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方法文章

利用四甲基铵实时离子电渗法量化脑细胞外间隙的容积分数与迂曲度

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DOI：

10.3791/55755

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2017年7月24日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Virginia, 2Department of Cell Biology, SUNY Downstate Medical Center, 3Neural and Behavioral Science Graduate Program, SUNY Downstate Medical Center, 4Division of Neonatology, University of Virginia, 5Department of Neuroscience and Physiology, New York University School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了实时离子电渗法，这是一种用于测量活体脑组织细胞外间隙（ECS）物理参数的方法。通过检测惰性分子在细胞外间隙中的扩散情况，可计算出细胞外间隙的体积分数和迂曲度。该方法适用于研究脑细胞外间隙的急性可逆性变化。

摘要

本文综述了实时离子电渗法（RTI）的基本原理与操作流程，该方法是研究和量化活体脑组织细胞外间隙（ECS）的金标准。ECS 包围所有脑细胞，内含组织间液和细胞外基质。许多脑功能所需物质（包括神经递质、激素和营养物质）的转运均通过 ECS 以扩散方式进行。在正常脑活动过程（如睡眠）以及病理状态（如缺血）中，该空间的体积和几何结构均会发生变化。然而，脑内 ECS 的结构及其调控机制，尤其是在疾病状态下的特性，仍远未被充分阐明。RTI 方法可测量活体脑组织的两个物理参数：容积分数和迂曲度。容积分数指 ECS 占组织总体积的比例；迂曲度则反映物质在脑区中扩散时所受阻碍程度的相对指标，相对于无障碍介质中的扩散而言。在 RTI 实验中，通过源微电极向脑 ECS 脉冲释放一种惰性分子；当分子从该源扩散出去时，使用距离约 100 µm 的离子选择性微电极随时间测量该离子浓度的变化。根据所得的扩散曲线，可计算出容积分数和迂曲度。该技术已被用于多种物种（包括人类）的脑切片以及活体（in vivo）研究，以探讨 ECS 的急性和慢性变化。与其他方法不同，RTI 能够实时检测脑 ECS 的可逆性与不可逆性改变。

引言

细胞外间隙（ECS）是存在于所有脑细胞外部的相互连通的通道网络，其中包含组织间液和细胞外基质（图1a 和 图1b）。许多脑细胞功能所需物质（包括营养物质、激素和神经递质）的分布通过ECS中的扩散实现。该间隙的物理参数（包括体积、几何结构和细胞外基质）的变化会显著影响物质在ECS中的扩散以及脑细胞所处的局部离子浓度，从而对脑细胞功能产生深远影响1,2。

实时离子电渗（RTI）用于测定脑区的两个结构特征：容积分数和迂曲度3,4,5。容积分数（α）是指在代表性基本体积中，细胞外间隙（VECS）所占组织体积与总组织体积（Vtissue）的比例；

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迂曲度（λ）是指某种物质在脑区扩散时所受到的相对阻碍程度，与在无障碍介质中的扩散相比；

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其中D*（cm2 s-1）表示该物质在脑组织中的有效扩散系数，D（cm2s-1）表示该物质在自由介质（如稀琼脂糖凝胶）中的自由扩散系数。

目前，RTI 方法最常用的示踪物质是小阳离子四甲基铵（TMA）。TMA 的分子量为 74 g/mol，在溶液中完全解离，并带有一个正电荷。使用该离子的 RTI 研究表明，α figure-introduction-3 0.2 且 λ figure-introduction-4 1.61,2。这意味着细胞外间隙（ECS）约占全脑总体积的 20%，且小的惰性分子在 ECS 中的扩散速度比在无障碍介质中慢约 2.5 倍3。然而，α 和 λ 会随脑组织的年龄、区域、状态以及病理条件而变化1。这些参数的改变已与大脑发育、衰老、睡眠、癫痫以及其他多种脑部基本过程和疾病相关联1,6。尽管其他技术也可测量 α 和 λ，但 RTI 能够在活体组织的局部区域实时同时测定这两个参数。因此，RTI 已成为研究急性且可逆性干预过程中 α 和 λ 变化的不可或缺的工具。

支持RTI的理论最初由Nicholson和Phillips验证，此后该技术已得到广泛应用4,7。采用RTI的实验首先通过离子电渗法从源微电极向稀释的琼脂糖凝胶中释放一脉冲的四甲铵（TMA）。一旦被释放，离子便从点源自由扩散，沿无数可能的随机路径扩散（图1d）。使用一个约位于100 µm远处的离子选择性微电极（ISM）随时间测量离子浓度的变化（图1c）。将TMA浓度随时间的变化绘制成图，并拟合至一条曲线，从而可计算出扩散系数D以及离子电渗微电极的输送数（参数详见实验方案部分）。利用这些数值，可在感兴趣脑区重复该过程，以获得表观扩散系数D*，并进一步计算容积分数α和迂曲度λ。离子电渗微电极的控制、数据采集、TMA浓度曲线的绘图与拟合，以及实验参数的计算，通常均由专为此设计的Wanda和Walter程序完成（该软件及其使用手册可应要求向作者免费获取）。

本综述的方案部分描述了在啮齿类动物脑片中设计和实施RTI所需的基本操作步骤。该技术也已应用于非啮齿类模型，包括人脑片和 在 活体脑组织制备1,4,6,8,9代表性结果部分展示了理想与非理想的结果，以突出数据解释中的细微差异。最后，讨论部分简要介绍了电阻抗成像技术的故障排除方法、技术局限性、研究细胞外空间的替代技术以及该技术的未来应用前景。

