利用四甲基铵实时离子电渗法量化脑细胞外间隙的容积分数与迂曲度

摘要

本方案描述了实时离子电渗法，这是一种用于测量活体脑组织细胞外间隙（ECS）物理参数的方法。通过检测惰性分子在细胞外间隙中的扩散情况，可计算出细胞外间隙的体积分数和迂曲度。该方法适用于研究脑细胞外间隙的急性可逆性变化。

摘要

本文综述了实时离子电渗法（RTI）的基本原理与操作流程，该方法是研究和量化活体脑组织细胞外间隙（ECS）的金标准。ECS 包围所有脑细胞，内含组织间液和细胞外基质。许多脑功能所需物质（包括神经递质、激素和营养物质）的转运均通过 ECS 以扩散方式进行。在正常脑活动过程（如睡眠）以及病理状态（如缺血）中，该空间的体积和几何结构均会发生变化。然而，脑内 ECS 的结构及其调控机制，尤其是在疾病状态下的特性，仍远未被充分阐明。RTI 方法可测量活体脑组织的两个物理参数：容积分数和迂曲度。容积分数指 ECS 占组织总体积的比例；迂曲度则反映物质在脑区中扩散时所受阻碍程度的相对指标，相对于无障碍介质中的扩散而言。在 RTI 实验中，通过源微电极向脑 ECS 脉冲释放一种惰性分子；当分子从该源扩散出去时，使用距离约 100 µm 的离子选择性微电极随时间测量该离子浓度的变化。根据所得的扩散曲线，可计算出容积分数和迂曲度。该技术已被用于多种物种（包括人类）的脑切片以及活体（in vivo）研究，以探讨 ECS 的急性和慢性变化。与其他方法不同，RTI 能够实时检测脑 ECS 的可逆性与不可逆性改变。

引言

细胞外间隙（ECS）是存在于所有脑细胞外部的相互连通的通道网络，其中包含组织间液和细胞外基质（图1a 和 图1b）。许多脑细胞功能所需物质（包括营养物质、激素和神经递质）的分布通过ECS中的扩散实现。该间隙的物理参数（包括体积、几何结构和细胞外基质）的变化会显著影响物质在ECS中的扩散以及脑细胞所处的局部离子浓度，从而对脑细胞功能产生深远影响^1,2。

实时离子电渗（RTI）用于测定脑区的两个结构特征：容积分数和迂曲度^3,4,5。容积分数（α）是指在代表性基本体积中，细胞外间隙（V_ECS）所占组织体积与总组织体积（V_tissue）的比例；

方案

所有用于获取组织样本的动物实验操作均经纽约州立大学下州医学中心动物伦理委员会批准。

1. 溶液与设备的准备

1. 为离子选择性微电极（ISM）的参比毛细管准备150 mM NaCl反向填充溶液。将其储存在连接有0.22 µm滤器的10 mL注射器中（以去除细菌或颗粒）。
2. 为微电极准备150 mM四甲基铵氯化物（TMA-Cl）反向填充溶液。将其储存在连接有0.22 µm滤器的10 mL注射器中。本方案中的TMA-Cl溶液应由5 M的厂家储备液配制，以确保浓度准确。
3. 将至少四根银丝浸入漂白剂（次氯酸钠）中至少2小时，以制备微电极用的氯化银丝。用乙醇去除多余的漂白剂，并让银丝自然干燥。
4. 在烧杯中配制50 mL含0.3%琼脂糖、150 mM NaCl和0.5 mM TMA-Cl的溶液，并盖好。使用粉末状且相对新鲜的琼脂糖，以确保获得良好的扩散测量结果。
5. 使用搅拌子加热并混合琼脂糖溶液至完全溶解。待溶液冷却至室温后，可在4 °C下保存最多1周。
6. 制备一个由4%琼脂糖和1 M KCl组成的无关（接地）电极（制备方法见补充材料A）。
7. 制作一个小型多孔杯，使其可放入实验腔室中，并允许杯内外环境之间保持电连续性（图2a）。在杯底放置一个金属环，以防止其在部分浸入水中时漂浮。
8. 使用....

结果

通过设计一项实验来测量在低渗刺激过程中α的变化，展示了RTI技术的实用性（图8和图9）。先前的研究已表明，通过灌注低渗人工脑脊液（ACSF）降低细胞外液（ECS）的渗透压，会导致α减小，同时λ¹³增大。

在本实验中，对大鼠脑切片在对照条件以及低渗人工脑脊液灌流条件下进行了电阻抗成像（RTI）。制备了一根离子选择性微电极（ISM），并将其校准参数输入Wanda软件，拟合Nicolsky方程，计算得到斜率（M）为58.21 mV。将离子选择性微电极与电泳微电极置于琼脂中，彼此间距120 µm，以测量迁移数。共进行了三次记录，并按照实验方案第6步的程序对曲线进行拟合与分析（图8a<.......

