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异基因富血小板血浆（PRP）对大鼠离断跟腱愈合过程的影响：方法学描述

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DOI：

10.3791/55759

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2018年3月19日

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1Experimental Surgery, GIGA-R & Credec, University of Liège, 2Laboratory of Connective Tissues Biology, GIGA-R, University of Liège, 3Department Argenco, University of Liège, 4Department of Clinical Biology, University Hospital of Liège, University of Liège, 5Physical Medicine and Sport Traumatology Department, FIFA Medical Center of Excellence, University Hospital of Liège, University of Liège

本文内容

摘要

本方案描述了在切除部分跟腱后，向大鼠注射同种异体富血小板血浆（PRP）或生理盐水后，对其肌腱愈合过程的评估方法。通过多种分析手段，在多个时间点对肌腱愈合的进展情况进行评价。

摘要

本文描述了用于观察富血小板血浆（PRP）是否能够对肌腱愈合产生积极影响的实验步骤。主要步骤包括四个环节：在跟腱上诱导产生损伤；制备PRP并将其（或生理盐水溶液）注射至损伤部位；取出跟腱；进行生物力学、分子和组织学评估。在每个步骤中，所有操作和方法均被详细描述，以便于实验的重复实施。

跟腱已通过手术切断（切除5毫米长的节段）。随后，注射富血小板血浆（PRP）或生理盐水，以研究PRP是否对跟腱愈合具有促进作用。实验共使用120只动物，分为3组，每组40只，每组再细分为两个亚组：PRP注射组和生理盐水注射对照组。在不同时间点处死动物（A组：5天；B组：15天；C组：30天），并取出跟腱。其中90条跟腱在进行转录组分析前接受生物力学测试，其余30条跟腱进行组织学分析。

引言

血小板在凝血、炎症过程以及免疫调节中的作用已被广泛认知1。近年来的研究进一步表明，血小板还具有修复功能2,3。事实上，血小板在脱颗粒过程中会释放多种细胞因子和生长因子（如VEGF、PDGF、TGF-B、IGF-I和HGF），这些生长因子可促进血管生成、组织重塑以及创伤愈合（包括骨、皮肤、肌肉和肌腱）2。通过离心自体血液可获得富含血小板的血浆（PRP），其血小板浓度因分离方法不同而异（通常为全血基础浓度的3至10倍）。然而，目前各种PRP制备技术尚无法获得完全一致的终产物。迄今为止，国际上对此仍无统一标准。总体而言，PRP可能是一种治疗慢性肌肉骨骼疾病（如肌腱病、足底筋膜炎、骨关节炎和骨不连）的有前景的治疗选择4。PRP最初应用于口腔外科和种植学领域4，以促进种植体植入后骨组织的修复并加速愈合过程。在本研究中，我们描述了一种可重复的方法，用于在动物实验中获取PRP4。

由于肌腱损伤在运动员和体力劳动者中较为常见，因此加快愈合过程以缩短恢复时间具有重要意义5。目前新兴的治疗方法常涉及生长因子的应用，而富血小板血浆（PRP）的使用是一种简便且微创的递送多种内源性生长因子的方法4。

若干 体外 或动物研究表明，通过输注富含血小板的血浆，可释放生物介质，从而通过释放生物介质刺激肌腱和韧带的修复6,7,8,9此外，其他研究已表明，富血小板血浆（PRP）可刺激肌腱细胞合成I型和III型胶原蛋白9,10,11还建议PRP可降低基质金属蛋白酶（MMPs）的活性，从而减少基质的降解。参与炎症过程的细胞可产生MMP-9，后者在炎症诱导的组织重塑（生理性和病理性）中发挥重要作用。12.