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图1：细胞外间隙（ECS）中的扩散示意图。（a）ECS示意图：展示典型脑组织切片中细胞外间隙的大小和位置。黄色部分标记了灰质脑细胞突起之间的细胞外间隙。在生理条件下，ECS体积约占总组织体积的20%（即体积分数 = 0.2）。（b）ECS放大示意图：突出显示导致扩散曲折性的物理参数，包括脑细胞几何结构（灰色）和细胞外基质（图示为多种颜色的糖胺聚糖和蛋白聚糖组成的网状结构）。（c）从点源扩散的三维示意图：展示惰性分子从离子电渗源向ISMs扩散的净运动方向。在不考虑扩散屏障和细胞摄取的情况下，分子向各个方向外向扩散，形成球形的浓度前沿。ISMs用于量化从离子电渗源释放的惰性分子的局部浓度。（d）脑组织ECS中扩散的计算机模拟：[最左侧] 蒙特卡洛模拟设置；绿色球体代表脑细胞突起，红色十字代表点源。该设置模拟了图1a中所示的脑组织结构。[中间图像] 3个和6个分子在脑组织细胞外间隙中进行随机运动的二维展示。[最右侧] 从点源释放的大量分子的随机运动轨迹。所有分子从点源的净运动方向为外向，如图1c所示。这些累积的随机运动轨迹勾勒出了细胞之间的空间（即细胞外间隙；详见参考文献5中的进一步解释）。请点击此处查看该图的放大版本。

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方案

所有用于获取组织样本的动物实验操作均经纽约州立大学下州医学中心动物伦理委员会批准。

1. 溶液与设备的准备

  1. 为离子选择性微电极（ISM）的参比毛细管准备150 mM NaCl反向填充溶液。将其储存在连接有0.22 µm滤器的10 mL注射器中（以去除细菌或颗粒）。
  2. 为微电极准备150 mM四甲基铵氯化物（TMA-Cl）反向填充溶液。将其储存在连接有0.22 µm滤器的10 mL注射器中。本方案中的TMA-Cl溶液应由5 M的厂家储备液配制，以确保浓度准确。
  3. 将至少四根银丝浸入漂白剂（次氯酸钠）中至少2小时，以制备微电极用的氯化银丝。用乙醇去除多余的漂白剂，并让银丝自然干燥。
  4. 在烧杯中配制50 mL含0.3%琼脂糖、150 mM NaCl和0.5 mM TMA-Cl的溶液，并盖好。使用粉末状且相对新鲜的琼脂糖，以确保获得良好的扩散测量结果。
  5. 使用搅拌子加热并混合琼脂糖溶液至完全溶解。待溶液冷却至室温后，可在4 °C下保存最多1周。
  6. 制备一个由4%琼脂糖和1 M KCl组成的无关（接地）电极（制备方法见补充材料A）。
  7. 制作一个小型多孔杯，使其可放入实验腔室中，并允许杯内外环境之间保持电连续性（图2a）。在杯底放置一个金属环，以防止其在部分浸入水中时漂浮。
  8. 使用5 M TMA-Cl储备液进行系列稀释，配制五种100 mL的TMA-Cl溶液，用于ISM的校准。溶液终浓度应分别为0.5、1、2、4和8 mM TMA-Cl，均溶于150 mM NaCl中。将校准溶液储存于可密封的容器中，以防蒸发。

2. 电子设备设置

  1. 根据图2b中的框图连接RTI实验装置的各个组件；包括一个具有两个输入通道的放大器（其中一个通道应为高阻抗，用于ISM的离子选择性微电极）、一个设置为10 Hz的低通滤波器、一台图表记录仪、一个A/D + D/A转换器、一个离子电泳装置（或能够提供恒定电流脉冲的放大器），以及一台运行Wanda和Walter程序的计算机（PC）。检查电子装置，确认所有连接均已正确就位。
  2. 如有必要，将实验装置置于接地屏蔽 enclosure（如法拉第笼）中，因为ISM具有高电阻，易受附近移动产生的伪迹干扰。
  3. 建立一个专用的ISM校准工作站，包括一个双输入放大器、一台图表记录仪、合适的ISM电极架和一个无关的接地电极。如果可能，对 enclosure 进行屏蔽。如果在实验装置中进行ISM校准（步骤3.29），则可跳过此步骤。

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图2：多孔实验杯及电子装置示意图。（a）多孔实验杯：使用多孔网制成实验杯，使琼脂糖（杯内）与实验浴液（杯外）之间保持电连续性。杯底附有一个金属环，以防止杯子在浴液中漂浮。（b）RTI装置的框图（步骤2.1和2.2）：离子选择性微电极（ISM）连接至放大器（amp.）。ISM具有两个玻璃管。其中一个管的尖端含有液态离子交换剂（LIX），产生与四甲铵（TMA）浓度对数成正比的电压，同时叠加局部环境电压；该信号通路以红线表示。ISM的另一个管称为参比管，用于测量ISM尖端处的环境电压；其信号通路以蓝线表示。放大器具有两个所谓的前置放大级，分别连接至ISM的两个管；这些单元增益为1（×1），用于将微电极的高阻抗与放大器其余电路的低阻抗相匹配。连接至离子选择性管的前置放大级必须能够匹配约1,000 MΩ的输入电阻，而参比管的电阻通常约为10 MΩ。从前置放大级输出后，参比管的电压被反相，并通过一个加法放大器（Σ）从离子选择性管的电压中减去，从而获得纯净的离子信号电压。放大器输出进入信号调理单元，该单元提供额外放大和一个多极低通滤波器（≤10 Hz；通常为贝塞尔滤波器），用于消除噪声并防止模数转换器（A/D）处发生信号混叠。滤波器的输出同时显示在笔式记录仪上。A/D转换器将信号数字化并发送至个人计算机（PC）。PC还生成一个数字信号，经数模转换器（D/A）转换为模拟电压脉冲，输入至离子电渗装置，该装置将电压转换为恒定幅度的电流脉冲，并将其输送至离子电渗微电极。离子电渗信号通路以绿线表示。数据采集和离子电渗信号由Wanda程序控制，该程序为每次扩散记录生成一个输出文件，形式为电压随时间变化的记录，并包含定义实验的全部参数。另一个程序Walter读取输出文件，并利用ISM校准数据将数字化电压转换为浓度。随后在Walter中将浓度-时间曲线拟合到相应的扩散方程解。若介质为琼脂糖，则提取扩散系数D和组织容积分数nt；若介质为脑组织，则提取容积分数α和迂曲度λ。模拟信号用实线表示，数字信号用虚线表示。浴槽中还包含一个无关的接地电极（图中未显示）。红线 = 离子信号，蓝线 = 参比信号，绿线 = 离子电渗指令，实线 = 模拟信号，虚线 = 数字信号。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 离子选择性微电极的制备与校准

