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方法文章

葡萄糖摄取测量及对胰岛素刺激的反应在 体外 培养的人原代肌管细胞

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DOI：

10.3791/55743

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2017年6月25日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CarMeN Laboratory, INSERM U1060, INRA 1397, University of Lyon, 2Department of digestive and bariatric surgery, Obesity Integrated Center, University Hospital of Edouard Herriot, Hospices Civils de Lyon, Lyon 1 University, 3Division of Endocrinology, Diabetes, Hypertension and Nutrition, Department of Clinical Medicine, Faculty of Medicine, University of Geneva

本文内容

摘要

在此方法中，培养人原代肌细胞 体外 以获得分化的肌管细胞并测量葡萄糖摄取率。我们提供了一种详细方案，用于在基础状态和胰岛素刺激状态下，利用放射性标记的[3[3H] 2-脱氧-D-葡萄糖

摘要

骨骼肌是哺乳动物体内最大的葡萄糖储存库，在维持葡萄糖稳态中起重要作用。评估肌细胞的胰岛素敏感性对于所有致力于研究肌肉葡萄糖代谢及表征代谢改变的研究均具有重要意义。在肌细胞中，葡萄糖转运蛋白4型（GLUT4）在胰岛素刺激下转位至细胞质膜，从而促进大量葡萄糖进入细胞。肌细胞通过提高葡萄糖摄取速率对胰岛素作出响应的能力，是量化肌细胞胰岛素敏感性的标准检测指标之一。人原代肌管细胞是一种合适的 体外 模型，因为这些细胞保留了供体表型的多种特征，包括胰岛素敏感性。这 体外 该模型也适用于任何可能影响胰岛素反应性的化合物的检测。在分化后的肌管细胞中测定的葡萄糖摄取速率可反映胰岛素敏感性。

在此方法中，培养人原代肌细胞 体外 以获得分化的肌管，并测量有无胰岛素刺激条件下的葡萄糖摄取速率。我们提供了一种使用放射性标记的[3H] 2-脱氧-D-葡萄糖（[3H]2dG）。提供了用于量化基础活性和胰岛素刺激速率以及刺激倍数的计算方法。

引言

骨骼肌是哺乳动物体内最大的葡萄糖储存库，在葡萄糖稳态调节中起着重要作用。这种胰岛素响应性组织是胰岛素刺激引发的葡萄糖摄取的主要部位1。

在2型糖尿病中，多个组织（包括骨骼肌）会出现胰岛素抵抗，导致血糖浓度高于正常水平。因此，无论目的是为了表征个体中的功能缺陷，还是评估旨在改善胰岛素敏感性的治疗方案的有效性，确定该组织及其细胞的胰岛素敏感性水平都具有重要意义。在人类或动物受试者中，评估胰岛素敏感性的金标准技术是高胰岛素-正葡萄糖钳夹法。该方法由DeFronzo于1979年首次提出2，此后经过多次改良3,4，可通过测量在胰岛素刺激下为维持正常血糖浓度所需输注的葡萄糖速率，来定量评估整体机体及各组织的胰岛素反应性。

胰岛素敏感性的研究也可在细胞水平上进行 体外 肌肉模型及葡萄糖摄取速率的测定仍是量化细胞对胰岛素刺激产生生物学反应的高效且可靠的工具5,6,7事实上，葡萄糖摄取测量可定量评估细胞对胰岛素刺激的生物学反应，涵盖胰岛素与其受体结合、富含GLUT4的囊泡转位，以及细胞内信号传导和磷酸化级联反应等过程。8.

这对于人类样本尤为重要，因为分化的成肌细胞能够维持供体表型的许多特征，包括患者中存在的代谢特性及代谢异常9,10,11,12。成肌细胞在结构、代谢和表型方面与骨骼肌具有相似性13,14，包括葡萄糖转运蛋白的表达15以及细胞内胰岛素信号通路相关分子机制16。因此，检测原代成肌细胞的葡萄糖摄取能力，对于表征供体的肌肉表型，或研究干预措施（药物、营养或体力活动）对肌肉细胞胰岛素敏感性的影响具有重要意义。

在进行影响胰岛素敏感性的实验时，测定培养的肌管细胞对葡萄糖的摄取也是一种可靠的工具17,18。体外模型适用于检测任何可能改善胰岛素反应性，或预防或逆转获得性或诱导性胰岛素抵抗的化合物19,20,21,22,23。

