钟
- 将切片转移至三种不同的盐酸（HCl）溶液（1 M，于 0 °C 10 分钟，室温下 2 M 10 分钟，以及 2 M 在 37 °C 20分钟后，于室温下用0.1 M硼砂溶液中和20分钟。
- 在 PBS 中稀释的 1% Triton X-100（洗涤缓冲液）中孵育 3 次，每次 10 分钟后，将切片转移至含 10% 胎牛血清（封闭液）的洗涤缓冲液中，室温下孵育 1 小时。
- 将切片在37℃孵育48小时 4 °C 在封闭液中按1:100稀释的小鼠抗BrdU抗体
- 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 10 分钟，然后在洗涤缓冲液中加入 1:10 稀释的辣根过氧化物酶，48 小时。
- 将切片转移至 PBS 中洗涤，每次 10 分钟，共 5 次，然后转入含 0.01% 二氨基联苯胺（DAB）的 PBS 溶液中孵育 7 分钟，随后转移至含有 0.02% H₂O₂ 的类似 DAB 溶液中2O2 室温下孵育10分钟。
- 完成一系列洗涤步骤（在 PBS 中洗涤 2 次，每次 10 分钟；在不含额外氯化钠的磷酸盐缓冲液中洗涤 2 次，每次 10 分钟），然后按数字顺序将切片 mounted 在载玻片上。
- 将切片干燥约30分钟，然后用焦油紫复染。
- 将显微镜载玻片放入玻片架中。
- 在含有去离子水的玻片染色皿中将切片复水 10 分钟2O，然后将切片转移至0.02%焦宁Y的dH₂O溶液中2O 型，15 分钟
- 在切片经乙醇脱水（96% 乙醇中 5 分钟，99% 乙醇中 2 × 2 分钟）之前，重复步骤 2.12。
- 将切片置于二甲苯中处理 2 × 15 分钟，然后使用快速封片介质加盖玻片封片。
- 最后，将加样盖玻片放置约 24 小时后，即可用于显微镜观察。
3. 使用光学分数法估算 BrdU 标记神经元的总数
注意：在正式实验前，应先开展一项包含少量动物的预实验，以确定最佳采样参数，例如需分析的切片数量以及每张采样切片内的光学分离器数量。该预实验还可提供初步的变异系数（标准差/均值），并允许调整估计系数（见第3.9.3节），以便研究者获得满意的估计精度（更多细节见下文）。同样，应进行z轴分布分析，以评估以下方面：组织的收缩情况、整个切片染色的质量，以及细胞在z轴方向上的分布情况14。
- 检查切片中组织的厚度，以确认其是否适用于光学分数法。 例如 足以满足所选分割器高度（包括保护区域，见下文）的要求。注意：在感兴趣区域内多个位置测量组织厚度。
- 将载玻片置于显微镜的电动载物台上，并启动首选的体视学软件。
- 使用低倍物镜（2X 或 4X）划定感兴趣区域，然后切换至 100X 油浸物镜（参见 图 2A).
- 使用计数框的特定点（例如 在角落或靠近角落的位置，通过沿焦平面移动，直到切片的某个特征清晰对焦，从而确定切片的顶部位置。将此 z 位置登记为 0（参见 图2B).
- 将焦平面沿组织向下移动，直至计数框的同一特定点位于组织中最后一个处于焦点的z层面，并标记此位置。局部组织厚度定义为从0至此终点的距离，可在z轴上读取。记录组织厚度（参见 图 2B).