  1. 按照以下方案在实验前一天制备ISMs。为确保实验当天至少有两个ISM可用，应批量制备ISMs。
    注意：大多数离子选择性微电极（ISM）可稳定1至2天。ISM的制备对湿度和大气条件敏感。并非每根微电极都能成功校准。
  2. 使用一把旧的镊子，从双筒硼硅酸盐玻璃毛细管的一端切去约 0.5 cm 的玻璃。
  3. 在毛细管盖的另一端敲碎单个毛细管壁图3a）。确保隔膜未受损（关键步骤）。注意：佩戴护目镜，以防玻璃飞溅造成伤害。
  4. 将毛细管放入盛有丙酮的瓶子中，至少浸泡1小时以去除污染物。
  5. 从丙酮中取出毛细管，用脉冲式干燥压缩氮气或空气吹洗，以去除残留的过量丙酮。必须彻底清除毛细管中的丙酮，因为残留的丙酮会干扰硅烷化反应（至关重要）。
  6. 在垂直或水平拉制仪上制备玻璃微电极尖端。调整参数以拉制出具有长锥形和尖锐尖端的微电极，其尖端直径约为 1 µm 或更小的直径。此步骤结束时，一根毛细管将被制成两根移液器（图3a).
  7. 在10倍物镜的复式直立显微镜下观察单个微量移液器，使用玻璃显微镜载玻片切割其尖端，使尖端最终直径（即， 2 和 3 之间） 5 µm (图3b）。此后，该移液器将简称为 ISM。
  8. 使用连接在10 mL注射器上的导管，通过芯片侧面的开口将150 mM NaCl参比溶液注入ISM的芯片桶中 0.22 µm 滤器和28 G、97 mm针头（图3b不要将桶内液体装至超过桶高度的四分之三。
  9. 用150 mM TMA-Cl填充液填充ISM未切削的一端。轻轻敲击ISM以排除溶液中的气泡。在用于切削尖端的显微镜下检查尖端是否有气泡。
  10. 使用本生灯灼烧离子选择性微电极（ISM）的后端，以确保后端隔膜处不发生充填液的渗漏。灼烧后，确保ISM顶部四分之一部分保持干燥。
  11. 将一根氯化银丝插入离子选择性微电极（ISM）的参考液中，并将从毛细管端伸出的银丝弯折，以此标记为参考电极套管图3c确保导线浸没在回填溶液中，并在整个实验过程中保持在溶液内。
  12. 将一段较短的聚四氟乙烯管（长约 20 cm）套在 25 G 注射器针头的尖端上。将管子的另一端插入离子选择性电极管的后部。确保管子已插入电极管内，但位于后充液上方（图3c).
  13. 用本生灯加热一段牙科蜡，将导管和银丝分别密封到对应的筒管中（图3c确保在离子选择性电极桶内的塑料管周围形成完整的气密密封（关键步骤）。
  14. 准备一个小型透明玻璃容器（5 mL 或更小），盛装 4% 氯三甲基硅烷的二甲苯溶液。注意：二甲苯和硅烷对健康危害极大；操作时须在通风橱内进行，并妥善处理废弃物。
  15. 将容器置于通风橱内水平安装的体视解剖显微镜前方。使用显微操作器将ISM垂直固定在容器上方。图 3d).
  16. 将微电极尖端浸入氯三甲基硅烷溶液中。
  17. 将一个空的10 mL注射器连接至通向ISM的25号针头。通过注射器施加正压空气，直至三甲胺盐酸盐（TMA-Cl）溶液形成一个气泡；此步骤应在显微镜下直接观察下进行。
  18. 轻轻敲击离子选择性微电极（ISM）支架，使气泡从尖端脱落。
  19. 将氯三甲基硅烷溶液吸取至大约 1,500 µm 使用10 mL注射器通过负压将液体吸入ISM尖端。
  20. 将氯三甲基硅烷溶液从ISM尖端完全排出，直至尖端处形成一滴TMA-Cl溶液气泡（图3d).
  21. 重复步骤 3.19 和 3.20，共五次。每次应确保吸入尖端的液体形成均匀且连续的液柱。若无法将溶液吸入尖端，请检查管路是否堵塞、气密性是否完好，或 ISM 尖端是否堵塞。
  22. 将氯三甲基硅烷溶液全部从尖端推出，直至形成一气泡的TMA-Cl溶液。
  23. 在保持注射器正压的同时，将 ISM 从二甲苯溶液中取出。确保将 ISM 尖端中的所有二甲苯溶液完全排出，因为过量的二甲苯会破坏后续步骤中形成的交换柱。
  24. 将离子选择性微电极（ISM）的尖端放入盛有TMA液体离子交换剂（LIX）的小型透明容器中（可使用离子交换剂原装容器或小型比色皿）。此步骤需在水平显微镜装置下直视操作。
  25. 施加少量负压，使极少量LIX进入吸头即， 一旦观察到LIX进入尖端，立即停止施加负压。
  26. 将10 mL注射器从管路断开，使ISM静置5分钟。在此期间，LIX将进入硅烷化尖端，直至达到平衡状态。
  27. 从LIX中取出离子选择性微电极（ISM）。将导管从交换器筒中抽出（尽量减少石蜡的移除）。将一根氯化银丝插入ISM后端形成的小孔中。用熔化的石蜡将银丝密封在交换器筒的后填料中。
  28. 让 ISM 静置至少 30 分钟。使用任何可塑性临时粘合剂将已完成的 ISM 固定在烧杯内缘。
  29. 通过记录ISM在步骤1.8中配制的每种校准溶液中测得的电压，对ISM进行校准。
    注意：校准可在校准工作站（见步骤 2.3）或实验装置中进行。该程序详见补充材料 B 及 Haack 等10.
  30. 如果多个离子选择性微电极（ISM）的校准均成功，则在此暂停，直至预定使用当天。如果校准未成功，则制备更多的ISM。
  31. 实验当天，再次校准微电极（参见步骤 3.29）。