讨论

图10：显示常见技术问题的非理想数据。 (a离子电泳微电极常见技术问题示意图：正常功能微电极释放TMA与三种存在技术问题情况的对比。[高倍放大，a1] 在理想离子电泳源中，电流由TMA释放和氯离子摄取均等携带。[高倍放大，a2] 一个电阻过低的离子电泳微电极 n_t 释放的TMA较少，摄取的氯离子多于正常情况。[高倍放大，a3] 显示电渗现象的离子电泳微电极释放TMA、氯离子和溶剂。[高倍放大，a4] 随时间推移释放量逐渐增加的离子电泳微电极即， "预热"). (b) 琼脂中获得的非理想数据图：该数据无法通过Walter拟合的曲线进行充分建模，因此无法准确解释；差异产生的具体原因尚不明确。c琼脂中获得的非理想数据表：琼脂中的正常或预期结果显示在第一行（以图表形式呈现.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
A/D 和 D/A 转换器	National Instruments Corporation	NI USB-6221 DAQ	NI USB-6221 目前仍由 NI 作为“传统”设备销售。NI 建议在新安装中使用 NI USB-6341 X 系列 DAQ，但我们尚未测试更新的设备。本文描述了 NI USB-6221 与 MATLAB 和 Windows 7（32 位）的使用方法。替代方案：更早的 PCI-MIO-16E-4 A/D 转换器（仅限在 Windows XP 或更早操作系统下使用），搭配 BNC-2090 BNC 连接面板和 SH68-68-EP 电缆。如 Wanda 手册所述，已有实验性 MATLAB 程序可用于处理 Axon 二进制文件。
琼脂糖	Lonza	NuSieve GTG Agarose #50081	用于制备稀释琼脂糖凝胶以进行 RTI 测量
ISM 放大器	Dagan	Model IX2-700 双通道细胞内前置放大器	离子和参考电压放大器，配备 N=0.1（参考毛细管）和 N=0.001（离子毛细管）的前置放大头
生物复合显微镜（配备 4x 和 10x 物镜）			用于修整微电极尖端并检查微电极；多个供应商可选，例如 AmScope
硼硅酸盐 θ 型毛细玻璃管	Harvard Apparatus	Warner Instruments 型号 TG200-4；订单号 #64-0811	双通道玻璃管，用于制备离子选择性微电极和离子电渗微电极；外径 2.0 mm，内径 1.4 mm，隔膜厚度 0.2 mm，长度 10 cm
画笔	Winsor & Newton	University Series 233，0 号	圆头软柄画笔，可在 Amazon 购得
本生灯	Fisher
用于观察微移液管的相机	Olympus	OLY-150	需配备显示器，物镜下方照明器上的红外滤光片为可选配置
图表记录仪			用于在四甲基铵标准液校准期间及 RTI 实验过程中连续记录离子选择性微电极上的电压；例如 Kipp & Zonen BD112 双通道图表记录仪，可购买翻新设备
三甲基氯硅烷，超纯，> 99%	Sigma-Aldrich	目录号 #92360	用于硅烷化；注意：易燃，具有急性毒性（经口、经皮、吸入），可致皮肤腐蚀、眼部损伤，遇水剧烈反应，详见 Sigma-Aldrich 安全信息以获取完整说明
商用软件	The MathWorks	MATLAB，数据采集工具箱	用于通过 Wanda 和 Walter 程序进行数据采集与分析。请注意，可申请学术许可。
护目镜	Fisher
固定式复合显微镜	Olympus	BX51WI	也可使用其他配备固定载物台的复合显微镜
镊子	Fine Science Tools	#11251-10	用于修整玻璃毛细管；Dumond #5 镊子，建议使用已用过且不再用于精细操作的
通风橱			用于硅烷化处理及用液体离子交换剂填充离子选择性毛细管尖端；多个供应商可选，例如 Erlab 销售的 Captair 配备适当滤芯
玻璃显微镜载玻片	Fisher	#12-550A	用于修整微电极尖端
加热/搅拌器	Fisher	Corning PC-420D	用于制备稀释琼脂糖凝胶及搅拌溶液
离子电渗装置	Dagan	ION-100 和 PS-100	ION-100 为单通道离子电渗装置，电压合规范围为 ±130 V；PS-100 为外接电源；替代方案：例如 Axon Instruments（现为 Molecular Devices）生产的 Axoprobe-1A，已停产，可查看翻新设备的供应情况（如 eBay 等网站）
