本方案详细描述了一种用于长期培养的实验方法 离体 培养与活体成像 果蝇 成虫盘。该方法可在眼盘活体成像的10小时期间内，展示光感受器的分化及小眼的旋转。该实验方案简单，且无需昂贵的设备。
本文内容
摘要
摘要
活体成像技术能够实时连续追踪动态的细胞和发育过程。Drosophila 幼虫的成虫盘已被广泛用于研究多种生物学过程，例如细胞增殖、分化、生长、迁移、凋亡、细胞竞争、细胞间信号传导以及区室边界形成。然而，尽管已有诸多尝试，目前仍缺乏令人满意的长期ex vivo培养及成虫盘活体成像方法。近期，我们建立了一种可实现长达18小时的成虫盘长期ex vivo培养与活体成像的技术。该方法除了在培养基中使用高浓度胰岛素外，还采用低熔点琼脂糖包埋成虫盘，以防止其在成像过程中发生漂移。本报告以眼-触角成虫盘为例进行说明。通过追踪光感受器R3/4特异性的mδ0.5-Gal4表达，证明在10小时的活体成像过程中可清晰观察到光感受器的分化及小眼的旋转过程。本文详细描述了这一简便方法的操作流程。
引言
Drosophila 幼虫的成虫盘是研究多种生物学机制的常用实验体系。这些成虫盘从胚胎上皮内陷形成，发育为由两层上皮结构组成的囊状组织，即围膜上皮（Peripodial Epithelium, PE）和成虫盘本体（Disc Proper, DP）1,2。成虫盘细胞在幼虫期和蛹期持续增殖并逐步分化，最终发育为成体的各类结构。由于成虫盘具有扁平且简单的双层结构，从幼虫中解剖后易于观察。然而，尽管多个研究团队进行了诸多尝试，目前仍缺乏理想的成虫盘长期培养方法。我们近期开发出一种培养技术，可维持多个成虫盘正常发育长达18小时，并支持活体成像3。该培养方法能够支持细胞分化与迁移，但仅能维持细胞增殖7–12小时，且无法支持成虫盘的整体生长。培养基中的主要差异在于含有高浓度的胰岛素3。该方法操作简便，无需特殊供氧或培养基循环装置。
在所有研究最为深入的成虫盘中，眼-触角盘是其中之一。Drosophila 的复眼由大约800个小眼组成。每个小眼包含八个感光细胞（R1-R8）。在幼虫期的眼盘中，感光细胞随着形态发生沟（MF）从前向后扫过眼盘而依次分化4,5。一个小眼内的感光细胞按特定顺序分化，首先为R8，随后是R2/R5、R3/R4、R1/R6，最后是R76。眼盘背侧和腹侧的小眼会朝相反方向旋转90°，从而形成相反的手性7,8。该旋转过程分为两个阶段：第一阶段为45°旋转，始于形态发生沟后方第六排小眼并在此完成；第二阶段另45°旋转则在约第16排完成9,10。本研究利用R3/4特异性的mδ0.5-Gal411标记小眼旋转，以展示通过该方法培养并活体成像眼盘所能观察到的正常细胞分化与动态过程。
方案
1. 实验前准备
- 收集在 mδ0.5-Gal4 驱动下表达核定位绿色荧光蛋白（GFP）的果蝇卵，并在 25 °C 下培养 5 天。
- 将 0.7 g 低熔点琼脂糖溶于 10 mL 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）中，微波加热至琼脂糖完全溶解。将 0.7% 的低熔点凝胶置于 37 °C 培养箱中备用。
- 使用 70% 乙醇对所有器械进行灭菌处理，包括镊子、剪刀、42 mm × 0.17 mm 盖玻片、9 孔玻璃凹面载片以及磁性培养室，灭菌时间不少于 12 小时。
- 配制培养基3：在 Schneider's Drosophila 培养基中添加 2% 胎牛血清（FBS）、0.5% 青霉素-链霉素和 1.25 mg/mL 胰岛素。为避免污染，应在细胞培养超净台中配制培养基。配制好的培养基储存于 4 °C，一个月内使用完毕。
- 开始解剖操作前，用 70% 乙醇清洁解剖平台和实验人员的手部。
2. 椎间盘解剖
- 将所有设备用70%乙醇处理后自然晾干。
- 从果蝇培养瓶中选取一只三龄幼虫。为避免来自培养瓶的污染，用1×PBS清洗幼虫3次以去除排泄物。
- 在解剖显微镜下，于9孔玻璃培养板的一个孔中加入1 mL培养基（室温），并在其中解剖已清洁的幼虫。
- 用一对镊子夹住幼虫后端约三分之一处，另一对镊子夹住口钩，将两对镊子向相反方向拉扯，以释放内部组织。
- 去除附着在口钩上的眼脑复合体周围的唾液腺、脂肪体和表皮。如果腹神经索仍与组织相连，用剪刀将其剪除。