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图3：离子选择性微电极的制备。（a）毛细管末端经敲断并拉制后（步骤3.2–3.6）：玻璃毛细管两端的单个管腔被敲除。通过拉制一根双管玻璃毛细管，形成两个具有精细尖端的微移液管，从而生成一个离子选择性微电极（ISM）。（b）两个管腔后向填充后（步骤3.7–3.9）：单个ISM的尖端被敲至直径为2–5 µm。离子选择性管腔用TMA-Cl进行后向填充，参考管腔则用NaCl填充。（c）涂覆氯三甲基硅烷前（步骤3.11–3.13）：将一根氯化银丝插入参考管腔中。聚四氟乙烯（PTFE）管连接至25 G针头，并插入离子选择性管腔中。使用牙科蜡在两个管腔顶部形成气密密封。（d）微移液管涂覆氯三甲基硅烷（步骤3.15–3.26）：[低倍镜] 将ISM水平置于含氯三甲基硅烷的溶液中，并与水平放置的体视显微镜对齐。[高倍镜] 通过水平放置的体视显微镜观察处于氯三甲基硅烷溶液中的ISM尖端。在显微镜下观察到尖端后，从离子选择性管腔中排出少量TMA-Cl溶液（足以形成一个小的TMA-Cl溶液气泡）。轻敲ISM支架以释放TMA-Cl溶液气泡，然后将氯三甲基硅烷吸入尖端。此过程重复数次。当所有氯三甲基硅烷从ISM中排出后，将ISM置入TMA的液态离子交换剂（LIX）中，并将LIX吸入离子选择性管腔的尖端。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 离子电渗微电极的制备

注意：离子电渗微电极应在实验当天制备。

  1. 使用垂直或水平拉制仪拉制一根双通道硼硅酸盐玻璃毛细管。调整参数，使拉制出的移液管与步骤 3.6 中拉制的微移液管相似（图 4a）。
  2. 将微移液管置于步骤 3.7 所用的复合显微镜下，用玻璃载玻片切割其尖端，使最终直径介于 2 至 5 µm 之间（图 4a）。
  3. 使用连接有 0.22 µm 滤器和 28 G、97 mm 针头的 10 mL 注射器，将 150 mM TMA-Cl 填充液注入两个通道中（图 4a）。
  4. 轻轻敲击微移液管，确保两个通道内的溶液中无残留气泡。
  5. 将氯化银丝插入微移液管的两个通道内。确保银丝插入填充液的深度足够，以保证在整个实验过程中始终与溶液保持接触。
  6. 用热牙科蜡将银丝密封在通道内。通过将两根导线相互缠绕的方式轻轻固定（完成的微电极如 图 4b 所示）。

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图4：离子电渗微电极的制备。（a）双管微电极后向灌注完成后（步骤4.1–4.3）：离子电渗微电极由毛细玻璃管拉制而成，其尖端经敲击处理至直径为2–5 µm。离子电渗微电极的两个管腔均用TMA-Cl溶液灌注。（b）完成的离子电渗微电极（步骤4.5–4.6）：将两根氯化银丝分别插入微电极的两个管腔中，管腔末端用石蜡密封，银丝在微电极尾部绞合在一起。请点击此处查看该图的放大版本。

5. 人工脑脊液和啮齿类动物脑组织切片的制备

  1. 根据实验需求配制1 L人工脑脊液（ACSF），并向其中加入0.5 mM TMA-Cl。
    注意：实验过程中需要TMA-Cl以建立TMA的背景浓度。
  2. 按照标准方案制备厚度为400 µm的啮齿类动物脑片11,12。使用步骤5.1中配制的ACSF进行脑片的解剖和维持。

