用于啮齿类动物脑部显微注射的个性化针头

摘要

本文介绍了一种使用石英针在啮齿类动物脑内进行显微注射的实验方案。这些石英针不会产生可检测到的组织损伤，并能确保即使在深层脑区也能实现可靠的递送。此外，石英针可根据研究需求进行个性化设计，并可重复使用。

摘要

长期以来，微量注射已被用于将药物或毒素递送至特定脑区，而近年来，该技术也被用于递送基因或细胞治疗产品。然而，目前的微量注射技术通常使用钢针或玻璃针，由于多种原因其性能并不理想：特别是钢针可能造成组织损伤，而玻璃针在深入脑组织时可能发生弯曲，导致无法准确到达目标区域。本文介绍了一种制备和使用石英针的实验方案，此类针具具备多项有利特性。这些石英针不会产生可检测到的组织损伤，且由于其极高的刚性，即使在使用较深坐标时也能确保将物质可靠地递送至目标脑区。此外，可通过制作特定直径的多个出液孔，实现针头设计的个性化定制。多个出液孔有助于在较大区域内注入较大量的溶液，而较大的出液孔则有利于细胞的注射。另外，这些石英针可清洗并重复使用，从而使实验过程更具成本效益。

引言

长期以来，微量注射已被用于递送药理学活性化合物，以调控特定脑区的神经元活动。此外，微量注射还被用于在特定神经元群体附近注射毒素，以模拟某些疾病特征性的神经退行性病变，例如在黑质-纹状体多巴胺系统中注射6-羟基多巴胺以模拟帕金森病^1,2，或使用免疫毒素192 IgG皂苷蛋白（saporin）损毁胆碱能系统³。近年来，微量注射技术还被用于递送病毒载体或细胞移植物，以开展实验性脑部疾病的基因治疗或细胞治疗^4,5。

在这些研究中使用的经典型针头由不锈钢制成。尽管钢针使用方便且实用，但仍存在一些问题⁶：它们相对较大，可能造成组织损伤，导致血脑屏障渗漏和星形胶质细胞活化；此外，还可能产生进入针头的脑组织芯样物，形成阻碍，甚至完全阻止目标溶液的流动。最近，制备的玻璃针 临时的 从毛细血管中提取的方法已被引入使用^7,8这些电极不会引起明显的组织损伤或星形胶质细胞活化，但相对柔韧，在植入深部结构时可能发生弯曲，从而降低定位的准确性（个人观察）。

因此，有必要尽可能减少损伤（尤其是在进行修复损伤的实验时），同时提高准确性和可重复性即，确保完全输送溶液并准确定位。此外，使用不同设计的针头有助于在几何结构各异的脑区实现注射溶液的最佳分布。本文介绍了一种制备和使用石英针进行啮齿类动物脑内微注射的实验方案。由于石英毛细管熔点较高，无法在常规拉针仪上拉制，因此过去未被用于针头制备。然而，石英材料相较于玻璃具有一些重要优势，特别是更高的刚性和抗断裂能力⁹由于石英针具有较高的刚性，因此非常适用于向脑部腹侧区域进行注射。因其抗断裂能力很强，可被加工成带有多个孔洞的结构，从而获得即使在靶向几何结构复杂的脑区时也可能最为有效的设计。¹⁰.

