唾液酸是糖缀合物中常见的一种单糖单元，参与多种分子和细胞间的相互作用。本文介绍一种利用代谢性糖工程修饰细胞表面唾液酸表达的方法， N乙酰甘露糖胺衍生物
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本文内容
摘要
摘要
唾液酸（Sia）是糖缀合物（如N-和O-聚糖或糖脂）中一种极为重要的组成成分。由于其位于寡糖和多糖的非还原末端，并具有独特的化学特性，唾液酸参与了多种不同的受体-配体相互作用。通过修饰细胞表面唾液酸的表达，可进而影响依赖于唾液酸的相互作用。这种方法有助于研究唾液酸依赖性相互作用，并可能以有益的方式影响某些疾病的发展。通过代谢性糖工程（MGE）技术，可以调控细胞表面唾液酸的表达。该方法通过使用C2位修饰的N-乙酰甘露糖胺（ManNAc）衍生物处理细胞、组织甚至整个动物来实现。这些氨基糖作为唾液酸的前体分子，在细胞内被代谢为相应的唾液酸种类，并表达于糖缀合物上。应用该方法可在多种生物学过程中产生引人注目的效应。例如，它可显著降低 经处理神经元细胞中多聚唾液酸（polySia）的表达，从而影响神经元的生长与分化。本文展示了两种最常见的C2位修饰的N-酰基甘露糖胺衍生物——N-丙酰基甘露糖胺（ManNProp）和N-丁酰基甘露糖胺（ManNBut）的化学合成方法，并进一步说明如何在细胞培养实验中应用这些非天然氨基糖。修饰型唾液酸的表达水平通过高效液相色谱法（HPLC）进行定量，并结合质谱分析进一步确认。对多聚唾液酸表达的影响则通过使用商业化多聚唾液酸抗体进行蛋白质印迹（Western blot）分析加以阐明。
引言
唾液酸是一种单糖，通常存在于糖缀合物的非还原末端，例如N-和O-聚糖或糖脂。在所有单糖中，唾液酸具有一些独特的化学特性：它具有9个碳原子的骨架结构，C-1位上有一个羧基，在生理条件下该羧基发生去质子化而带负电荷，C-5位上则含有一个氨基。尽管迄今为止已鉴定出50多种天然存在的唾液酸变异体1，但在人类中最主要的唾液酸形式是N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）。其他哺乳动物还表达较大量的N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc）2,3。
由于唾液酸在糖缀合物中处于暴露位置，因此参与了大量受体-配体相互作用，例如流感病毒血凝素依赖性的与宿主细胞的结合4。一种具有重要生物学功能的唾液酸表位是多聚唾液酸，尤其在胚胎发育及神经系统中发挥关键作用。多聚唾液酸是由多达200个α2,8-连接的唾液酸组成的聚合物。多聚唾液酸的主要蛋白载体是神经细胞黏附分子（NCAM）。多聚唾液酸的表达可调节NCAM的黏附特性，其表达会降低细胞黏附性，并增强神经系统的可塑性5。
（多）唾液酸表达水平的变化最终会影响多种不同的....
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方案
1. 缓冲液和试剂的制备
- 3 mM 甲醇钠溶液的制备
- 在装有搅拌子的 100 mL 玻璃瓶中，将 8.1 mg 甲醇钠溶于 50 mL 甲醇（3 mM）。室温（RT）下可保存数周。
- Tris-HCl 缓冲液的制备
- 在装有搅拌子的 100 mL 玻璃瓶中，加入 8.766 g NaCl、157 mg Tris-HCl 和 146 mg EDTA，加 80 mL 水溶解。
- 在搅拌过程中，使用 pH 计监测 pH 值，逐滴加入氢氧化钠（1 M，水溶液）或盐酸（20%，水溶液），调节 pH 至 8.0。
- 加水定容至 100 mL，使用 0.22 µm 无菌滤器过滤溶液。
注：100 mL Tris-HCl 缓冲液终浓度为 150 mM NaCl、10 mM Tris-HCl 和 5 mM EDTA（pH 8.0）。该溶液可在 4 °C 下保存数周。
- 抑肽酶溶液的制备
- 将 10 mg 抑肽酶溶于 1 mL 水中（1.54 mM）。分装至 10 个 1.5 mL 塑料管中（每管 100 µL）。-20 °C 保存数周。
- 亮抑蛋白酶肽....