6. 琼脂糖中的实时离子电渗法

  1. 打开运行 Walter 和 Wanda 程序的计算机。
    注意：这些程序可根据要求免费获取。尽管该软件并非必需，但若无此软件，则需自行编写类似程序或手动完成分析。
  2. 以适当流速将ACSF通入浸没式记录室例如， 2 mL/min）。将温度控制器设定至所需温度，并用95% O₂2/5% CO₂2 （或根据实验需求选择其他合适的气体混合物）进行实验全程处理。
  3. 将一个无关电极（接地电极）安装在合适的电极 holder 中，并将电极尖端浸入流经浸没式记录室的ACSF。将导线连接至记录装置的接地端。
  4. 将先前制备的0.3%琼脂糖填充至多孔杯（步骤1.7中制备）中，并将其放入浸没式记录室。确保溶液不溢出杯口。
  5. 将校准后的 ISM 固定至一台显微操作仪的移液管架上，将离子电泳微电极固定至另一台显微操作仪上。将两个支架调节至适合该实验装置的角度（图5a).
  6. 将ISM和离子电渗微电极导线连接至记录放大器相应的探头级。或者，根据设备配置，可直接连接至放大器。
  7. 确保连接导线或夹子的重量/位置不会引起微电极的移动，因为微小的位置波动可能影响实验结果。
  8. 打开电子设备（来自步骤2）。分别启动Walter和Wanda的独立实例。
  9. 在 Wanda 图形用户界面中，单击 "校准" (图6a）。在“校准”框中（图6b），填写在 ISM 校准期间测得的电压值（步骤 3.29），然后单击 "拟合数据"
    注意：这允许对以下形式的尼科尔斯基因式进行拟合（也可通过其他方法拟合该方程以获得 M 和 K):
    figure-protocol-4
    此处， V 是测得的电压（mV）， M 是Nicolsky斜率（mV）， C 是离子的浓度（mM）， K 是干扰物浓度（mM），以及 V0 是偏移电压（mV）3.
  10. 点击 "接受" 在“校准”框中自动传输斜率（M）和干扰（K) 添加到主图形用户界面（GUI）。
    注意：此处， K 代表钠的干扰，通常可忽略不计。
  11. 在图形用户界面左侧，确保所有实验参数均已设置在相应的输入项中（图6a).
    1. 在“源方法”框中，将源设置为离子电渗源（默认） "记录时长" 到 "200 s" （默认），该 "脉冲开始" 到 "10 s" （默认），的 "脉冲结束" 到 "60 s" （默认），该 "偏置电流" 到 "20 nA" （默认），该 "主电流" 到 "100 nA" （默认），以及 "转换因子" 至适当值。
    2. 在测量电极设置框中，设定 "浴液 C" 与浴液中所含TMA的浓度（以mM表示）成正比。设定 "总增益，" "输出通道，" "ISM 通道，" 和 "参考通道" 根据所使用的数据采集系统，调整至适当的数值。
      注意：该 "转换因子" 必须设置为适当的值（针对所使用的离子电泳装置而定）。该值用于指定在给定的来自D/A转换器的施加电压下所通过的电流大小（nA/mV）。
  12. 将温度探针放入琼脂杯中。记录测得的温度 "温度" 条目在 "测量电极" 图形用户界面的框图6a).
  13. 打开显微镜载物台下光源。如有需要，开启连接在显微镜上的相机及相机显示器。
  14. 至少降低微电极 1,000 µm 深入琼脂糖中，并将它们置于小杯中央（图5b使用10倍物镜（长工作距离水浸物镜）在显微镜下观察。
  15. 将放大器的参考通道和ISM通道电压均调零至0 mV，以建立琼脂糖中记录的电压作为基线电压。
  16. 在双通道放大器上，手动将 ISM 通道连接器移至电压减法输出端，以在参考通道和 ISM 通道之间启用减法功能。
    注意：减法处理可确保离子选择性微电极（ISM）通道中的电压变化仅反映TMA浓度的变化。
  17. 移动 ISM，使其接触离子电渗微电极的尖端。在三个方向轴上将两者的尖端相互对准居中。
  18. 将两个微电极在显微操作仪控制箱上的相对位置归零。确保微电极准确且精确地居中（关键步骤）。
  19. 移动 ISM 120 µm 远离离子电泳微电极的一个轴向（左右轴）， 图5b）。将此距离输入到 "测量电极" 图形用户界面的框图6a).
  20. 单击开始录制 "获取" 在图形用户界面（GUI）中（图6a）；让程序记录完整的录音。
    注意：离子电渗微电极接收恒定的偏置电流。点击后 "获取，" 在主电流施加之前存在一个短暂的延迟，且主电流持续时间有限。
  21. 重复步骤6.20两到三次。每次需等待TMA信号恢复至基线水平后再采集新的记录；程序将自动保存每条记录以供后续分析。
  22. 将微电极移回控制盒指定的零位，检查两个微电极之间的间距。如果微电极不再居中，则采用与步骤6.17相同的方法重新将其居中。记录电极位置的任何变化。
    注意：如果间距变化超过约2%，则步骤6.19中获取的记录不能视为准确，必须重新采集新的记录。

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图5：琼脂实验装置示意图。（a）稀琼脂中实验的装置（步骤6.1–6.5）：将装有稀琼脂的小型多孔容器置于持续灌流的灌流室中。离子电渗微电极（左侧）和离子选择性微电极（ISM，右侧）由微电极夹持器固定；微电极夹持器安装在机器人显微操作臂上。温度探针插入琼脂凝胶中，无关接地电极置于浸没室中。（b）琼脂中微电极的放大视图：使用10倍水浸物镜（此处物镜浸入150 mM NaCl溶液中）观察琼脂中的离子电渗微电极（左侧）和离子选择性微电极（ISM，右侧）。通过显微操作器将微电极定位至琼脂深度1,000 µm处，微电极之间的间距为120 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

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图6：Wanda计算机软件界面。（a）Wanda图形用户界面（GUI）的操作：打开Wanda软件后显示的屏幕。在框（1）中选择合适的介质、离子电渗分子和方法。（2）点击“Calibrate”以打开Wanda校准窗口。完成ISM校准后（见图6b和补充材料B），按照实验方案第6步和第8步所述，将ISM置于琼脂或脑组织中。在框（6）中输入当前实验所需的所有适当参数。（7）点击“Acquire”开始记录，电压随时间变化的曲线图将显示在Wanda GUI的右上方区域。（b）在Wanda中校准ISM：在Wanda GUI中点击（2）“Calibrate”后弹出的窗口。将步骤3.29中获得的数值输入框（3）中，然后选择（4）“Fit Data”。确认校准曲线呈线性后，点击（5）“Accept”返回Wanda GUI。请点击此处查看该图的放大版本。