方案

所有实验方案均经费拉拉大学动物实验伦理委员会和意大利卫生部批准。本研究遵循ARRIVE（动物研究：活体实验报告¹¹）指南。

1. 石英针的制备

1. 将石英毛细管（参见材料表）依次在蒸馏水中浸泡5分钟、99%乙醇中浸泡5分钟、二乙醚中浸泡5分钟，以进行清洁和灭菌。
2. 将毛细管置于通风橱中至少1小时，使其完全干燥。
3. 使用激光拉制仪根据具体需求设定参数，制备针头，以获得足够长且足够细的针头。
   注：我们使用激光拉制仪（参见材料表）。采用双行程序进行拉制。第一行使用高功率、最大扫描长度（对应于FILAMENTS VALUE）且不施加拉力。该参数组合可使毛细管最大部分熔化并以最低延伸速度成形，从而形成具有较长长度、较大内外径和较短针柄的针头。通过这种方式，针头可保持较高的机械强度和较大的内径，允许干细胞或病毒颗粒顺利通过而不发生堵塞。该程序行的速度和延迟应确保在针尖变得过细过长之前停止延伸，以免偏离所需的机械性能和形状特征。第二行拉制程序在石英冷却后（5秒）自动执行。功率、灯丝和拉力参数应能切割出尽可能短的针尖长度和陡峭的针柄，避免两根针头在分离时发生针尖断裂。通常情况下，使用我们的设备时采用以下参数：(a) 第一行 = 功率990，灯丝5，速度130，延迟110，拉力0；(b) 第二行 = 功率970，灯丝3，速度0，延迟70，拉力0。
4. 将针头放入先前用70%乙醇清洁过的培养皿中。
   1. 用塑料封口膜覆盖培养皿。
5. 在显微切割仪上切割毛细管。
   1. 启动时，让激光自动进行校准，以验证输出功率和能量。然后设置切割参数。
      注：我们使用显微切割仪（参见材料表），并采用以下参数：激光脉冲能量（63 µJ），激光束直径为最大孔径的20%（最大孔径：1.0 µm），切割速度为最大速度的10%（最大速度：30 µm/s）。
   2. 将针头牢固固定在显微镜载物台上，并将其尖端置于计算机屏幕中央。
   3. 在菜单栏上点击铅笔图标，并用其绘制激光切割标记线。
      注：切割角度应相对于针头表面约为45°。
   4. 在侧边功能栏中，选择包含“START CUT”按钮的标志，以启动激光对已标记位置的切割。
   5. 如需开侧孔，可重复步骤1.5.2–3的操作；无需重新定位针头（图1）。
6. 切割后清洗。
   1. 通过塑料管将针头连接至空泵。
   2. 开启泵，并手动将正向流速调节至中等速度（3 µL/min）。
   3. 先吸入99%乙醇，再吸入蒸馏水，以去除切割过程中产生的杂质。
   4. 再次吸入99%乙醇，以利于干燥。
      注：每一步骤应持续至少3分钟。
7. 将针头存放于适当密封的培养皿中，直至手术当日使用。
8. 针头可重复使用；实验结束后，用次氯酸钠和乙醇清洗，以去除残留溶液和可能的组织残留物。如需更彻底清洗，可将针头放入微量移液器储存罐中，针尖朝下，加入蒸馏水至完全浸没针尖，煮沸1.5分钟以清除任何残留组织，然后用乙醇冲洗。