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结果
荧光标记的Neu5Ac和Neu5Gc标准品的高效液相色谱图如图2所示。采用本文所述方法，DMB标记的Neu5Gc通常在7 - 9分钟的洗脱时间内出峰，而DMB-Neu5Ac则在10 - 12分钟之间出峰。色谱图中通常在2 - 6分钟之间出现若干较小的峰，这些峰代表未反应的DMB及反应中间产物25。
图3展示了细胞裂解液的代表性色谱图。与DMB标记的标准品色谱图（图2）相比，这些色谱图中可见多个未定义的峰。这很可能是因为细胞裂解液本身存在内源性杂质，以及DMB不仅与唾液酸种类反应，还与细胞裂解液中存在的其他α-酮酸（如丙酮酸、琥珀酸和α-酮戊二酸）发生反应所致26。此外，也可能存在少.......
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讨论
如果通过质谱分析化学合成的 ManNAc 衍生物 ManNProp 和 ManNBut，应仅检测到两种样品正确的质荷比峰。因此，可认为产物纯度超过 99%。在裂解细胞的膜组分中可检测到少量通常不存在于人类细胞中的 Neu5Gc29。这很可能通过一种补救途径实现，该途径从培养基中胎牛血清的唾液酸糖缀合物中回收 Neu5Gc30。使用唾液酸生物合成的天然前体 ManNAc 处理细胞，可显著降低细胞表面 Neu5Gc 表位的表达。
迄今为止，在所有被研究的细胞中，修饰型甘露糖胺的应用几乎无毒性。细胞能够耐受培养基中较高毫摩尔浓度的糖类，这是必要的，因为目前尚无特异性的N-酰基甘露糖胺转运蛋白。已有研究表明，N-酰基甘露糖胺的应用可激活信号转导通路，这可能影响细胞的生长或分化31,32。但这种效应究竟是由于唾液酸化模式的改变，还是反映了对修饰型.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 L. D. Nguyen 对手稿的校对以及富有成效的讨论。此外，感谢 J. Dernedde 和 H. G. Nguyen 协助我们准备视频拍摄工作。视频的大部分场景是在 R. Tauber 的实验室中拍摄完成的。我们还感谢马克斯·普朗克胶体与界面研究所向我们免费开放其质谱设施。RH 得到了德国研究基金会（DFG）（ProMoAge 项目）的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞 | Sigma-Aldrich | 92110411 | |
| RPMI 培养基 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| 75 ml 组织培养瓶 | Greiner | 690175 | |
| 48 孔板 | Corning | 3548 | |
| 胎牛血清（FCS） | PAA | A15-102 | |
| 青霉素-链霉素溶液（Pen/Strep） | Gibco | 15140-122 | |
| 胰蛋白酶 | Gibco | 15400-054 | |
| EDTA | Roth | X986.1 | |
| Tris | Serva | 37190.03 | |
| SDS | Roth | 2326.2 | |
| SDS-PAGE 电泳设备（电泳槽、玻璃器皿等） | VWR | SDS Gel/Blot | |
| 丙烯酰胺 | Roth | 3019.1 | |
| 蛋白分子量标准 | Fisher Scientific | 267620 | |
| 硝酸纤维素膜 | GE Healthcare | 10600002 | |
| 丽春红（Ponceau red） | Roth | 5938.2 | |
| 脱脂奶粉 | Roth | T145.3 | |
| 化学发光试剂（ECL） | Millipore | WBLUF 0500 | |
| 0.5 ml 离心过滤管，含 3 kDa 超滤膜 | Merck-Millipore | UFC500324 | |
| 15 mL 离心管 | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS430791-500EA | |
| 2-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
| 2-丙醇 | Sigma-Aldrich | 34965-1L | HPLC 梯度级 |
| 4,5-亚甲二氧基-1,2-苯二胺二盐酸盐 | Sigma-Aldrich | D4784-50MG | |
| 48 孔平底组织培养板 | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS3548-100EA | |