7. 琼脂糖凝胶数据分析

  1. 在计算机（PC）上打开 Walter 程序。在 "0. 记录来自：" 菜单，点击 "Wanda/VOLTORO" 按钮以读取 Wanda 生成的记录图7a）。假设需要将输出保存至电子表格，请打开相应的软件，然后单击 "第1、3页" 在 "1. 编写 Excel？" 菜单图7b).
  2. 在下一个弹出窗口中，选择要读取的记录，然后单击 "开放" (图7b）；请注意，记录将自动绘制成图表。要开始拟合过程，请执行以下步骤。
    1. 在 "2. 选项" 菜单，单击 "选择记录" 按钮。在 "图2" 弹出窗口中，使用鼠标将十字准线移至要处理的第一条记录上（图7c）；按下鼠标任意按钮以选择该记录。
    2. 点击 "拟合曲线" 在菜单中选择拟合的迭代次数；为获得准确的数据拟合结果，至少使用 20 次拟合迭代。
    3. 在菜单中选择 "全部" 以拟合所有数据点并选择 "继续；" 程序将拟合显示的曲线。观察拟合过程，并将实验记录与获得的最佳拟合曲线进行比较。
  3. 单击以选择将结果写入相应电子表格程序的选项 "Excel" 在 "7. 结果" 菜单图7d）。注意并记录以下关键数据，这些数据将用于确定离子电渗微电极的功能性：D(E5)', '参考文献 D(E5)', 'r_app，迁移数nt', '表观 nt'.
    注意： "D(E5)"：测得的自由扩散系数 × 105 厘米2/s "参考 D(E5)"理论自由扩散系数 × 105 厘米2/s）。该值基于输入的离子、培养基和温度，从Walter内置数据库中提取。 "r_app"：表观微电极间距（cm），根据测量值与参考值计算得出 D(E5). "nt"：迁移数（无量纲）。该数值决定了用于释放四甲基铵（TMA）的离子电渗电流所占的比例4. "表观 nt"：表观迁移数（无量纲）。这是根据以下公式计算得到的迁移数 r_app该数值应接近测得值 nt.
  4. 对选定的一对微电极的每条记录，重复步骤 7.1–7.3。
  5. 通过执行以下步骤，确定离子电渗微电极是否可用。
    1. 比较 "r_app" 与实际的 r (即， 120 µm）；若所有试验的平均值彼此相差在4%以内，则视为满足该标准。
    2. 比较 "D(E5)" 与 参考文献 D(E5)；如果所有试验的平均值彼此相差在8%以内，则满足该标准。
    3. 比较 "nt" 同一微电极在不同试验间的标准；若所有试验的平均值彼此相差在10%以内，则视为符合该标准。
  6. 如果步骤7.5中的任一标准未满足，则应排查离子电泳微电极的问题，或开始测试另一根微电极。
  7. 如果认为离子电渗微电极适用于该实验，则记录所有试验中的平均迁移数 "运输 Num N" Wanda 图形用户界面中的字段图6a).

figure-protocol-7
图7：Walter 计算机软件界面。（a）在 Walter 中选择数据采集程序：启动 Walter 软件后，会弹出“0. Records From:”菜单。通过点击“Wanda/Voltoro”按钮，可选择加载由 Wanda 保存的记录。（b）在 Walter 中选择数据及数据分析输出位置：[左侧] 打开适当的电子表格程序后，选择“Sheets 1,3”，以将所有 Walter 数据分析结果输出至先前打开的电子表格程序中。[右侧] 选定数据分析输出位置后，将弹出一个窗口，允许用户选择由 Walter 读取的第一条和最后一条记录。（c）在 Walter 中选择待分析的记录：[右侧] 选定要读取的文件后，将弹出一个窗口，其中以图形形式显示所有已选记录（“图2”）。[左侧] 在“2.Options”菜单中，点击“select rec”，然后使用鼠标移动十字准线以确定第一条待分析的记录；按下任意鼠标按键即可选定该记录。（d）将 Walter 中的数据分析结果导出至电子表格：完成数据拟合后，将弹出一个窗口并显示“7. Results”菜单。[左侧] 显示所选记录的图形（蓝色），以及由 Walter 生成的拟合扩散曲线（红色）。[右侧] 在“7. Results”菜单中，用户可通过点击“Excel”按钮，将分析数据写入电子表格程序。请点击此处查看该图的放大版本。

8. 脑片中的实时离子电渗

  1. 放置一个 400 µm将厚脑片放入记录室中，确保其完全浸没于流动的ACSF内。使用水彩画笔调整脑片位置，并用网格轻轻固定。
  2. 将离子电泳微电极和离子选择性微电极移至脑片目标区域上方，浸入流动的人工脑脊液中，但保持在脑片上方。
  3. 调整参考通道和离子感应通道的电压偏移 "0" 毫伏。等待两个通道的电压稳定。在图表记录仪上标记离子选择性微电极（ISM）的离子感应通道测得的电压。使用该值在Wanda中计算基线V参数。
  4. 放置离子敏微电极（ISM）和离子电渗微电极 200 µm 在切片深处 120 µm 彼此远离。将微电极插入脑片后，等待信号稳定。
    注意：施加于离子电渗微电极的偏置电流会导致四甲基铵（TMA）少量积聚。过早进行记录是常见错误，会导致低估信号累积。
  5. 在图表记录仪上，标记脑片在离子选择性微电极的离子感应通道测得的稳定电压。计算第8.3步与第8.4步测得的TMA信号之间的电压差，并将该值输入至 "基线 V（mV）" Wanda 图形用户界面的测量电极框中的字段图6a).
  6. 在图形用户界面左侧，确保所有实验参数均已正确记录或输入。设置 "培养基" 到 "脑" "迁移数" 与步骤 7.4 中计算的离子电渗微电极的平均值相比， "温度" 切片所在浴槽的温度。
    注意： V 每次测量都必须记录基线 V 将由 Wanda 转换为基线 C （毫摩尔）参数（即， 脑组织中TMA的浓度）
  7. 单击开始录制 "获取" 并让其完成一次完整的记录。在获取下一次记录之前，需等待TMA信号恢复至基线水平。
  8. 在将微电极从选定的脑区位置移除之前，连续采集两到三次记录。每次记录前，立即将测得的温度输入Wanda软件。
  9. 将两个微电极对角向后移动至切片表面，并将两者提升至至少 50 µm 切片上方。使用图表记录仪，确定当前测得的 V 值与步骤 8.3 中测得的 V 值之间的任何变化。
  10. 将离子选择性微电极（ISM）与电泳微电极的尖端在x、y和z轴方向上相互对准。如有间距变化，可从显微操作器控制箱的显示屏上获取。