- 用一对镊子夹住口钩，另一对镊子去除连接大脑与眼原基的背部组织。
注意：如果不去除该组织，两个眼-触角原基将紧靠在一起并贴近大脑，导致眼原基无法平展贴附于盖玻片上，因为该组织、大脑和眼-触角原基会形成一个三角结构。 - 将整个复合体旋转至腹面朝上的位置，并切除连接口钩或原基与大脑的细丝状结构。
注意：如果不切除该细丝，当去除口钩时，眼-触角原基会分裂成两部分。- 小心去除口钩，注意在此过程中不要损伤眼原基。
注意：此时眼原基已完全游离于培养基中，仅通过视柄与大脑相连。
- 小心去除口钩，注意在此过程中不要损伤眼原基。
3. 封片
- 将培养室组件晾干，并用一块 42 mm × 0.17 mm 的盖玻片组装。在盖玻片中央贴附双层O型圈，用于固定琼脂糖。
- 将带盖玻片的培养室组装好。将 42 mm × 0.17 mm 的盖玻片放置在载物台卡槽上。将硅胶O型圈置于盖玻片上，再放上底座。锁紧密封锁扣，并盖上盖子（图1）。
- 使用配有 10–200 µL 吸头的 20 µL 微量移液器，小心地将解剖好的眼-脑复合体转移至O型圈中心。
- 吸除大部分培养基，并向样品中加入 12 µL 0.7%低熔点琼脂糖（37 °C）。
注意：在琼脂糖凝固前，可用镊子调整眼盘的位置。琼脂糖将在5分钟内凝固。- 在O型圈中心加入1 mL室温培养基；每个O型圈最多可加载4个样品。确保琼脂糖与O型圈粘附牢固，以防止样品漂移。
注意：无需对培养基进行通气或循环处理。
- 在O型圈中心加入1 mL室温培养基；每个O型圈最多可加载4个样品。确保琼脂糖与O型圈粘附牢固，以防止样品漂移。
4. 共聚焦显微镜
- 将培养腔置于倒置共聚焦显微镜载物台上，平衡温度30分钟，以防止成像过程中出现Z轴漂移。
- 在进行长期活体成像前，通过微分干涉差显微镜检查组织是否完整。
- 为避免光毒性，激光功率应低于2 mW。使用40倍物镜进行成像。
- 以1 µm光学间隔，在12分钟内采集62 µm的Z轴层扫图像。在总共10小时内完成40个扫描循环。确保每个循环包含12分钟成像和3分钟静置。
结果
在此示例中，使用 mδ0.5-Ga4 标记 R3/R4 光感受器以监测光感受器的分化。mδ0.5-Ga4 在 R4 中驱动强表达，在 R3 中驱动弱表达11，使其成为R3和R4细胞以及小眼旋转过程的优良标记。 视频 1，R3和R4标记为GFP。在10小时活体成像过程开始时，存在8排小眼簇图 2A 和 视频 1）以及末端的14排小眼簇图 2B）。小眼分化速率为每行1.67小时，接近1.5–2小时/行的速率 体内 圆盘 7,8,9,10,11,12,13,14根据R3和R4的相对位置，小眼发生旋转 离体 活体成像期间培养的培养皿图2A'、A''、B'和B''）。一个R3/R4簇在第一帧中用白色球体标记 视频 2在初期，R3/R4轴似乎与赤道垂直（图 2C 和 视频 2。随后似乎发生旋转 15°, 30°，以及 45° 在 3 (图 2C'), 6 (图 2C''），以及 9（图 2C''') h，分别。该数据表明，此方法可在10 h的活体成像过程中维持感光细胞的分化。
图1：腔室组件示意图。 腔室组件的示意图：（1）将带有双层O型圈的盖玻片放置在载物台接收器上。（2）将硅胶O型圈置于盖玻片上。（3）放置底座。（4）锁紧密封锁。（5）将样品加载至O型圈中心位置，然后盖上盖片。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：R3/R4细胞分化与旋转的活体成像。 使用表达核定位GFP的mδ0.5-Gal4标记R3/R4细胞，进行10小时的活体成像。所有图像均来自视频1。（A）成像开始时的图像。（A'-A"）左侧（A'）和右侧（A"）方框区域的放大图像。（B）10小时成像结束时的图像。（B'-B"）左侧（B'）和右侧（B"）方框区域的放大图像。（C-C'''）通过时间追踪一对R3/R4细胞（在A'中用箭头标示），以展示R3/R4细胞对的旋转过程。比例尺在A、B和C中分别为15 µm、10 µm和5 µm。所有图像均为最大强度z投影图像。时间尺度以小时:分钟表示。请点击此处查看该图的放大版本。
视频 1： 请点击此处下载该视频。