本文介绍了一种详细的人肌管细胞培养与分化以及细胞葡萄糖摄取速率测定的实验方案。该方法适用于任何来源的人肌肉前体细胞，无论其来自实验室内部制备、合作单位或商业供应商。永生化的小鼠和大鼠来源的肌肉细胞系（如C2C12和L6）也可采用本方案进行葡萄糖摄取测定7。

我们提供了一种详细的实验方案，利用放射性标记的[3H]2dG来定量基础状态和胰岛素刺激状态下的葡萄糖摄取速率。使用标记的葡萄糖类似物可在起始材料有限的情况下准确测定葡萄糖进入细胞的量，这在使用原代细胞时尤为常见。该修饰后的葡萄糖分子无法进入代谢途径，因此会在细胞内积累，从而可通过测定细胞总放射性实现可靠定量。实验条件包括使用葡萄糖转运抑制剂（细胞松弛素B），并在有或无胰岛素的情况下进行检测。这种组合可确定葡萄糖主动进入的速率，并可计算胰岛素反应指数的倍数变化。本方法展示的是在单一孵育时间内使用一个胰岛素剂量的情况，但该方案可轻松修改，适用于剂量-反应或时间进程实验12。

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方案

1. 细胞培养基与溶液的制备

  1. 培养基的制备
    1. 通过在Ham's F-10培养基中添加谷氨酰胺（2 mM）、青霉素/链霉素（终浓度5 µg/mL）、2% 胎牛血清（FCS）和2% 血清替代物，制备增殖培养基（PM）。
    2. 通过在杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中添加谷氨酰胺（2 mM）、青霉素/链霉素（终浓度5 µg/mL）和2% 胎牛血清（FCS），制备分化培养基（DM）。
  2. 葡萄糖摄取溶液的制备
    注意：放射性物质的操作仅可在受控和限制区域内由授权人员进行。材料和废弃物的处理必须遵循相应的程序、指南及当地法规。
    1. 为制备X-杜氏磷酸盐缓冲液（X-DPBS），配制含有0.2%（w/v）（终浓度）牛血清白蛋白（BSA）的DPBS溶液。使用0.2 µm滤器过滤溶液，并于4 °C保存。
    2. 为制备冷2-脱氧-D-葡萄糖（2dG）溶液，称取16.4 mg 2dG，溶于10 mL蒸馏水中，得到10 mM溶液。于4 °C保存。
    3. 将600 µL冷2dG溶液与6 µL放射性标记的[3H] 2dG加入5400 µL X-DPBS中，配制放射性标记的2dG（2dG*）溶液。
      注：终浓度为1 mM 2dG，比活性为1 µCi/mL。
      1. 取20 µL放射性标记的2dG*溶液作为分装样品（TC20），留作备用。
  3. 孵育混合液的制备
    1. 对于细胞松弛素B混合液，将2 µL 20 mM细胞松弛素B加入2 mL放射性标记的2dG*溶液中。
      注：细胞松弛素B储备液为10 mg/mL，溶于二甲基亚砜（DMSO）中。
    2. 对于DMSO混合液，将4 µL DMSO加入剩余的4 mL放射性标记的2dG*溶液中。