- 记录染色剂在切片全层的完全渗透情况以及细胞在切片全厚度中的分布。
注意：BrdU标记神经元的分布可作为确定所需保护区域的参考依据。尽管细胞分布均匀至关重要，但在切片的顶部和底部附近观察到较少的细胞是可接受的，这表明了切片端部丢失（lost caps）的影响（更多细节参见Dorph-Petersen et al., 2009）。- 对BrdU标记的神经元进行取样，并记录其z轴位置以及在每个计数框选定角落处测量的局部切片厚度。
- 将 BrdU 阳性神经元的数量对其 z 位置作图。
- 根据平均切片厚度和细胞分布情况确定体视学计数框（disector）和保护区（guard zones）的高度（参见3.1和3.2）。
注意：体视学取样框（disector）的高度应小于切片厚度，以避免切片表面附近的伪影。通过在切片顶部和底部设置保护区（guard zones），可规避此风险。 - 确定无偏测试体之间的步长。
- 在所有待分析的切片上勾画出感兴趣区域，并记录相应面积。
- 将这些区域的面积相加，然后除以该区域内需放置的体视学计数框（disector）的数量。
注：根据以往经验，一个良好的起点是75个探针。这将提供对区域及其相应采样位置的近似估计（A步骤）（更多细节参见 West, 2012）。 - 取 A 的平方根步骤，将提供 x-y 方向的步长尺寸。
- 确定计数框的大小。
- 将计数框的大小设置为任意单位，使用第3.3和3.4节中获得的参数对BrdU阳性神经元进行初步抽样。
注意：尺寸需通过反复试验凭经验确定，但建议调整至每个分割器可采样 2-3 个细胞为宜8.
- 将计数框的大小设置为任意单位，使用第3.3和3.4节中获得的参数对BrdU阳性神经元进行初步抽样。
- 完成该预试验的最后一步后，开始进行细胞取样。
注意：所获得的采样参数应使每只动物的计数约为150-200个细胞，此数量足以实现有效的体视学设计。8. - 使用100×油镜物镜，最终放大倍数为2000–3000×，对BrdU阳性神经元进行计数。在每个光学分离器内，识别出具有明确特征的BrdU标记神经元（本研究中的判定标准为：BrdU标记神经元的前沿首次进入焦平面时），且该神经元位于计数框内或接触允许计数的边界线图2B）。不要计数那些在体视学计数框高度范围内虽可明确识别为感兴趣特征但接触排除线的 BrdU 阳性神经元。在整个体视学定量分析过程中严格遵守这些计数规则至关重要。
注意：由于BrdU可掺入所有分裂细胞，因此需借助形态学特征来区分神经元与其他类型的细胞。神经元的特征包括界限清晰的细胞核、中性染色的细胞质以及深染的核仁。BrdU阳性细胞若体积明显大于胶质细胞，则被认定为新生成的神经元。需要指出的是，在短期增殖研究中（例如 < 24 h）使用未成熟神经元标记物进行双重染色可能是必要前提17. - 通过将每个脑区计数的细胞总数（ΣQ-）与相应的抽样比例：
用于
其中
Q- 是数量加权的平均截面厚度， h 是体视学中分割器的高度， asf 是面积取样比例， ssf 是部分采样分数和 ti 是第 i 个切片的切片厚度th 计数框内细胞计数为 
在体视学计数框中14,18. - 计算误差系数（CE）8 即系统性均匀随机取样（SURS）中BrdU阳性神经元的抽样方差。
- 首先，计算 噪声，即所计数的 BrdU 阳性神经元总数：
- 接下来，计算SURS中的方差：
注：我们判断海马区的面积和细胞计数在各切片间呈平滑变化，因此采用平滑度等级 m = 1 (1/240)8,19
其中
Pi 是针对第 i 个对象计数的点数th 部分数，n 为切片数量4,20. - 最后，计算该估计值的估计效率（CE）：
注意：通常情况下，当CE值小于观察到的CV值的一半时，可达到最佳精密度，如OCV所示2 ICV2 + CE2，其中OCV为观测到的变异系数（CV），ICV为固有变异系数（CV）4.
