在此方法中，培养人原代肌细胞 体外 以获得分化的肌管细胞并测量葡萄糖摄取率。我们提供了一种详细方案，用于在基础状态和胰岛素刺激状态下，利用放射性标记的[3[3H] 2-脱氧-D-葡萄糖
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摘要
摘要
骨骼肌是哺乳动物体内最大的葡萄糖储存库，在维持葡萄糖稳态中起重要作用。评估肌细胞的胰岛素敏感性对于所有致力于研究肌肉葡萄糖代谢及表征代谢改变的研究均具有重要意义。在肌细胞中，葡萄糖转运蛋白4型（GLUT4）在胰岛素刺激下转位至细胞质膜，从而促进大量葡萄糖进入细胞。肌细胞通过提高葡萄糖摄取速率对胰岛素作出响应的能力，是量化肌细胞胰岛素敏感性的标准检测指标之一。人原代肌管细胞是一种合适的 体外 模型，因为这些细胞保留了供体表型的多种特征，包括胰岛素敏感性。这 体外 该模型也适用于任何可能影响胰岛素反应性的化合物的检测。在分化后的肌管细胞中测定的葡萄糖摄取速率可反映胰岛素敏感性。
在此方法中，培养人原代肌细胞 体外 以获得分化的肌管，并测量有无胰岛素刺激条件下的葡萄糖摄取速率。我们提供了一种使用放射性标记的[3H] 2-脱氧-D-葡萄糖（[3H]2dG）。提供了用于量化基础活性和胰岛素刺激速率以及刺激倍数的计算方法。
引言
骨骼肌是哺乳动物体内最大的葡萄糖储存库，在葡萄糖稳态调节中起着重要作用。这种胰岛素响应性组织是胰岛素刺激引发的葡萄糖摄取的主要部位1。
在2型糖尿病中，多个组织（包括骨骼肌）会出现胰岛素抵抗，导致血糖浓度高于正常水平。因此，无论目的是为了表征个体中的功能缺陷，还是评估旨在改善胰岛素敏感性的治疗方案的有效性，确定该组织及其细胞的胰岛素敏感性水平都具有重要意义。在人类或动物受试者中，评估胰岛素敏感性的金标准技术是高胰岛素-正葡萄糖钳夹法。该方法由DeFronzo于1979年首次提出2，此后经过多次改良3,4，可通过测量在胰岛素刺激下为维持正常血糖浓度所需输注的葡萄糖速率，来定量评估整体机体及各组织的胰岛素反应性。
胰岛素敏感性的研究也可在细胞水平上进行 体外 肌肉模型及葡萄糖摄取速率的测定仍是量化细胞对胰岛素刺激产生生物学反应的高效且可靠的工具5,6,7事实上，葡萄糖摄取测量可定量评估细胞对胰岛素刺激的生物学反应....
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方案
1. 细胞培养基与溶液的制备
- 培养基的制备
- 通过在Ham's F-10培养基中添加谷氨酰胺（2 mM）、青霉素/链霉素（终浓度5 µg/mL）、2% 胎牛血清（FCS）和2% 血清替代物，制备增殖培养基（PM）。
- 通过在杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中添加谷氨酰胺（2 mM）、青霉素/链霉素（终浓度5 µg/mL）和2% 胎牛血清（FCS），制备分化培养基（DM）。
- 葡萄糖摄取溶液的制备
注意：放射性物质的操作仅可在受控和限制区域内由授权人员进行。材料和废弃物的处理必须遵循相应的程序、指南及当地法规。- 为制备X-杜氏磷酸盐缓冲液（X-DPBS），配制含有0.2%（w/v）（终浓度）牛血清白蛋白（BSA）的DPBS溶液。使用0.2 µm滤器过滤溶液，并于4 °C保存。
- 为制备冷2-脱氧-D-葡萄糖（2dG）溶液，称取16.4 mg 2dG，溶于10 mL蒸馏水中，得到10 mM溶液。于4 °C保存。
- 将600 µL冷2dG溶液与6 µL放射性标记的[3H] 2dG加入5400 µL X-DPBS中，配制放射性标记的2dG（2dG*）溶液。
注：终浓度为1 mM 2dG，比活性为1 µCi/mL。- 取20 µL放....