基于这些信息，我们提出假设：向大鼠切断的跟腱内单次注射富血小板血浆（PRP）可促进组织修复过程并提高修复组织的机械强度。通过在恢复过程中检测愈合跟腱的生物力学特性，并结合组织学和分子分析评估新生组织中胶原的重塑情况，来验证这一假设。本研究旨在观察单次注射同种异体PRP是否能够影响大鼠切断跟腱的愈合过程。

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方案

动物的饲养和操作均遵循美国国家科学院编制、美国国立卫生研究院（NIH）发布的《实验动物的护理和使用指南》，并严格遵守欧洲及国家相关法律法规。

1. 动物准备

  1. 使用132只体重为320-450 g的2月龄雄性Sprague-Dawley大鼠（120只用于实验，12只用于采血，图1）。根据Dell13的研究，每组15只大鼠即可达到0.8的检验效能（若存在指定效应，有80%的概率发现统计学显著性）。
  2. 将所有大鼠饲养于传统笼具中，在配备更衣站的普通设施内实施隔离饲养。在独立通风笼具（IVC）架中进行繁殖，并专门采购无特定病原体（SPF）级大鼠。
  3. 采用以下饲养条件：温度范围19-24 °C；相对湿度：40-60%；通风：每小时换气10-15次；光照/黑暗周期：12小时光照-12小时黑暗。
  4. 对所有笼具设备进行灭菌处理，并使用辐照垫料。通过在笼内放置无菌纸板托盘和毛巾，系统性实施笼内环境丰富化措施。
  5. 限制人员进入该区域，进入时须穿戴新的实验服、口罩、手套、鞋套和头帽。
  6. 根据FELASA14对普通设施的建议，每年对饲养在污染垫料上的哨兵动物进行一次群体健康监测。每笼饲养4至5只动物，提供适当的辐照饲料，并自由供应酸化水（ad libitum）。每日进行监测。
  7. 在手术前2小时，将选定接受手术干预的大鼠转移至带有过滤顶盖的笼具中，并送入手术室。

2. 手术步骤

  1. 准备手术器械：精细剪刀、钳子、两个止血钳和持针器。在所有操作过程中，均需佩戴手套、口罩、头罩和实验服。
  2. 将大鼠随机分为两组（PRP组和生理盐水组）。
  3. 将大鼠从笼中取出并称重。使用编号耳标识别大鼠。为防止角膜干燥，需在角膜上滴加水滴。
  4. 通过腹腔注射给予赛拉嗪（10 mg/kg 体重）和氯胺酮（80 mg/kg 体重）进行麻醉。为确认麻醉效果，将动物置于心肺监护仪下，并检查是否存在眼反射。
  5. 在颈部皮下注射50 µL丁丙诺啡 （0.01–0.05 mg/kg ，每8–12小时一次）作为镇痛剂。
  6. 使用电动剃毛器剃除左侧后肢的毛发，用等比稀释（1:10）的异波维碘/酒精溶液交替擦拭三次进行消毒，并将大鼠置于解剖显微镜下的加热垫（20 °C）上。使大鼠侧卧，待手术肢体处于上方位置，用手术镊固定足掌。
  7. 使用剪刀在左跟腱周围皮肤做一约20–25 mm的小侧方切口，用精细剪刀分离筋膜以暴露跟腱复合体（图2a）。
  8. 用剪刀切除趾长屈肌腱（图2b）。
  9. 在跟腱距其跟骨止点近端5 mm处横向切断，并用剪刀移除一段5 mm长的组织。无需缝合跟腱（图2c，2d）。
  10. 使用可吸收缝线进行连续缝合（叠盖缝合）依次缝合筋膜和皮肤。也可使用单丝缝线以防止液体从皮肤沿缝线渗入切口。
  11. 将大鼠置于加热灯下直至苏醒，然后放回笼中（58 × 38 cm）（Nota bene：不施加任何固定措施）。