| 50 mL 离心管 | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS430829-500EA | |
| 乙腈 | Sigma-Aldrich | 34967-1L | HPLC 梯度级 |
| 牛肺抑肽酶（Aprotinin） | Sigma-Aldrich | A1153-10MG | 冻干粉末，3-8 TIU/mg 固体 |
| 丁酰氯 | Sigma-Aldrich | 109614-250G | |
| C18 反相色谱柱 | Phenomenex | 00F-4435-E0 | 110 Å, 3 µm 粒径，4.6 x 150 mm |
| D-甘露糖胺盐酸盐 | Sigma-Aldrich | M4670-1G | |
| 杜尔贝科磷酸盐缓冲液（Dulbecco's Phosphate Buffered Salt Solution） | PAN Biotech | P04-36500 | |
| 乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic acid） | Sigma-Aldrich | E9884-100G | |
| 甲酸 | Sigma-Aldrich | 56302-50ML-GL | |
| 盐酸溶液 | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | 36.5-38.0%，溶于水 |
| 亮抑蛋白酶肽（Leupeptin） | Sigma-Aldrich | L2884-10MG | |
| 甲醇 | Carl-Roth | T169.2 | HPLC 梯度级 |
| N-乙酰-D-甘露糖胺 | Sigma-Aldrich | A8176-250MG | |
| N-乙酰神经氨酸 | Sigma-Aldrich | A0812-25MG | |
| N-羟乙酰神经氨酸 | Sigma-Aldrich | G9793-10MG | |
| 苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride） | Sigma-Aldrich | P7626-250MG | |
| 丙酰氯 | Sigma-Aldrich | P51559-500G | |
| 避光安全锁扣管，1.5 mL，棕色（避光） | Eppendorf | 30120191 | |
| 安全锁扣管，1.5 mL，无色 | Eppendorf | 30120086 | |
| 亚硫酸氢钠溶液 | Sigma-Aldrich | 13438-1L-R-D | 40%，溶于水 |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | 746398-500G-D | |
| 氢氧化钠 | Sigma-Aldrich | 795429-500G-D | |
| 氢氧化钠溶液 | Sigma-Aldrich | 319511-500ML | 1.0 M，溶于水 |
| 甲醇钠 | Sigma-Aldrich | 164992-5G | |
| 三氟乙酸 | Sigma-Aldrich | T6508-100ML-D | |
| Tris 盐酸盐 | Sigma-Aldrich | T5941-100G | |
| 含 0.25% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA 的 PBS 溶液 | PAN Biotech | P10-019100 | |
| 水 | Carl-Roth | T905.1 | HPLC 梯度级 |
| 硅胶 60 | Carl-Roth | 9779.1 | |
| 高效液相色谱仪（HPLC） | Agilent | ||
| 电喷雾离子化质谱系统（ESI-MSD-System） | Agilent |
参考文献
- Angata, T., Varki, A. Chemical diversity in the sialic acids and related alpha-keto acids: An evolutionary perspective. Chem Rev. 102, 439-469 (2002).
- Schauer, R., Schoop, H. J., Faillard, H. On biosynthesis of glycolyl group of N-glycolylneuraminic acid. oxidation of N-acetyl group to glycolyl group. Hoppe-Seylers Zeitschrift Fur Physiologische Chemie.
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重印与许可
