培养昆虫细胞中重组蛋白的瞬时表达与细胞定位

摘要

非裂解型昆虫细胞表达系统在蛋白质生产、细胞内运输/定位以及重组蛋白功能分析方面尚未得到充分利用。本文介绍了在商业可得的鳞翅目细胞系中构建表达载体并进行瞬时蛋白表达的方法。同时展示了烟粉虱（Bemisia tabaci）水通道蛋白与亚细胞荧光标记蛋白的共定位分析。

摘要

异源蛋白表达系统可用于重组蛋白的生产、细胞内运输/定位的解析，以及在亚个体水平上确定蛋白质的生化功能。尽管杆状病毒表达系统在众多生物技术、制药和工业应用中正被越来越广泛地用于蛋白生产，但不涉及病毒感染的非裂解表达系统具有明显优势，却常常被忽视和未被充分利用。本文介绍一种构建非裂解表达载体及实现瞬时重组蛋白表达的方法。该方案可高效实现重组蛋白的细胞定位，适用于快速分析蛋白在细胞内的运输过程。我们展示了在一种 commercially available 昆虫细胞系中表达四种 重组蛋白，包括来自昆虫烟粉虱（Bemisia tabaci）的两种水通道蛋白，以及分别特异性标记细胞质膜和细胞内溶酶体的亚细胞器标记蛋白。所有重组蛋白均在其羧基末端与荧光蛋白标记物构建成融合蛋白，从而实现对重组蛋白的直接检测。通过将含有目的基因构建体的质粒与已知亚细胞定位标记物的质粒共转染细胞，可实现活细胞成像，并更有效地验证蛋白在细胞内的定位。

引言

利用昆虫细胞表达系统生产重组蛋白为真核蛋白的研究提供了诸多优势。具体而言，昆虫细胞具有与哺乳动物细胞相似的翻译后修饰、加工和分选机制，有利于获得正确折叠的蛋白质^1,2,3昆虫细胞系统通常也比哺乳动物细胞系需要更少的资源和更少的维护时间与精力^4,5杆状病毒表达系统就是一种基于昆虫细胞的系统，现已被广泛应用于多个领域，包括用于蛋白质表征和治疗用途的重组蛋白生产、用于疫苗制备的外源肽段和病毒蛋白的免疫原性呈递、多蛋白复合物的合成以及糖基化蛋白的生产。 等等.^1,2,4,6然而，在某些情况下，杆状病毒表达系统可能不适用^3,7，且使用非裂解性且瞬时的昆虫表达系统可能更为合适。具体而言，瞬时昆虫细胞表达系统能够实现重组蛋白的快速合成，所需开发与维护工作较少....

方案

1. 表达质粒构建的重叠延伸 PCR

注意：OE-PCR 中使用的所有引物见表1。所有扩增反应均建议使用高保真 DNA 聚合酶。然而，由于这些酶通常不会在产物 3' 端添加 A，因此在将 PCR 产物克隆至 TA 昆虫细胞表达载体之前，需使用 Taq DNA 聚合酶进行短暂的非扩增性孵育，以对产物进行"A加尾"。本方案展示了一种构建携带嵌合蛋白的昆虫表达质粒的方法，其中荧光蛋白与目标基因（本例中为两种 Bemisia tabaci 水通道蛋白）的羧基末端或亚细胞定位标记蛋白以同读框融合表达（图1）。

1. 使用OE-PCR（重叠延伸PCR），通过两轮独立的扩增反应生成：（1）目的基因的编码序列B. tabaci 水通道蛋白1：BtDrip1； B. tabaci 水通道蛋白2：BtDrip2_v1）与一种称为EGFP的绿色荧光蛋白变体进行同框融合，或（2）亚细胞标记物（黑腹果蝇 性肽受体：DmSPR Homo sapiens 磷脂酶A2（HsPLA2）与mCherry编码序列进行直接连接，将最终的OE-PCR产物直接连接至pIB/V5-His-TA质粒中。
   1. 第一轮OE-PCR（由A-D和A'-D'表示） 图1

结果

重叠延伸聚合酶链式反应

OE-PCR 可实现嵌合 DNA 产物的合成，该产物插入表达载体后，可表达出与任何目的测试基因及荧光标记蛋白相对应的重组嵌合蛋白。 图1 代表含有pIB表达载体的通用制备方案 B. tabaci 水通道蛋白编码序列（BtDrip1 和 BtDrip2_v1）与荧光蛋白标记物 EGFP 进行同框融合。在此方案中，生成了两种在羧基末端携带 EGFP 的 BtDrip 嵌合蛋白。本方案还展示了开发两种昆虫亚细胞标记蛋白 DmSPR 和 PLA2G15 的方法图1），在其羧基末端与mCherry融合形成嵌合体。选择EGFP和mCherry是因为它们的发射光谱差异足够大，能够实现对测试蛋白信号的独立检测与共定位例如., BtDrip-EGFP）以及DmSPR和PLA2G15-mCherry标记蛋白。所有PCR反应均扩增出预期.......