3. PRP 的制备15

  1. 通过腹腔注射给予供体大鼠赛拉嗪（10 mg/kg 体重）和氯胺酮（80 mg/kg 体重）进行麻醉。术后2小时直接进行PRP注射，不再追加麻醉剂。
  2. 皮下注射50 µL丁丙诺啡作为镇痛药。
  3. 通过心脏穿刺采集全血（每只大鼠20 mL，终末放血），收集至含有3.2%缓冲柠檬酸钠（0.109 M，抗凝剂）的无菌试管中。随后通过心内注射实施安乐死。
  4. 为获得富血小板血浆（PRP），将血液在室温下以150 × g离心10分钟。此初始低速离心步骤产生两个明显分层：下层为红细胞（RBCs），约占总体积的80–90%；上层为富血小板血浆（PRP），通常占血样总体积的10–20%。
  5. 使用塑料移液管小心吸取上层PRP至另一塑料离心管中。由于PRP与红细胞之间的界面非常松散，移液时切勿过于接近界面。若操作得当，PRP中污染的红细胞应低于0.05 × 103 个/µL。弃去剩余的下层液体及原始采血管。
  6. 测定所收集PRP的体积，并使用血液分析仪检测血小板计数。这些数值用于下一步调整血小板浓度的计算。同时进行血细胞计数有助于评估是否存在红细胞和白细胞污染。此阶段PRP中的血小板浓度通常为1 – 1.5 × 106/µL。
  7. 将PRP在室温下以1,000 × g再次离心10分钟。此高速离心步骤形成松散的血小板沉淀及上清液，上清液为自体贫血小板血浆（PPP）。根据步骤3.6中测得的数据，计算需弃去的上清液体积，以浓缩PRP并达到最终浓度2.5 × 106/µL。
  8. 使用塑料移液管小心吸取上清液（PPP）至另一塑料离心管中，保留约三分之二步骤3.7计算所得的最终体积。由于沉淀较为松散，弃去PPP时会损失大量血小板，可能导致最终目标浓度降低。
  9. 用剩余的上清液通过轻柔反复吹打小心重悬血小板沉淀。测定该浓缩PRP的血小板计数。如有需要，加入适量自体PPP以达到最终目标浓度。
    注意：PRP应在制备后3小时内使用。
  10. 每毫升PRP中加入50 µL氯化钙（CaCl2，11 mEq/10 mL）以激活血小板。
  11. 在制备后约1小时，使用21G针头将50 µL新鲜PRP或生理盐水直接注射至缝合的手术部位。在此期间，将PRP置于室温保存。
  12. 术后数日内密切监测大鼠功能恢复情况，直至跟腱取出前。

4. 跟腱的切除与生物力学测试16

  1. 5、15 或 30 天后5，称量大鼠体重，随后通过腹腔注射给予赛拉嗪（10 mg/kg 体重）和氯胺酮（80 mg/kg 体重）进行麻醉。
  2. 皮下注射 50 µL 布托啡诺作为镇痛剂。在处死动物前取出肌腱，以尽可能维持其生理状态。
  3. 剃除左侧后肢的毛发，将大鼠置于解剖显微镜下，使其侧卧，待手术的腿位于上方位置，并用手指固定足掌。
  4. 在先前手术部位做一小切口（10 mm），并延伸切口直至暴露出腓肠肌三头肌。
  5. 为取出愈合中的跟腱，需在跟骨附着点远端 5–10 mm 处横向切断跟骨。随后分离与跟腱相连的部分腓肠肌三头肌组织（图 3b）。肌肉部分应足够大，以便能放入冷冻夹具中（图 3c-d）。立即使用镊子将样本放入冷冻夹具内（图 3e）。
  6. 在移除肌肉-肌腱-骨复合体后，通过心脏内注射戊巴比妥（200 mg/kg）处死大鼠，并持续观察 15 分钟，确认无心跳和呼吸以判定死亡。
  7. 将肌肉单元放入上部夹具中（图 3e），闭合夹具后垂直安装至万能材料试验机（106.2 kN，图 3a）。随后将骨骼部分固定于机器的下部夹具之间（图 3f）。
  8. 向上下两个夹具的槽中加入液氮，使肌肉迅速冷冻，使其刚度比肌腱高一个数量级，从而在拉伸测试过程中不发生变形。
  9. 当冷冻区域达到金属夹具边缘时，开始进行拉伸测试，以保持肌腱结构的完整性。设定试验机以恒定速度 1 mm/s 进行位移加载直至样本断裂，并在计算机上记录以牛顿（N）为单位的最大抗拉强度（UTS）。
  10. 为计算横截面积，设置两台相互垂直的相机拍摄样本，形成椭圆形轮廓，并拍照记录。
  11. 为校正愈合肌腱横截面积的差异，将最大抗拉强度归一化为单位面积上的数值（N/mm²），该值代表组织所承受的机械应力。