9. 脑数据的分析

  1. 为分析结果新建一个电子表格。
  2. 重复Walter中的步骤7.1-7.4，以分析从脑组织中获得的记录数据。
  3. 在Walter菜单中点击“Excel”，将数据写入电子表格程序。记录脑细胞外间隙的α（容积分数）、λ（迂曲度）以及k（s-1）（非特异性清除率）。

10. 检查迁移数和离子选择性电极校准

  1. 使用以下方案在实验结束时测量 ISM 运输数（nt）。或者，在关键试验后或测量结果出现异常时检查 nt。然而，频繁检查 nt 可能会对脑片造成损伤。
  2. 在琼脂糖中重新进行记录。参见步骤 6.4、6.11、6.12、6.14、6.15 以及 6.17–6.22。
  3. 在 Walter 中重复步骤 7.1–7.4，以从新的琼脂糖记录中获得 nt。检查电子表格：如果新的 nt 与脑组织测量前获得的 nt 相差超过 10%，则该离子电泳微电极获得的数据不可靠。
  4. 在所有脑组织数据采集完成后，对 ISM 进行重新校准（参见步骤 3.29）。将新获得的 ISM 校准数据输入 Wanda Calibrate 对话框（参见步骤 6.9 和 6.10），并确认斜率值与前次校准相比差异小于 10%。
    注意：如果斜率值与前次校准相比差异超过 10%，则该 ISM 获得的数据不可靠。

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结果

通过设计一项实验来测量在低渗刺激过程中α的变化，展示了RTI技术的实用性（图8和图9）。先前的研究已表明，通过灌注低渗人工脑脊液（ACSF）降低细胞外液（ECS）的渗透压，会导致α减小，同时λ13增大。

在本实验中，对大鼠脑切片在对照条件以及低渗人工脑脊液灌流条件下进行了电阻抗成像（RTI）。制备了一根离子选择性微电极（ISM），并将其校准参数输入Wanda软件，拟合Nicolsky方程，计算得到斜率（M）为58.21 mV。将离子选择性微电极与电泳微电极置于琼脂中，彼此间距120 µm，以测量迁移数。共进行了三次记录，并按照实验方案第6步的程序对曲线进行拟合与分析（图8a<...

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讨论

figure-discussion-1
图10：显示常见技术问题的非理想数据。 (a离子电泳微电极常见技术问题示意图：正常功能微电极释放TMA与三种存在技术问题情况的对比。[高倍放大，a1] 在理想离子电泳源中，电流由TMA释放和氯离子摄取均等携带。[高倍放大，a2] 一个电阻过低的离子电泳微电极 nt 释放的TMA较少，摄取的氯离子多于正常情况。[高倍放大，a3] 显示电渗现象的离子电泳微电极释放TMA、氯离子和溶剂。[高倍放大，a4] 随时间推移释放量逐渐增加的离子电泳微电极即， "预热"). (b) 琼脂中获得的非理想数据图：该数据无法通过Walter拟合的曲线进行充分建模，因此无法准确解释；差异产生的具体原因尚不明确。c琼脂中获得的非理想数据表：琼脂中的正常或预期结果显示在第一行（以图表形式呈现...