2. 实验步骤

1. 根据泵的用户手册提供的说明，选择设置菜单，根据微量注射器的直径/体积校准泵，并将流速设置为 0.3 µL/min
2. 填充一支10 mL注射器（配备钝针头（例如，Hamilton 针，30 G）和一段短的聚四氟乙烯管）用无菌水冲洗，并用于填充微注射器（在小心取出活塞后）以及手动微注射泵（MMP）的注射组件套件。
   注意：MMP 试剂盒用于将针头牢固地安装在立体定位仪框架上（图2该试剂盒包括：聚四氟乙烯管、鲁尔接头转管耦合器、移液器 holder 以及适用于不同外径移液器的垫圈。
3. 将针头连接到MMP套件。
   1. 通过10 mL注射器向系统中注入更多水，检查水是否从针头流出。
      注意：通过重复填充步骤，确保清除系统内部的任何气泡。
4. 将10 mL注射器从微量注射器上断开，同时缓慢推动活塞，使微量注射器顶端留有一滴水。将活塞插入微量注射器中。
5. 将微量注射器连接至泵，并将流速设置为 0.3 µL/min
   注意：等待针尖有液滴渗出，然后继续等待 3 分钟。
6. 将流速设定为 0.1 µL/min，并开始手术操作。手术过程中应持续保持泵的运行。
   注：本文报道的实验使用300 g（3月龄）的雄性Sprague Dawley大鼠。然而，该操作步骤适用于其他物种，尤其是小鼠。
7. 使用当地法规批准的方法诱导全身麻醉。
   注意： 我们采用腹腔注射（i.p.）85 mg/kg 氯胺酮和 8 mg/kg 咪唑安定的混合制剂，可实现 20–50 分钟的麻醉效果。必须通过尾部和/或足趾夹捏反应确认动物已完全镇静。在手术开始前评估麻醉深度及基本生命体征，并每 10 分钟监测一次 手术过程中，使用循环水加热垫维持动物在术前、术中和术后的体温恒定。动物需持续监测直至完全恢复（如能够直立并自由活动）。此外，术后每24小时给予镇痛药（曲马多，5–7 mg/kg，腹腔注射），连续三天。
   1. 剃除动物头部的毛发 妥善准备手术区域以进行无菌手术。使用碘伏溶液（如Betadine）进行两步擦洗，随后使用70%乙醇。此外，为维持无菌状态，应用手术巾包裹手术区域（视频中为演示目的省略此步骤）。 
8. 将大鼠置于立体定位仪中，并放置在循环水加热垫上。为提供额外的镇痛效果，在手术部位施加0.5%利多卡因溶液（剂量不超过7 mg/kg）。使用玻璃珠灭菌器或液体冷消毒法对所有手术器械进行预灭菌处理：将器械浸入含2%戊二醛和7.05%苯酚的溶液（Sporodicin 或 Cidex）中，随后用无菌水或生理盐水冲洗。即使在连续手术之间也必须进行消毒。使用已灭菌的手术刀在颅骨表面做纵向切口，操作时应轻柔，避免引起过多出血。用扁平刮刀打开头皮，并在皮肤瓣上使用手术夹固定以保持切口开放。极其轻柔地剥离骨膜，暴露前囟以及将用于插入针头的颅骨区域。
9. 将手臂安装到立体定位仪框架上（在持续灌流的同时），将针尖精确移动至前囟正上方，注意不要损坏针尖。记录前囟的前后和内外侧坐标，并转换至目标坐标。在体视显微镜引导下，降低针头直至其尖端接近颅骨表面，随后略微抬高立体定位臂，标记钻孔位置。
10. 钻孔机（钻头） Ø：0.8 毫米；钻速：1,000 转/分钟）在标记位置钻开颅骨。 钻孔过程中需注意避免穿透硬脑膜。钻孔时应滴加无菌生理盐水，以防止骨组织损伤和坏死。
11. 剪下一小块塑料石蜡膜，放置于颅骨上。使用10 µL型移液管，在塑料石蜡膜上滴加一滴待注射溶液。停止泵运行，轻微回拉泵的推杆，通过轻柔抽吸微量注射器的活塞，在毛细管内形成一个小气泡。
12. 将立体定位臂下降，直至针尖到达液滴处。通过缓慢抽动微量注射器的活塞吸取样品，避免产生气泡。将泵的推杆重新与活塞接触，并开启泵，设置流速为0.3 µ升/分钟。继续等待直至液滴形成（数分钟），然后进行下一步操作。
    注意：在本示例实验中，人工脑脊液（aCSF）被注入纹状体（AP：+1.5，ML： ±2.7；DV：-5.0）以及背侧海马（AP：-3.5，ML： ±2.1；DV：-3.5；单位为 mm（从硬脑膜起算），2 µL/位点。为便于比较两种注射方法，在每个脑区，一侧半球使用石英针，另一侧半球使用26 G钝头针或30 G斜尖不锈钢针进行灌注。
13. 将流速降低至 0.1 µL/min，在目标位置用不锈钢斜面针尖刺破硬脑膜，沿背腹轴缓慢降低立体定位臂，进入脑组织。到达目标位置后，再下降0.1 mm，停止泵送，将立体定位臂抬高0.1 mm，然后重新启动泵，流速调至0.3 µL/min
    注意：在降低针头时保持缓慢流速的原因是确保正压，以防止组织微小碎片进入针内。此类情况会堵塞针尖，影响溶液的输送。由于降低针头时流速极慢，且下降速度约为10秒/毫米，因此沿针道残留的溶液量相较于在靶部位注入的总量可忽略不计。使用带侧孔的针头时，可省略此项预防措施。
14. 启动计时器，并根据所需注射体积等待相应时间（例如，若注射 2 μL，则等待 6 分 40 秒） µL). 注射时监测气泡移动情况。注射结束后，停止泵液，等待5分钟，然后缓慢撤出针头。当石英针完全抽出后，重新启动泵，检查针尖是否有液滴形成。
15. 用骨蜡封闭颅骨表面的开口，移除止血夹并缝合头皮，伤口周围涂抹抗生素软膏例如，新霉素多粘菌素滴眼液）并将动物放回饲养笼中。
    注意：根据机构伦理委员会批准的安乐死方案，本文所述实验中，动物通过腹腔注射 43 mg/kg 氯胺酮和 7 mg/kg 赛拉嗪进行深度麻醉后断头处死。取出脑组织，在甲醛中后固定 48 小时，然后进行石蜡包埋。冠状切片（8 µ使用切片机对脑组织进行切片，厚度为 m。

