本文介绍了一种使用石英针在啮齿类动物脑内进行显微注射的实验方案。这些石英针不会产生可检测到的组织损伤，并能确保即使在深层脑区也能实现可靠的递送。此外，石英针可根据研究需求进行个性化设计，并可重复使用。
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本文内容
摘要
摘要
长期以来，微量注射已被用于将药物或毒素递送至特定脑区，而近年来，该技术也被用于递送基因或细胞治疗产品。然而，目前的微量注射技术通常使用钢针或玻璃针，由于多种原因其性能并不理想：特别是钢针可能造成组织损伤，而玻璃针在深入脑组织时可能发生弯曲，导致无法准确到达目标区域。本文介绍了一种制备和使用石英针的实验方案，此类针具具备多项有利特性。这些石英针不会产生可检测到的组织损伤，且由于其极高的刚性，即使在使用较深坐标时也能确保将物质可靠地递送至目标脑区。此外，可通过制作特定直径的多个出液孔，实现针头设计的个性化定制。多个出液孔有助于在较大区域内注入较大量的溶液，而较大的出液孔则有利于细胞的注射。另外，这些石英针可清洗并重复使用，从而使实验过程更具成本效益。
引言
长期以来，微量注射已被用于递送药理学活性化合物，以调控特定脑区的神经元活动。此外，微量注射还被用于在特定神经元群体附近注射毒素，以模拟某些疾病特征性的神经退行性病变，例如在黑质-纹状体多巴胺系统中注射6-羟基多巴胺以模拟帕金森病1,2，或使用免疫毒素192 IgG皂苷蛋白（saporin）损毁胆碱能系统3。近年来，微量注射技术还被用于递送病毒载体或细胞移植物，以开展实验性脑部疾病的基因治疗或细胞治疗4,5。
在这些研究中使用的经典型针头由不锈钢制成。尽管钢针使用方便且实用，但仍存在一些问题6：它们相对较大，可能造成组织损伤，导致血脑屏障渗漏和星形胶质细胞活化；此外，还可能产生进入针头的脑组织芯样物，形成阻碍，甚至完全阻止目标溶液的流动。最近，制备的玻璃针 临时的 从毛细血管中提取的方法已被引入使用7,8这些电极不会引起明显的组织损伤或星形胶质细胞活化，但相对柔韧，在植入深部结构时可能发生弯曲，从而降低定位的准确性（个....
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方案
所有实验方案均经费拉拉大学动物实验伦理委员会和意大利卫生部批准。本研究遵循ARRIVE（动物研究：活体实验报告11）指南。
1. 石英针的制备
- 将石英毛细管（参见材料表）依次在蒸馏水中浸泡5分钟、99%乙醇中浸泡5分钟、二乙醚中浸泡5分钟，以进行清洁和灭菌。
- 将毛细管置于通风橱中至少1小时，使其完全干燥。
- 使用激光拉制仪根据具体需求设定参数，制备针头，以获得足够长且足够细的针头。
注：我们使用激光拉制仪（参见材料表）。采用双行程序进行拉制。第一行使用高功率、最大扫描长度（对应于FILAMENTS VALUE）且不施加拉力。该参数组合可使毛细管最大部分熔化并以最低延伸速度成形，从而形成具有较长长度、较大内外径和较短针柄的针头。通过这种方式，针头可保持较高的机械强度和较大的内径，允许干细胞或病毒颗粒顺利通过而不发生堵塞。该程序行的速度和延迟应确保在针尖变得过细过长之前停止延伸，以免偏离所需的机械性能和形状特征。第二行拉制程序在石英冷却后（5秒）自动执行。功率、灯丝和拉力参数应能切割出尽可能短的针尖长度和陡峭的针柄，避免两根针头在分离时发生针尖断裂。通常情况下，使用我们的设备时采用以下参数：(a) 第一行 = 功率990，灯丝5，速度130，延迟110，拉力0；(b) 第二行 = 功率970....
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结果
我们比较了使用石英针（60 µM 外径尖端；一个 20 µM 直径的侧孔；C 型，图 1）与两种经典的 26 G 钝头和 30 G 斜面边缘不锈钢针在大鼠背侧海马体和纹状体内直接微注射所诱导的组织损伤。为此，我们分别使用石英针和钢针在左右侧背侧海马体和纹状体内注射 2 µL aCSF，并在注射后 48 小时通过苏木精-伊红（HE）染色评估组织损伤。我们选择在注射后的早期时间点进行观察，以更清晰地评估不同针头产生的急性机械性损伤（随着时间推移，组织修复机制可能会掩盖初始损伤）7。
按照上述方案操作，石英针未产生任何可检测到的损伤，仅留下几乎无法察觉的针道，而通过26 G钢制钝头针注射的脑区则表现出明显的损伤图3）。30 G 的斜面角度（30 °）不锈钢针在纹状体中诱导的脑损伤范围较小，但清.......
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讨论
本文所述技术满足了引言中提出的优化显微注射的需求，该技术可用于多种目的12。本文描述的针头将损伤降至最低，几乎达到无法检测的水平；与容易弯曲的玻璃针头不同，石英针头具有良好的刚性，即使在深部脑区坐标下也能可靠地靶向目标脑区。此外，侧孔设计可确保在针尖插入脑组织过程中发生堵塞时，溶液仍能顺利递送。
局限性与替代方案。由于石英毛细管熔点较高，无法在常规拉制仪上进行拉制，i.e.，需要使用昂贵的设备。玻璃毛细管在避免对组织造成损伤方面具有同等优势，但在向深层结构注射时可靠性较低，且更易碎裂（i.e.，在设计灵活性方面较差）。然而，如果目标是向皮层或背侧海马等浅表结构注射，且无需制作多个孔洞（以避免增加针头断裂的风险），则玻璃针无疑是一种有效且经济的替代选择。
石英针和玻璃针的一个局限性是，它们无法像与导管套管连接的不锈钢针那样，在不同时间点进行多次注射。因此，对于这些应用，不锈钢针仍.......
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披露
作者无任何利益冲突披露。
致谢
本工作获得了欧洲共同体资助[FP7-PEOPLE-2011-IAPP 项目 285827（EPIXCHANGE）]。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 石英毛细管 | Sutter Instruments, Novato, CA USA | Q100-50-10 | 无纤维丝 |
| 拉针仪 | Sutter | P2000 | |
| 微量移液器储存罐 | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | E210 | |
| 激光显微切割系统 | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | LMD6500 | |
| 哈密尔顿注射器 | Hamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, StŸtzerbach, Germany | 19138-U | |
| 微输注泵 | Univentor, Zejtun, Malta | Model 864 | |
| 手动显微注射泵套件 | WPI | Item#: MMP-KIT | 该套件可将微量移液器牢固安装至立体定位仪框架上 |
| 精密钻机 | Proxxon | 28510 MicroMot 50/E | 带滚珠轴承驱动轴，可调转速 |
| 人工脑脊液 | Tocris | 3525 | |
| 26 G钝头针和30 G斜面针 | Hamilton | 26 G Blunt: 19138-U 30 G Bevel: 20757 | |
| 切片机 | Leica, Germany | LEICA RM212RT |
参考文献
- Kirik, D., Rosenblad, C., Björklund, A. Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat. Exp Neurol. 152 (2), 259-277 (1998).
- Paolone, G., Brugnoli, A., Arcuri, A., Mercatelli, D., Morari, M.
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重印与许可