- 首先，计算 噪声，即所计数的 BrdU 阳性神经元总数：
图1：示意图展示本研究中依据分馏器原理进行的组织处理流程。
实验结束后，将半球分离，并系统性随机选择右侧或左侧半球（A）。沿整个海马体延伸的完整脑组织被切成80-µm- 厚冠状切片（B），每隔5th 从第1至第5个切片中随机选取起始位置，对脑组织进行亚采样，用于最终的免疫染色及体视学定量分析（C）。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图2：使用光学分离器进行体视学取样过程的示意图。
(A) 经过组织学处理后，界定海马齿状回颗粒细胞层/亚颗粒区（GCL/SGZ），并在该区域内均匀且随机地应用光学分离器。(B) 在光学分离器中（左），仅当BrdU阳性神经元的特定结构在分离器高度范围内清晰可见，并且位于计数框内或接触计入线时（右），才进行计数；接触排除线的神经元不计入。比例尺 = 10 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
结果
采样参数
通过分析预实验中的 z 轴分布（图 3），我们发现 BrdU 阳性神经元在探测器高度范围内呈均匀分布。测量了切片的收缩情况；最初切片厚度为 80 μm 的样本，最终平均厚度为 26.4 μm（19.0–32.0 μm）。根据组织厚度及 BrdU 标记神经元的分布，将探测器高度设定为 10 μm，顶部和底部的保护区分别设定为 5 μm 和 4–17 μm。根据细胞密度，计数框的面积为 1414 或 5210 μm2。x 和 y 方向的步长均为 220 μm，每只动物平均在 12（范围 8–16）个切片中进行细胞计数。这些采样参数使得每侧脑半球平均在 173（107–204）个探测器中计数到 133（范围 33–372）个 BrdU 阳性细胞。
例如，我们获得了电休克治疗大鼠中 BrdU 阳性神经元估算的以下变异系数（CV）和误差系数（CE）值：24 小时：CV = 0.59，CE = 0.11；3 个月：CV = 0.34，CE = 0.12；6 个月：CV = 0.43，CE = 0.09；12 个月：CV = 0.22，CE = 0.09。
我们采用光学分数法结合 BrdU 染色技术10,11，定量分析了电休克刺激（ECS）后大鼠海马区新生神经元的总数及其长期存活情况。最终结果显示，四组对照动物均存在基础水平的神经发生，且不同存活时间之间的差异无统计学意义（图3）。此外，与对照组动物相比，ECS 在实验后 24 小时（增加 259%，p<0.0001）、3 个月（增加 229%，p<0.001）、6 个月（增加 152%，p<0.05）和 12 个月（增加 162%，p<0.05）均显著增加了 BrdU 阳性神经元的总数。
图 3：大鼠海马齿状回颗粒细胞层（GCL）/亚颗粒层（SGZ）中 BrdU 阳性神经元总数的定量数据10,11。
横线表示平均值。缩写：GCL，颗粒细胞层；SGZ，亚颗粒层；h，小时；m，个月。****p<0.0001，***p<0.001，*p<0.05，与对照组比较（每组 n=11–12）。 请点击此处查看该图的高清版本。
讨论
采用ECS作为诱导神经发生的方法，我们发现海马区新生成的BrdU阳性神经元数量立即增加了260%。在这一急性生成的神经元群体中，从第1天到3个月期间有40%的神经元丢失，而新形成的神经元中近50%在治疗后至少可存活12个月。10,11BrdU标记神经元的计数遵循严格的取样方案，即将整个海马切成80 µm厚的切片，随后对每第5个切片进行亚取样th 从第一到第五节中随机选择一个起始节段，随后进行系统性随机取样。只要这些节段以系统随机的方式选取，该方法显然是一种有效降低最终结果方差的优良方法，无需进行 exhaustive counting1该取样方案使我们能够在每只大鼠脑组织中平均计数12（8–16）个海马切片中的BrdU阳性神经元，最终精确度为9–11%。