5. 组织学分析

注意：每组15条肌腱进行组织学分析。

  1. 取出后立即将跟腱浸入4%多聚甲醛中以保存其结构（组织每小时固定1 mm，因此固定时间根据肌腱大小而异）。
  2. 用70%乙醇替换多聚甲醛，并将样本在此溶液中至少放置一晚。
  3. 将肌腱放入带孔的小塑料容器中，并将该容器置于新鲜的70%乙醇溶液中1小时。
  4. 将容器置于95%乙醇中1小时，重复一次。
  5. 将容器置于100%乙醇中1小时，重复一次。
  6. 将容器置于100%二甲苯中1小时，重复一次。
  7. 现在将含有肌腱的塑料容器放入液态石蜡（56 °C）中，并过夜放置。
  8. 使用包埋仪（配备熔化石蜡、加热板和冷却板），选择最适合组织样本的金属模具，加入少量液态石蜡覆盖底部。
    注意：应正确摆放样本方向，以便在切片机上获得垂直切面。
  9. 当样本正确放置后，用液态石蜡填满模具，并将其置于制冷装置上，冷却至少15分钟。
  10. 从石蜡块中取出，并在冰上放置至少30分钟。
  11. 准备若干干净的载玻片，并在其上滴加一些去离子水。
  12. 在切片机上将石蜡块切成5 µm厚的切片（仅使用肌腱中部区域的切片），并将切片置于载玻片上。
  13. 将载玻片放入65 °C的烘箱中数分钟，使石蜡开始融化，从而将组织牢固粘附于玻片上。
  14. 将含有石蜡切片的载玻片放入切片架中。
  15. 通过以下连续浸泡步骤对组织进行脱蜡和复水：
    8分钟，二甲苯（浴槽1）
    4分钟，二甲苯（浴槽2）
    2分钟，100%乙醇
    2分钟，95%乙醇
    2分钟，70%乙醇
    2分钟，去离子水
  16. 进行苏木精-伊红染色时，将组织依次浸入以下溶液中：
    1. 将组织浸入苏木精溶液中8分钟（1 g苏木精一水合物，0.2 g KIO3，50 g AIK(SO4)2.12H2O；200 mL甘油；用蒸馏水定容至1 L）。
    2. 将组织在流动自来水下浸洗8分钟。
    3. 将组织浸入伊红溶液中30秒（0.25%伊红溶于100 mL蒸馏水中，含200 µL未稀释乙酸）。
    4. 将组织在流动自来水下浸洗2分钟。
  17. 进行Masson三色染色时，请按以下步骤操作：
    1. 复水后，将切片放入含铁明矾的容器中（0.5 g (NH4)Fe(SO4)2.12H2O溶于10 mL H2O），盖紧容器，在微波炉中以280 W加热3分钟。
    2. 静置冷却1分钟后，用去离子水冲洗。
    3. 将切片放入密闭容器中，加入Regaud苏木精溶液（0.5 g苏木精在50 °C下溶于50 mL H2O，然后加入5 mL 95%乙醇和5 mL甘油），以280 W加热90秒。
    4. 用去离子水冲洗。
    5. 将切片浸入苦味酸溶液（甲醇饱和溶液）中3分钟，随后在流动自来水下冲洗5分钟，再用去离子水浸泡数秒。
    6. 将切片浸入酸性品红溶液（0.5 g溶于50 mL H2O，含0.25 mL未稀释乙酸）中5秒，并在流动自来水下冲洗至染料完全消失。
    7. 将切片在磷钼酸溶液（0.5 g溶于50 mL H2O）中孵育5分钟，然后在去离子水中短暂浸泡数秒。
    8. 将切片浸入亮绿溶液（0.5 g溶于50 mL H2O，含0.25 mL未稀释乙酸）中5分钟，再置于流动自来水下冲洗至染料完全消失。
  18. 再次对组织进行脱水：
    1. 将切片浸入70%乙醇中1分钟。
    2. 将切片浸入95%乙醇中1分钟。
    3. 将切片浸入100%乙醇中1分钟。
    4. 将切片浸入二甲苯（浴槽1）中1分钟。
    5. 将切片浸入二甲苯（浴槽2）中1分钟。
    6. 取出切片时避免过多去除二甲苯，在样本上滴加一滴封片剂。
    7. 盖上盖玻片（避免产生气泡），静置至少2小时使其固化。
    8. 将每组中来自不同肌腱的5张组织切片在6 N HCl中水解3小时，并通过测定5 µm未染色切片中羟脯氨酸含量来评估胶原蛋白浓度。
  19. 使用制造商提供的软件，根据切片面积对结果进行标准化处理。
  20. 对部分切片进行亮绿染色，以便通过计算机辅助分析对纤维状胶原进行可视化和定量分析。
  21. 扫描切片，并使用IrfanView软件将图像转换为灰度图像，利用软件进行半定量分析（例如，Quantity One）。