2. 人类原代肌肉细胞的培养

  1. 人肌肉卫星细胞接种于6孔板
    注意：使用本机构自制试剂（参见参考文献 24 有关详细信息）或从冻存管中获取的商品化人骨骼肌卫星细胞（含250,000个细胞）。以下操作步骤基于250,000个细胞，旨在获得单个实验条件下测定葡萄糖摄取所需的1块6孔板。
    1. 快速解冻实验室自制的冻存管24 或预温水中的商用人体肌肉卫星细胞制剂（37 °C直至小瓶中仅剩少量冰块。
    2. 直接倒入含有10 mL预热（37°C）培养基的50 mL塑料离心管中37 °C下午) PM.
    3. 离心5分钟，500 x g，弃去上清液。
    4. 轻轻重悬细胞沉淀，加入18 mL预热的PM培养基（以获得每3 mL培养基含42,000个细胞）。每孔加入3 mL细胞悬液至6孔板（9.6 cm²）的每个孔中。2).
      注意：需使用一个六孔板中的六个独立孔，以对以下条件下的葡萄糖摄取进行重复测定：被动转运抑制（第1和2孔）、基础速率（第3和4孔）以及胰岛素刺激速率（第5和6孔）。根据所需的不同处理条件，重复设置多个六孔板。
    5. 在标准培养条件下孵育（37 °C，5% CO2)直至细胞达到90%汇合度。
      注意：此步骤根据细胞批次不同，需要 48 - 72 小时。此期间不得更换培养基。
  2. 肌肉细胞的分化
    1. 移除PM（48–72小时后），并替换为预热的DM（每孔3 mL）。在 37 °C，5% CO2.
      注意：分化过程需要五天才能达到稳定状态，此时细胞排列整齐并呈现多核特征。通常，原代肌管细胞在含1 g/L葡萄糖的培养基中培养。因此，为避免培养过程中葡萄糖耗尽，应向培养板中加入3 mL培养基，以确保细胞始终获得充足的葡萄糖底物。
    2. 每两天更换一次DM培养基。
      注意：从此阶段起，肌管可保持稳定长达 7 天，且无明显变化，葡萄糖摄取测定可在任意时间进行。
  3. 肌肉细胞处理（可选）
    注意：原代肌管细胞可处理数天以诱导修饰（药物测试、信号通路的抑制剂/激活剂） 等等。在胰岛素刺激和葡萄糖摄取检测之前进行相应处理。肌肉细胞可接受任何可能影响胰岛素敏感性的处理，而葡萄糖摄取检测将量化该处理的影响。例如，用饱和脂肪酸棕榈酸盐孵育肌肉细胞可诱导胰岛素抵抗，导致细胞的胰岛素刺激性葡萄糖摄取减少。
    1. 制备12 mL DM培养基，添加10% BSA（无脂肪酸）和0.5 mL棕榈酸（PALM）；另制备12 mL DM培养基，仅添加10% BSA（无脂肪酸）。
    2. 按照第2.1和2.2节所述方法培养两块含有人原代成肌细胞的6孔板，并进行5天分化培养。
    3. 第5天，用2 mL PBS洗涤每个孔。向其中一块板加入含PALM的2 mL DM，向另一块板加入仅含BSA的2 mL DM。
    4. 孵育 48 h，温度为 37 °C，5% CO2.

3. 胰岛素刺激

  1. 用 2 mL PBS 将分化后的肌细胞洗涤两次。
  2. 小心吸除 PBS，并加入 3 mL 无 FCS 的 DM，于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 3 小时，进行血清饥饿处理。
  3. 将所有孔中的培养基更换为 3 mL 无 FCS 的 DM。向第 5 和第 6 孔中加入 100 nM 胰岛素。
  4. 将人成肌细胞培养物在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 1 小时。

4. 葡萄糖摄取

  1. 胰岛素刺激1小时后，用X-DPBS洗涤孔板两次（每次1 mL）。
  2. 向孔1和孔2中加入1 mL细胞松弛素B混合液，向孔3至孔6中加入1 mL DMSO混合液。孵育15分钟（37 °C，5% CO2）。孵育结束后，立即将培养板置于冰上。

5. 细胞裂解

  1. 用 1 mL 冰冷的 PBS 洗涤细胞两次。
  2. 每孔加入 600 µL 50 mM NaOH 裂解细胞。冰上孵育 5 分钟，并通过缓慢的轨道振荡轻轻混匀。
    注意：如果裂解液过于黏稠，可用最多 1.5 mL NaOH 稀释。
  3. 使用移液器重悬并收集细胞裂解液。

6. 放射性标记葡萄糖的测定

  1. 取每种细胞裂解液 400 µL 置于液体闪烁计数瓶中。准备一个阴性对照瓶，加入 400 µL 50 mM NaOH，另准备一个阳性对照瓶，加入 20 µL TC20（来自步骤 1.2.3.1）。
  2. 向每个计数瓶中加入 4 mL 液体闪烁液。盖紧瓶盖并充分混匀（1–2 秒）。
  3. 将每个计数瓶放入液体闪烁计数器中，按照仪器制造商的说明测定放射活性。记录每个计数瓶 10 分钟内的每分钟计数（CPM）。
    注意：CPM = “每分钟衰变数” × “计数效率”。