使用分馏法时，必须明确计数所覆盖的切片高度比例，因为在组织学处理过程中，组织常会发生收缩和变形。14事实上，本研究中观察到了明显的厚度收缩。此外，需要注意的是，不同组织可能会发生差异性收缩，如 Dorph-Petersen 等 2001 年所述。然而，只要所关注的完整结构仍可供分析，这些局限性不会导致颗粒总数出现偏差。 即 BrdU阳性神经元。在组织收缩问题尤为突出的研究中，应始终注明结果来源于变形的组织。本研究中，计数时采用的分割器高度为10 µm。本研究切片的最终平均厚度为26 µm，切片顶部设有5 µm的保护区，底部设有平均11 µm的保护区。这些参数是可接受的，因为保护区的厚度应大致等于被采样颗粒的直径。
在划定颗粒下层/齿状回亚颗粒层（GCL/SGZ）区域后，将体视学无偏抽样框（disectors）在划定区域内进行系统随机放置。抽样框应以固定的步长定位，以优化取样和计数过程，从而高效地获得由研究者确定精度的估算结果。通常，通过在每个目标结构中计数150-200个细胞，可达到最佳精度5。在本研究中，我们每只大鼠海马中平均计数了133个（范围为33-372）BrdU阳性神经元。由于部分对照组动物中细胞数量较低，我们对BrdU阳性神经元的计数低于通常可接受的、用于获得合适精度所需的细胞数量，导致这些情况下的变异系数（CE值）相对较高。然而，由于我们获得的CE值小于CV值的一半（见代表性结果部分），因此无需进行额外的取样和计数。较高的CV值表明，观察到的变异主要来源于生物学变异。事实上，我们可以认为本研究中计数的BrdU阳性神经元平均数量高于必要水平。例如，在一组大鼠中，我们获得了9%的CE值和43%的CV值。在此特定情况下，我们本可以将精度目标设定为约20%。总之，本研究中BrdU阳性神经元总数的估算精度是充分的，足以捕捉到处理因素对颗粒真实数量的真实效应。由于某些动物组内存在较大的生物学变异，即使减少工作量，仍有可能以可接受的精度获得相同的估算结果。组内较高的生物学方差只能通过增加动物数量来补偿。
有人可能会认为，获得精确细胞数量的金标准是对所有目标对象进行 exhaustive 计数。然而，在大多数脑科学研究中，由于细胞数量极为庞大，这种方法并不可行。尽管与 exhaustive 细胞计数相比，可选的 fractionator 方法效率要高得多，但与简单的细胞数量差异筛查相比，其仍相对耗时；如果无需获得精确的细胞数目，则优先采用这种简单的筛查方法。根据我们的经验，仅通过筛查程序即可检测到超过 20–30% 的差异。
若操作得当，基于设计的体视学取样能够以高效的方式提供无偏且精确的估计值1。体视学的无偏特性使得估计结果在重复实验时能够逼近真实总体均值，从而提高估计的可重复性21。首先，必须获取所研究结构整体（本研究中为海马齿状回颗粒下层/颗粒生成区，GCL/SGZ）的代表性样本，以便在具有统计学有效性的子集切片中进行估计4。为了获得适当数量的切片和计数探针，我们采用系统均匀随机取样（SURS），该方法相较于随机取样可降低方差8。此外，SURS 能确保结构内感兴趣颗粒的取样概率相同，不受其大小、形状、方向和分布的影响。因此，当研究项目的核心目标是获得精确且无偏的估计值时，强烈推荐使用体视学方法。
披露
作者无竞争性财务利益。
致谢
感谢 Susanne Sørensen 提供娴熟的技术协助。本工作获得了来自 Velux 基金会、Jascha 基金会、Aase 和 Ejnar Danielsens 基金会、Hartmann Brothers 基金会、总监 Jacob Madsen 及其妻子 Olga Madsen 基金会、Sofus Carl Emil Friis 博士及其妻子 Doris Friis 信托基金、1870 基金会、Torben 和 Alice Frimodts 基金会以及神经学研究基金会的资助。手稿编辑由 Inglewood Biomedical Editing 完成。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 材料 | |||
| 5'-溴-2'-脱氧尿苷 - BrdU | Sigma-Aldrich | 19-160 | |
| 焦油紫 | Sigma-Aldrich | C5042 | 包含以下用于 1 L 的材料：0.2 g 焦油紫；2.0 g 乙酸钠，3 H2O；3 ml 冰醋酸；1000 ml 蒸馏水 |
| 冷冻保护剂 | 丹麦首都大区药房 | 861334 | 包含以下材料：蔗糖；聚乙烯吡咯烷酮 PVP 40；磷酸钠缓冲液（0.2 M） 乙二醇；去离子水 |