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结果
第3天，成肌细胞达到汇合状态（图1A）。此阶段的成肌细胞通常为单核。更换培养基后，至第8天完成分化（图1B）（实验方案第2节）。分化5天后，肌管排列整齐，通常呈多核状态。人原代肌管在测定葡萄糖摄取速率前，分别接受棕榈酸或仅含牛血清白蛋白（BSA）的处理。细胞分别在含0.5 mM棕榈酸的BSA溶液（PALM）或仅含BSA（BSA）中孵育48小时。随后进行胰岛素刺激（实验方案第3节）并测定葡萄糖摄取量（实验方案第4节）。图2展示了对照条件（BSA）与处理条件（PALM）下的葡萄糖摄取速率。在加入细胞松弛素B的肌管中测定非特异性摄取量。可比较BSA和PALM条件下基础状态及胰岛素刺激下的葡萄糖摄取速率。在BSA条件下，胰岛素显著增加葡萄糖转运（p <0.01）。经PALM处理的肌管中，胰岛素刺激的葡萄糖摄取速率显著降低（p <0.05）。此外，人肌管细胞对胰岛素的反应也可表示为倍数变化。<.......
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讨论
葡萄糖摄取是检测细胞培养中激活剂或抑制剂对葡萄糖利用以及细胞对胰岛素反应能力的关键生物学指标。本文所述方法已被证明快速可靠，已广泛应用于多项研究，涉及来自健康受试者和/或代谢异常患者的原代肌管细胞6,7,10,12,21,26,27,36,37使用一块6孔板即可对总基础转运、基础主动转运和胰岛素刺激的主动转运分别进行重复测定。这三个数值可全面描述细胞的胰岛素敏感性 体外 培养的肌细胞
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢里昂-南医院放射生物学科的Anne Charrié以及瑞士国家科学基金会（FNS）提供的资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 人原代肌细胞 | 自备人骨骼肌活检组织制备 | 自备人骨骼肌活检组织制备 | 若无法自备，可使用商业来源 |
| 人原代肌细胞 | Promocell | C-12530 | 需使用配套培养基 C23060 和 C23061 进行培养 |
| 6 孔板 | Corning | 356400 | BioCoat I 型胶原多孔板 |
| Ham's F10 | Dutscher | L0145-500 | 含 1 g/L 葡萄糖 |
| 谷氨酰胺 | Dutscher | X0551-100 | |
| 青霉素/链霉素 100 倍浓缩液 | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 血清替代物 Ultroser G | Pall France | 15950.017 | 文中称为血清替代物 |
| DMEM 低糖培养基 | Dutscher | L0064-500 | 含 1 g/L 葡萄糖 |
| 胎牛血清 | Eurobio | CVFSVF00-01 | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（含钙镁） | Dutscher | L0625-500 | 含 Mg2+ (0.5 mM) 和 Ca2+ (0.9 mM) |
| 人胰岛素溶液 | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| 2-脱氧-D-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | D6134 | |
| 牛血清白蛋白 | Euromedex | 04-100-812-E | |
| 无脂肪酸 BSA | Roche | 10,775,835,001 | |
| 棕榈酸盐 | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| 脱氧-D-葡萄糖，2-[1,2-3H (N)] | PerkinElmer | NET328A001MC | 比活性：5 - 10 Ci (185-370 GBq)/mmol，1 mCi (37 MBq) |
| 细胞松弛素 B | Sigma-Aldrich | C2743 | |
| PICO PRIAS 小瓶，6 mL | PerkinElmer | 6000192 | |
| Ultima Gold MW CA | PerkinElmer | 6013159 | 闪烁液 |
| bêta 计数器 | PerkinElmer | 2900TR |
参考文献
- Stump, C. S., Henriksen, E. J., Wei, Y., Sowers, J. R. The metabolic syndrome: role of skeletal muscle metabolism. Ann Med. 38 (6), 389-402 (2006).
- DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. ....
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重印与许可