7. 葡萄糖摄取速率

  1. 使用剩余的裂解液（200 µL；来自步骤 5.2）测定蛋白质浓度。采用 Bradford25 法或等效方法测定每种细胞裂解液的蛋白质浓度。计算每个孔中的总蛋白量（Q），单位为 mg。
  2. 为获得 TC1（每 1 µL 放射性标记的 2dG* 的计数值），将 TC20 的 CPM 值除以 20。
  3. 对每个试管，按以下公式计算葡萄糖摄取速率：
    静态平衡公式 R 计算；用于科研分析的数学方程示意图
    注意：R 的单位为 pmol/mg/min。1–2 孔 R 的平均值表示被动转运速率 Rp；3–4 孔 R 的平均值表示基础总转运速率 Rbt；5–6 孔 R 的平均值表示胰岛素刺激下的总转运速率 Rit。
    1. 按以下公式计算基础主动转运速率（Rba）：
      静态平衡方程，公式：Rba = Rbt - Rp，受力分析示意图
    2. 按以下公式计算胰岛素刺激下的主动转运速率（Ria）：
      相对强度调整方程，\( R_{ia} = R_{it} - R_{p} \)，用于数据分析
      注意：在胰岛素响应性细胞（如肌管细胞）中，葡萄糖摄取速率通常用三个值表示：Rba、Ria 及胰岛素刺激倍数 Ria/Rba。

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结果

第3天，成肌细胞达到汇合状态（图1A）。此阶段的成肌细胞通常为单核。更换培养基后，至第8天完成分化（图1B）（实验方案第2节）。分化5天后，肌管排列整齐，通常呈多核状态。人原代肌管在测定葡萄糖摄取速率前，分别接受棕榈酸或仅含牛血清白蛋白（BSA）的处理。细胞分别在含0.5 mM棕榈酸的BSA溶液（PALM）或仅含BSA（BSA）中孵育48小时。随后进行胰岛素刺激（实验方案第3节）并测定葡萄糖摄取量（实验方案第4节）。图2展示了对照条件（BSA）与处理条件（PALM）下的葡萄糖摄取速率。在加入细胞松弛素B的肌管中测定非特异性摄取量。可比较BSA和PALM条件下基础状态及胰岛素刺激下的葡萄糖摄取速率。在BSA条件下，胰岛素显著增加葡萄糖转运（p <0.01）。经PALM处理的肌管中，胰岛素刺激的葡萄糖摄取速率显著降低（p <0.05）。此外，人肌管细胞对胰岛素的反应也可表示为倍数变化。<...

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讨论

葡萄糖摄取是检测细胞培养中激活剂或抑制剂对葡萄糖利用以及细胞对胰岛素反应能力的关键生物学指标。本文所述方法已被证明快速可靠，已广泛应用于多项研究，涉及来自健康受试者和/或代谢异常患者的原代肌管细胞6,7,10,12,21,26,27,36,37使用一块6孔板即可对总基础转运、基础主动转运和胰岛素刺激的主动转运分别进行重复测定。这三个数值可全面描述细胞的胰岛素敏感性 体外 培养的肌细胞

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢里昂-南医院放射生物学科的Anne Charrié以及瑞士国家科学基金会（FNS）提供的资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
人原代肌细胞自备人骨骼肌活检组织制备自备人骨骼肌活检组织制备若无法自备，可使用商业来源
人原代肌细胞PromocellC-12530需使用配套培养基 C23060 和 C23061 进行培养
6 孔板Corning356400BioCoat I 型胶原多孔板
Ham's F10DutscherL0145-500含 1 g/L 葡萄糖
谷氨酰胺DutscherX0551-100
青霉素/链霉素 100 倍浓缩液Thermo Fisher Scientific15140122
血清替代物 Ultroser GPall France15950.017文中称为血清替代物
DMEM 低糖培养基DutscherL0064-500含 1 g/L 葡萄糖
胎牛血清EurobioCVFSVF00-01
杜氏磷酸盐缓冲液（含钙镁）DutscherL0625-500含 Mg2+ (0.5 mM) 和 Ca2+ (0.9 mM)
人胰岛素溶液Sigma-AldrichI9278
2-脱氧-D-葡萄糖 Sigma-AldrichD6134
牛血清白蛋白Euromedex04-100-812-E
无脂肪酸 BSARoche10,775,835,001
棕榈酸盐Sigma-AldrichP0500
脱氧-D-葡萄糖，2-[1,2-3H (N)]PerkinElmerNET328A001MC比活性：5 - 10 Ci (185-370 GBq)/mmol，1 mCi (37 MBq)
细胞松弛素 BSigma-AldrichC2743
PICO PRIAS 小瓶，6 mLPerkinElmer6000192
Ultima Gold MW CA PerkinElmer6013159闪烁液
bêta 计数器 PerkinElmer2900TR

参考文献

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放射性标记2-脱氧-D-葡萄糖细胞松弛素B混合物液体闪烁计数肌细胞分化胰岛素敏感性检测基础葡萄糖转运胰岛素刺激的摄取
葡萄糖摄取测量及对胰岛素刺激的反应在 体外 培养的人原代肌管细胞
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