| dH2O | 丹麦首都大区药房 | 817205 | |
| 二氨基联苯胺 – DAB | Sigma-Aldrich | D5637 | |
| Envision-HRP | DAKO | K4001 | 辣根过氧化物酶标记的聚合物偶联羊抗小鼠免疫球蛋白 |
| 乙醇 - 70 % | Plum A/S | 201098 | |
| 乙醇 - 96 % | Plum A/S | 201104 | |
| 乙醇 - 99.9 % | Plum A/S | 201111 | |
| 胎牛血清 | 体外 | BI-04-003-1A | |
| H2O2 30% | 丹麦首都大区药房，DK | 896456 | |
| HCl | J. T. Baker | 6081 | |
| 封片剂 | Sakura | 4583 | Tissue Tek |
| 小鼠抗 BrdU | Becton-Dickinson | 347580 | |
| PBS缓冲液 | Capital Region Pharmacy, DK | 853436 | pH = 7.4 |
| PFA | VWR | 28,794,295 | pH = 7.4 |
| 磷酸盐缓冲液 | 丹麦首都大区药房，DK | 866533 | 0.1 mol/L，pH 7.4 |
| 快速干燥封片介质 | Histolab Products AB | 801 | Pertex |
| 四硼酸钠 | 默克股份公司 | 1,063,080,500 | |
| 蔗糖 | 默克股份公司 | 1,076,515,000 | |
| Triton X-100 | Merck A/S | 1,086,031,000 | |
| 二甲苯 | VWR | 28,973,363 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
| 设备 | |||
| 盖玻片 | Menzel-Glä血清 | 24x50 mm #0 | |
| 冷冻切片机 | Leica | CM1860 | |
| 数字微位移计 | 海登海因 | VRZ 401 | |
| 玻璃培养皿 | 脑科学研究实验室 | 1256 | |
| 显微镜 | 尼康 | Eclipse 80i | |
| 显微镜相机 | Olympus | DP72 | |
| 显微镜载玻片 | VWR | 48311-703 | SuperFrost+ |
| 电动载物台 | 之前 | H101A | |
| 多皿容器 | Sigma-Aldrich | D6315-1CS | Nuclon 12孔板 |
| New-Cast 软件 | Visiopharm | ver. 4.5.6.440 | |
| 目标 2x | 尼康 | CFI Plan UW 2X | |
| 目标 4x | 尼康 | CFI Plan Fluor 4X | |
| 目标 10倍镜 | 尼康 | CFI Plan Fluor 10X | |
| 目标物镜 100倍油镜 | 尼康 | CFI Plan Apo Lambda DM 100X 油镜 | 数值孔径 1.40 |
| 轨道摇床 | Gemini BV | CM-9 | Sarstedt |
| 载玻片架 | Sakura | 4465 | |
| 载玻片染色皿 | Sakura | 4457 | Tissue-Tek |
| 样本盘 | Leica | 14037008637 | |
| 染色网 | 脑科学研究实验室 | 2512 | 25孔 |
参考文献
- Boyce, R. W., Dorph-Petersen, K. A., Lyck, L., Gundersen, H. J. Design-based stereology: Introduction to basic concepts and practical approaches for estimation of cell number. Toxicol. Pathol. 38 (7), 1011-1025 (2010).
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