结果

我们比较了使用石英针（外径60 µM，带一个直径20 µM的侧孔，C型，图1）与两种传统不锈钢针（26 G钝头针和30 G斜面针）在大鼠背侧海马体和纹状体进行直接微注射所引起的组织损伤。为此，我们分别使用石英针和钢针在双侧背侧海马体和纹状体各注射2 µL aCSF，并在注射后48小时通过苏木精-伊红（HE）染色评估组织损伤情况。我们选择在注射后的早期时间点进行观察，以更清晰地评估不同针头造成的急性机械性损伤（随着时间推移，组织修复机制可能掩盖初始损伤）⁷。

按照上述方案，石英针未产生任何可检测到的损伤，仅留下几乎无法察觉的针道，而通过26 G钢制钝头针注射的脑区则表现出明显的损伤（图3）。30 G 的斜面角度（30 °）不锈钢针在纹状体中诱导的脑损伤范围较小，但清晰可辨

讨论

本文所述技术满足了引言中提出的优化显微注射的需求，该技术可用于多种目的¹²。本文描述的针头将损伤降至最低，几乎达到无法检测的水平；与容易弯曲的玻璃针头不同，石英针头具有良好的刚性，即使在深部脑区坐标下也能可靠地靶向目标脑区。此外，侧孔设计可确保在针尖插入脑组织过程中发生堵塞时，溶液仍能顺利递送。

局限性与替代方案。由于石英毛细管熔点较高，无法在常规拉制仪上进行拉制，i.e.，需要使用昂贵的设备。玻璃毛细管在避免对组织造成损伤方面具有同等优势，但在向深层结构注射时可靠性较低，且更易碎裂（i.e.，在设计灵活性方面较差）。然而，如果目标是向皮层或背侧海马等浅表结构注射，且无需制作多个孔洞（以避免增加针头断裂的风险），则玻璃针无疑是一种有效且经济的替代选择。

石英针和玻璃针的一个局限性是，它们无法像与导管套管连接的不锈钢针那样，在不同时间点进行多次注射。因此，对于这些应用，不锈钢针仍...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
石英毛细管	Sutter Instruments, Novato, CA USA	Q100-50-10	无纤维丝
拉针仪	Sutter	P2000
微量移液器储存罐	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	E210
激光显微切割系统	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	LMD6500
哈密尔顿注射器	Hamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, StŸtzerbach, Germany	19138-U
微输注泵	Univentor, Zejtun, Malta	Model 864
手动显微注射泵套件	WPI	Item#: MMP-KIT	该套件可将微量移液器牢固安装至立体定位仪框架上
精密钻机	Proxxon	28510 MicroMot 50/E	带滚珠轴承驱动轴，可调转速
人工脑脊液	Tocris	3525
26 G钝头针和30 G斜面针	Hamilton	26 G Blunt: 19138-U 30 G Bevel: 20757
切片机	Leica, Germany	LEICA RM212RT