四甲基铵用液体离子交换剂（LIX）	World Precision Instruments	IE190 钾离子交换剂	注意：此产品等同于原始 Corning 钾离子交换剂 477317，基于四苯基硼酸盐；切勿与苏黎世 ETH Simon 博士实验室开发的中性载体钾离子交换剂混淆，后者无法感应四甲基铵，由 Fluka 销售。您也可自行配制四甲基铵用液体离子交换剂：将 3%（重量）四（对氯苯基）硼酸钾溶解于 2,3-二甲基硝基苯中。化学品可从 Fluka（现属 Sigma）购买。参见 Oehme 和 Simon（1976）Anal. Chim. Acta 86: 21-25；注意：该液体离子交换剂的毒理学性质尚未完全明确，摄入或接触人体可能有害，请谨慎操作！液体离子交换剂应储存在阴凉避光处。
微电极夹持器	WPI	M3301EH	用于在硅烷化处理及用液体离子交换剂填充离子选择性毛细管尖端时固定离子选择性微电极预制件；WPI 销售两种版本的夹持器，透明 M3301EH 和黑色 M3301EH。根据我们的经验，透明 M3301EH 比黑色 M3301EH 更坚固。
显微操作器	Narishige	MM-3	用于在硅烷化处理及用液体离子交换剂填充离子选择性毛细管尖端时定位离子选择性微电极预制件；可用任何工作状态良好的三轴显微操作器替代
微移液管拉制仪	Sutter Instruments	Model P-97	用于拉制双通道玻璃管；其他拉制仪也可使用，只要其能适配大直径双通道玻璃管
微探针温度计	Physiotemp	Model BAT-12R	该温度计的细探针应放置在记录位点附近
针头	BD	注射器和针头 #305122（25 号）	用于硅烷化处理；BD PrecisionGlide 针头 25 G × 5/8 英寸（0.5 mm × 16 mm）
5X 干式物镜	Olympus	MPlan N
10X 水浸物镜	Olympus	UMPlan FL N	10X 物镜为水浸式，数值孔径为 0.3，工作距离为 3.3 mm
塑料容器（带盖）	Fisher	#14-375-148	用于储存四甲基铵标准溶液和微电极
固定式显微镜用平台及 x-y 平移台	EXFO	Gibraltar Burleigh	平台用于承载切片室、显微操作器及其他附件，x-y 平移台可在不破坏记录稳定性的前提下移动显微镜
多孔微型杯			用于在稀释琼脂糖凝胶中进行 RTI 测量；自制
可重复使用粘合剂	Bostik	Blu-Tack	用于固定微电极至夹持装置及其他用途；多个供应商可选，可在 Amazon 购得
具备精确 x、y、z 定位功能的机器人显微操作器	Sutter Instruments	MP-285	需要两个显微操作器分别独立夹持离子选择性微电极和离子电渗微电极。也可将微移液管粘合成间隔阵列（见正文）。
带低通滤波器的信号调理单元	Axon Instruments	CyberAmp 320 或 380	制造商已不再供货，但可能在 eBay 上有售；替代方案：例如 Cygnus Technology 的 FLA-01 滤波/放大器。该设备为单通道仪器，使用多极贝塞尔滤波器，最低截止频率为 10 Hz，但公司可根据需要修改为更低截止频率（2 Hz）。
银丝	A-M Systems	#7830	直径 0.015"，裸丝（无涂层）
切片室	Harvard Apparatus	Warner 型号 RC-27L	此为浸没式切片室；请勿使用界面式切片室
体视显微镜			用于硅烷化处理及用液体离子交换剂填充离子选择性毛细管尖端；水平安装；多个供应商可选
10 mL 注射器	BD	注射器和针头 #309604	用于反向填充微电极及硅烷化处理；BD 鲁尔锁头
0.22 µm 孔径注射器滤器	Whatman	#6780-1302	用于过滤反向填充溶液；可在 Fisher 购得
28 号、97 mm 注射器针头	World Precision Instruments	MicroFil MF28G-5	用于反向填充微电极
聚四氟乙烯（=PTFE）管	Component Supply	STT-28 PTFE 管轻壁（28 号）	用于离子选择性毛细管的硅烷化处理；可套在 BD PrecisionGlide 针头 25 G × 5/8 英寸上。注意：必须使用聚四氟乙烯，PVC 管会被热蜡熔化。
温度控制系统	Harvard Apparatus	Warner 型号 TC-344B 和 SH-27A	TC-344B 为双通道自动温度控制器，SH-27A 为在线加热器；控制器和加热器可与 Warner 切片室配合使用
四甲基铵（TMA）氯化物	Sigma-Aldrich	T-3411	5 M 溶液；注意：具有急性毒性（经口、经皮、吸入），致癌性，对水生环境有害，详见 Sigma-Aldrich 安全信息以获取完整说明
振动刀片式切片机	Leica	VT1000S	用于切割脑切片
二甲苯	Fisher	X5-1	用于硅烷化处理；注意：易燃，具有急性毒性（经口、经皮、吸入），可致皮肤腐蚀、眼部损伤，具有致癌性，详见 Fisher 安全信息以获取完整说明