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讨论
本研究提供了一项关于果蝇（Drosophila）成虫盘长期活体成像实验的详细方案。我们花费了大量时间练习精细的解剖操作，以避免损伤成虫盘，并确保组织能够紧贴盖玻片附着。我们尝试使用多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine, PLL）和低熔点琼脂糖来固定组织，最终发现低熔点琼脂糖在固定组织方面效果更佳。尽管本文仅以眼盘为例，展示了在10小时活体成像期间感光细胞分化及小眼旋转的正常发生过程，但此方法也可应用于其他类型的成虫盘，例如翅盘，这一点已在先前的研究中得到证实3。此外，培养基的配制和活体成像系统的搭建过程简便，无需通气或培养基循环装置。
连续活体成像可提供清晰的生物学事件时间序列。在我们先前关于眼盘中胶质细胞分化与迁移的研究报告中，我们提供了直接证据，证明包裹性胶质细胞在迁移至眼盘前部后，由已存在的胶质细胞分化而来3。长期的体外培养（ex vivo）可实现对细胞的特异性激光标记，例如通过光转化KAEDE荧光蛋白，以追踪其行为动态3。该方法还可用于直接向培养基中添加化学物质进行测试，因此可作为药物筛选平台。由于某些动态过程发生在数分钟甚至数秒内，因此需要高时间分辨率。为提高时间分辨率，光片显微镜15,16或转盘共聚焦显微镜17可能是理想选择。
目前的培养条件并不理想，无法支持椎间盘生长，细胞增殖仅能维持不超过12小时。312小时后 离体 培养过程中，感光细胞分化速率开始下降3这可能是由于缺乏某些营养物质或激素所致。由于该培养基的主要差异在于高浓度的胰岛素，因此哺乳动物胰岛素可能部分模拟了内源性胰岛素样肽的功能。添加果蝇提取物、昆虫血糖物质海藻糖以及不同浓度的蜕皮激素20-羟基蜕皮酮均未产生有益效果。3然而，12–18 小时的培养时间已足以研究多种发育过程。已有研究对培养幼虫成虫盘的替代培养方法进行了比较。3，我们的培养和成像条件为活体成像提供了最长的时间窗口和最清晰的视野。尽管可以直接对活体幼虫和蛹中的碟状组织进行成像18,19,20,21,22，观察的分辨率和时间窗口有限。晚期幼虫和蛹期的成虫盘可进行长时间培养23,24，但这些碟状结构会经历显著的形态发生。为了利用扁平的二维幼虫碟状结构，我们的培养与成像方法是目前最佳的解决方案。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢许春兰和杨玉琪在果蝇食物制备及果蝇品系保种方面的工作，感谢李素萍以及中央研究院分子生物研究所影像核心实验室在共聚焦显微镜使用方面的帮助。本研究得到了中华民国国家科学委员会和科技部对Y.H.S.的资助（项目编号：NSC 101-2321-B-001 -004、NSC 100-2321-B-001 -012、NSC 102-2321-B-001 -002、MOST 103-2311-B-001 -035 -MY3）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 低熔点琼脂糖 | AMRESCO | 0815-25G | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | AMRESCO | 0780-2PK | |
| 42 mm × 0.17 mm 盖玻片 | PST | G401-42 | |
| Schneider’s Drosophila 培养基 | Thermo | 21720-024 | |
| 胎牛血清（FBS） | Sigma | F9665 | |
| 青霉素-链霉素 | GIBCO | 759 | |
| 胰岛素 | Sigma | I9278 | |
| 培养室 | PECON | POC-R2 细胞培养系统 | |
| 40X 物镜 | C-Apochromat 40X/1.2W Korr 物镜 | ||
| 果蝇品系：nls.GFP | Bloominggton | 4775 |
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