讨论

异源蛋白表达系统是生产用于多种下游应用的重组蛋白的重要工具⁴。从多种可用的表达系统中进行选择，取决于目标蛋白的最终用途。目前已有多种昆虫细胞表达系统，可作为原核和真核细胞表达系统的灵活替代方案^5,6。其中，依赖杆状病毒感染以驱动蛋白表达的昆虫系统是迄今为止最流行且应用最广泛的昆虫表达系统，许多用于科研和治疗用途的蛋白均通过该系统生产^1,2,3。然而，杆状病毒表达系统也存在一些局限性，包括：1）病毒生命周期会导致宿主细胞裂解；2）裂解的宿主细胞通常会释放大量降解酶；3）构建稳定细胞系耗时较长，且对于具有细胞毒性的蛋白可能不可行；4）非连续性表达需要频繁维护；5）载体构建通常需要多个克隆步骤；6）昆虫细胞密度往往与病毒感染效率呈负相关；7）重组蛋白主要被大量转运至细胞表面或被分泌出去

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
KOD DNA 聚合酶	EMD Millipore	71085-3	用于重叠延伸 PCR 产物 PCR 扩增的高保真 DNA 聚合酶
ExTaq DNA 聚合酶	TaKaRa-Clontech	RR001B	用于 PCR 产物 A 尾修饰的 DNA 聚合酶
EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA 聚合酶预混液	Lucigen	30033-1	用于细菌菌落 PCR 的 DNA 聚合酶
Biometra TProfessional Gradient 梯度 PCR 仪	Biometra/LABRepCo	070-851
LE 琼脂糖	Benchmark Scientific	A1705
SYBR Safe DNA 凝胶染料	ThermoFisher	S33102
Montage DNA 凝胶回收试剂盒	EMD Millipore	LSKGEL050
pIB/V5-His TOPO TA 表达试剂盒	ThermoFisher	K89020	包含克隆重叠延伸 PCR 产物所需的组分，包括线性化且经拓扑异构酶 I 激活的 pIB/V5-His-TOPO 载体、One Shot TOP10 化学感受态 E. coli 以及盐溶液
QIAprep Spin 质粒小提试剂盒	Qiagen	27104
QIAcube 自动化核酸纯化工作站	Qiagen	9001292
Purifier 垂直式洁净工作台	Labconco	3970401
Tni 培养昆虫细胞系	Allele Biotech	ABP-CEL-10005
Sf9 培养昆虫细胞系	Allele Biotech	ABP-CEL-10002
无血清昆虫细胞培养基	Allele Biotech	ABP-MED-10002
TNM-FH 昆虫培养基	Allele Biotech	ABP-MED-10001
IPL-41 昆虫培养基	ThermoFisher	11405081
Cellfectin II 转染试剂	ThermoFisher	10362100
16 cm 一次性细胞刮刀	Sarstedt	83.1832	带双位刀片的细胞刮刀
25 cm2 (T25) 带透气滤膜盖的组织培养瓶	Life Science Products	CT-229331
移液管	Fisher	1371120
无菌 50 mL 生物反应管	Life Science Products	CT-229475
PipetteBoy 移液器辅助器	VWR	14222-180
5 mL 刻度移液管	Sarstedt	86.1253.001
0.5 mL 平盖 PCR 管	Fisher	14230200
聚丙烯生物危害高压灭菌袋	Fisher	01828C
35 mm #1.5 玻底培养皿	Matsunami Glass	D35-14-1.5-U	培养皿直径 35 mm，玻璃直径 14 mm，玻璃厚度 1.5 mm，未包被
培养箱，型号 1510E	VWR	35823-961
Countess II FL 细胞计数仪	ThermoFisher	AMQAF1000
Countess 细胞计数载玻片（含 0.4% 台盼蓝试剂）	ThermoFisher	C10228
Fluoview FV10i-LIV 激光扫描共聚焦显微镜	Olympus	FV10i-LIV
HsPLA2/pCS6 质粒 DNA	transOMIC Technologies	TCH1303
pmCherry 载体	Clontech	632522
NucBlue Live ReadyProbes 试剂（Hoechst 33342）	ThermoFisher	R37605