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披露

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所资助，项目编号 R01 NS047557。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
A/D 和 D/A 转换器National Instruments CorporationNI USB-6221 DAQNI USB-6221 目前仍由 NI 作为“传统”设备销售。NI 建议在新安装中使用 NI USB-6341 X 系列 DAQ，但我们尚未测试更新的设备。本文描述了 NI USB-6221 与 MATLAB 和 Windows 7（32 位）的使用方法。替代方案：更早的 PCI-MIO-16E-4 A/D 转换器（仅限在 Windows XP 或更早操作系统下使用），搭配 BNC-2090 BNC 连接面板和 SH68-68-EP 电缆。如 Wanda 手册所述，已有实验性 MATLAB 程序可用于处理 Axon 二进制文件。
琼脂糖LonzaNuSieve GTG Agarose #50081用于制备稀释琼脂糖凝胶以进行 RTI 测量
ISM 放大器DaganModel IX2-700 双通道细胞内前置放大器离子和参考电压放大器，配备 N=0.1（参考毛细管）和 N=0.001（离子毛细管）的前置放大头
生物复合显微镜（配备 4x 和 10x 物镜）用于修整微电极尖端并检查微电极；多个供应商可选，例如 AmScope
硼硅酸盐 θ 型毛细玻璃管Harvard ApparatusWarner Instruments 型号 TG200-4；订单号 #64-0811双通道玻璃管，用于制备离子选择性微电极和离子电渗微电极；外径 2.0 mm，内径 1.4 mm，隔膜厚度 0.2 mm，长度 10 cm
画笔Winsor & NewtonUniversity Series 233，0 号圆头软柄画笔，可在 Amazon 购得
本生灯Fisher
用于观察微移液管的相机OlympusOLY-150需配备显示器，物镜下方照明器上的红外滤光片为可选配置
图表记录仪用于在四甲基铵标准液校准期间及 RTI 实验过程中连续记录离子选择性微电极上的电压；例如 Kipp & Zonen BD112 双通道图表记录仪，可购买翻新设备
三甲基氯硅烷，超纯，> 99%Sigma-Aldrich目录号 #92360用于硅烷化；注意：易燃，具有急性毒性（经口、经皮、吸入），可致皮肤腐蚀、眼部损伤，遇水剧烈反应，详见 Sigma-Aldrich 安全信息以获取完整说明
商用软件The MathWorksMATLAB，数据采集工具箱用于通过 Wanda 和 Walter 程序进行数据采集与分析。请注意，可申请学术许可。
护目镜Fisher
固定式复合显微镜OlympusBX51WI也可使用其他配备固定载物台的复合显微镜
镊子Fine Science Tools#11251-10用于修整玻璃毛细管；Dumond #5 镊子，建议使用已用过且不再用于精细操作的
通风橱用于硅烷化处理及用液体离子交换剂填充离子选择性毛细管尖端；多个供应商可选，例如 Erlab 销售的 Captair 配备适当滤芯
玻璃显微镜载玻片Fisher#12-550A用于修整微电极尖端
加热/搅拌器FisherCorning PC-420D用于制备稀释琼脂糖凝胶及搅拌溶液
离子电渗装置DaganION-100 和 PS-100ION-100 为单通道离子电渗装置，电压合规范围为 ±130 V；PS-100 为外接电源；替代方案：例如 Axon Instruments（现为 Molecular Devices）生产的 Axoprobe-1A，已停产，可查看翻新设备的供应情况（如 eBay 等网站）
四甲基铵用液体离子交换剂（LIX）World Precision InstrumentsIE190 钾离子交换剂注意：此产品等同于原始 Corning 钾离子交换剂 477317，基于四苯基硼酸盐；切勿与苏黎世 ETH Simon 博士实验室开发的中性载体钾离子交换剂混淆，后者无法感应四甲基铵，由 Fluka 销售。您也可自行配制四甲基铵用液体离子交换剂：将 3%（重量）四（对氯苯基）硼酸钾溶解于 2,3-二甲基硝基苯中。化学品可从 Fluka（现属 Sigma）购买。参见 Oehme 和 Simon（1976）Anal. Chim. Acta 86: 21-25；注意：该液体离子交换剂的毒理学性质尚未完全明确，摄入或接触人体可能有害，请谨慎操作！液体离子交换剂应储存在阴凉避光处。
微电极夹持器WPIM3301EH用于在硅烷化处理及用液体离子交换剂填充离子选择性毛细管尖端时固定离子选择性微电极预制件；WPI 销售两种版本的夹持器，透明 M3301EH 和黑色 M3301EH。根据我们的经验，透明 M3301EH 比黑色 M3301EH 更坚固。
显微操作器NarishigeMM-3用于在硅烷化处理及用液体离子交换剂填充离子选择性毛细管尖端时定位离子选择性微电极预制件；可用任何工作状态良好的三轴显微操作器替代
微移液管拉制仪Sutter InstrumentsModel P-97用于拉制双通道玻璃管；其他拉制仪也可使用，只要其能适配大直径双通道玻璃管
微探针温度计PhysiotempModel BAT-12R该温度计的细探针应放置在记录位点附近
针头BD注射器和针头 #305122（25 号）用于硅烷化处理；BD PrecisionGlide 针头 25 G × 5/8 英寸（0.5 mm × 16 mm）
5X 干式物镜OlympusMPlan N
10X 水浸物镜OlympusUMPlan FL N10X 物镜为水浸式，数值孔径为 0.3，工作距离为 3.3 mm
塑料容器（带盖）Fisher#14-375-148用于储存四甲基铵标准溶液和微电极
固定式显微镜用平台及 x-y 平移台EXFOGibraltar Burleigh平台用于承载切片室、显微操作器及其他附件，x-y 平移台可在不破坏记录稳定性的前提下移动显微镜
多孔微型杯用于在稀释琼脂糖凝胶中进行 RTI 测量；自制
可重复使用粘合剂BostikBlu-Tack用于固定微电极至夹持装置及其他用途；多个供应商可选，可在 Amazon 购得
具备精确 x、y、z 定位功能的机器人显微操作器Sutter InstrumentsMP-285需要两个显微操作器分别独立夹持离子选择性微电极和离子电渗微电极。也可将微移液管粘合成间隔阵列（见正文）。
带低通滤波器的信号调理单元Axon InstrumentsCyberAmp 320 或 380制造商已不再供货，但可能在 eBay 上有售；替代方案：例如 Cygnus Technology 的 FLA-01 滤波/放大器。该设备为单通道仪器，使用多极贝塞尔滤波器，最低截止频率为 10 Hz，但公司可根据需要修改为更低截止频率（2 Hz）。
银丝A-M Systems#7830直径 0.015"，裸丝（无涂层）
切片室Harvard ApparatusWarner 型号 RC-27L此为浸没式切片室；请勿使用界面式切片室
体视显微镜用于硅烷化处理及用液体离子交换剂填充离子选择性毛细管尖端；水平安装；多个供应商可选
10 mL 注射器BD注射器和针头 #309604用于反向填充微电极及硅烷化处理；BD 鲁尔锁头
0.22 µm 孔径注射器滤器Whatman#6780-1302用于过滤反向填充溶液；可在 Fisher 购得
28 号、97 mm 注射器针头World Precision InstrumentsMicroFil MF28G-5用于反向填充微电极
聚四氟乙烯（=PTFE）管Component SupplySTT-28 PTFE 管轻壁（28 号）用于离子选择性毛细管的硅烷化处理；可套在 BD PrecisionGlide 针头 25 G × 5/8 英寸上。注意：必须使用聚四氟乙烯，PVC 管会被热蜡熔化。
温度控制系统Harvard ApparatusWarner 型号 TC-344B 和 SH-27ATC-344B 为双通道自动温度控制器，SH-27A 为在线加热器；控制器和加热器可与 Warner 切片室配合使用
四甲基铵（TMA）氯化物Sigma-AldrichT-34115 M 溶液；注意：具有急性毒性（经口、经皮、吸入），致癌性，对水生环境有害，详见 Sigma-Aldrich 安全信息以获取完整说明
振动刀片式切片机LeicaVT1000S用于切割脑切片
二甲苯FisherX5-1用于硅烷化处理；注意：易燃，具有急性毒性（经口、经皮、吸入），可致皮肤腐蚀、眼部损伤，具有致癌性，详见 Fisher 安全信息以获取完整说明

参考文献

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