6. 分子学评估

  1. 机械测试过程中发生肌腱断裂后，取出样本，立即在液氮中速冻，并于 -80 °C 保存（PRP 和生理盐水组）17。
  2. 使用商用总 RNA 试剂盒提取总 RNA17。
  3. 通过 RT-PCR 检测胶原蛋白（Col I 和 Col III）、基质金属蛋白酶（MMP-2、MMP-3 和 MMP-9）以及腱调节蛋白（TNMD）的表达水平17,18。
  4. 将 mRNA 的表达水平标准化至 28S 的表达水平19。

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结果

结果以均值表示 ± 平均值的标准差，并采用方差分析（ANOVA）进行比较。双因素方差分析（two-way ANOVA）和 事后检验 使用了参数检验中的谢费检验（Scheffé test）。

大鼠未损伤跟腱发生断裂所需的极限抗拉强度（UTS）为 42.0 ± 5.7 N（n = 10）。两个实验组在第5天后抗拉强度均显著增加（p<0.0001）。比较两组发现，PRP组在各个时间点的UTS均更高，尤其是在第15天和第30天。通过测量在进行生物力学评估前取出的跟腱横截面积（未损伤跟腱为11.4 ± 5.5 mm2）发现，第5天时生理盐水治疗组的横截面积较大；但在第15天和第30天，PRP组的横截面积更大，尽管与生理盐水治疗组相比，该数值的变异性更高（图4 和 图5）。

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讨论

血小板在肌腱愈合过程的早期炎症阶段起着至关重要的作用。当血小板暴露于诱导凝血的结缔组织或因子时，会释放储存在α颗粒中的生长因子。通过这一相互作用，细胞外基质大分子得以合成，间充质细胞发生增殖。血小板还对血液循环中的前体细胞具有趋化活性，可促进血管生成并刺激细胞分化6,20。

使用专为大鼠跟腱离体拉伸测试设计的夹具进行生物力学测试15。冷冻夹具可通过添加液氮使肌肉冻结，而作为标本下部的跟骨则直接固定在机器上。开始拉伸测试时，必须确保肌肉已完全僵硬，而肌腱仍保持柔韧性，这一点至关重要。该技术可避免组织损伤，保持力学完整性。此外，该方法操作简便、安全、无压迫性，且具有明确的可重复性，已有多个研究采用此方法4,15。

为了支持力学测试结果...

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致谢

本研究由列日标准基金和莱昂·弗雷德里克基金的莱茹-莱希安资助项目资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
赛拉嗪（Xyl-M）VMD无麻醉剂
氯胺酮（Jétamine 1000 CEVACEVA Santé 动物无麻醉剂
布托啡诺（Vetergésic 多剂量ALSTOE无止痛药
iso-聚维酮碘MEDA-Pharma无消毒剂
可吸收缝线Vicryl 6/0Johnson &安普和约翰逊
NembutalCEVA Santé 动物无麻醉剂
多聚甲醛Sigma-AldrichP6148保持组织结构的完整性
100% 异丙醇VWR20,922,364
95% 乙醇VWR20,823,362
二甲苯VWR28973.363
石蜡VWRLEIC3950.1006
苏木精Millipore1.15938.0025着色剂
伊红Millipore1.15935.0100着色剂
伊红染液Sigma-Aldrich3989封片剂
CaCl2

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