通过阻断外膜滋养血管灌注建立腹主动脉瘤的啮齿动物模型

摘要

将聚氨酯导管插入主动脉管腔并结扎缝合主动脉，可因外膜滋养血管灌注不足而引起慢性缺氧。本文介绍了一种新型的腹主动脉瘤（AAA）动物模型，其特征与人类腹主动脉瘤相似。

摘要

外膜滋养血管（VV）为主动脉壁提供氧气和营养。主动脉壁缺氧可导致腹主动脉瘤（AAA）增大。本文介绍并描述了一种标准实验方案，通过将聚氨酯导管插入主动脉腔并结扎肾下腹主动脉，造成外膜VV低灌注，从而诱导形成AAA。

该方案使用体重为300-400 g的雄性大鼠，自由摄取食物和水。ad libitum。通过腹正中切口开腹后，剥离腹主动脉，以阻断来自周围血管组织的血流。在肾动脉分支附近做一小切口行主动脉切开术，并使用18号留置针插入聚氨酯导管。缝合切口后，于导管上方对主动脉进行紧密结扎，从而通过主动脉壁从近端方向阻断静脉-静脉（VV）血流，同时不干扰主动脉本身的血流。该技术可诱导形成腹主动脉瘤（AAA），并伴随主动脉进行性扩张。

该模型最大的优势在于，VV 低灌注可导致组织缺氧，并引发腹主动脉瘤的形成，其形态学和病理学特征与人类腹主动脉瘤相似。

引言

腹主动脉由以下三层结构组成：内层血管壁（内膜）、中层（中膜）和外层血管壁（外膜），其中外膜具有独特的血液供应系统，称为血管滋养血管（vasa vasorum，VV）。主动脉组织的氧气供应依赖于外膜血管滋养血管的灌注以及来自主动脉血流的单纯氧气扩散¹。然而，从解剖位置上看，与主动脉其他部位相比，腹主动脉的血管滋养血管分布最少²。

既往一项研究报道了在具有较厚腔内血栓（ILT）的人腹主动脉瘤（AAA）壁中存在组织缺氧现象³。此外，研究还表明，动脉瘤壁中外膜血管（VV）发生动脉粥样硬化性改变而导致闭塞的比率显著升高，且与AAA壁内的组织缺氧相关⁴。基于这些发现，研究人员通过诱导外膜VV低灌注建立了一种新型的啮齿类动物AAA模型⁵。在该模型中，VV低灌注导致了组织缺氧以及肾下腹主动脉瘤的形成，其形态学和病理学特征与人类AAA相似⁶。典型的特征包括ILT的存在、增生性脂肪细胞的积聚⁶，以及发生破裂的潜在可能^7,8。这些特征在以往的啮齿类动物模型中极少被观察到。因此，该模型可能极大促进对AAA发生和发展及破裂机制的深入理解。本文介绍并描述了一种通过诱导外膜VV低灌注来建立AAA的标准实验方案，并阐述了如何利用外科技术在主动脉壁内诱导缺氧状态。

方案

动物饲养和实验均按照滨松医科大学动物饲养中心动物护理委员会的指南进行。

1. 建立模型的手术操作步骤

注意：术前将手术器械放入玻璃珠灭菌器中灭菌10秒。术中使用无菌手套。

1. 使用体重为300 - 400 g的雄性大鼠。允许大鼠自由摄食和饮水 随意摄取.
2. 使用异氟烷吸入麻醉大鼠（2.0 - 3.0 mL/L）。通过夹捏足趾确认麻醉效果。
3. 用电剃刀剃除腹部毛发，并用酒精和聚维酮碘溶液擦拭腹部。
4. 将大鼠仰卧位固定于手术台上。在麻醉期间，使用兽用眼膏涂抹大鼠眼睛，以防角膜干燥。
5. 使用剪刀沿腹中线作腹正中切口进行剖腹手术。为确保术野清晰，使用伤口牵开器并以无菌纱布将腹腔内容物包裹后推入腹腔内。
6. 使用镊子轻轻提起并撕开腹膜后组织，以暴露主动脉壁，并在腹膜后间隙中从左侧肾静脉水平至主动脉分叉处，将肾下主动脉从周围血管组织中剥离图1A).
7. 用5-0丝线结扎腹主动脉分支的血管，阻断血流供应，结扎位置应远离主动脉主干，避免造成主动脉管腔狭窄。
8. 为阻断主动脉血流，将血管夹置于肾动脉下方和主动脉分叉上方。
   注意：夹子的尺寸应大于主动脉直径，以完全阻断血流。也可使用临时的5-0丝线结扎来阻断血流，替代夹子。
9. 类似于在主动脉壁表面制造点状出血，使用显微剪刀剪开主动脉前壁 在主动脉夹远端5 mm处，靠近肾动脉分支的位置，插入一根聚氨酯导管。
10. 使用24号留置针将聚氨酯导管（外径0.55 mm，内径0.37 mm）经切口浅插入，注入清水冲洗主动脉内的血液。用1 mL注射器盛清水注入聚氨酯导管，冲洗主动脉中残留的血液。灌注完成后，将导管从主动脉中取出。
11. 在使用18号留置针插入聚氨酯导管（外径1.20 mm，内径0.94 mm）之前，将聚氨酯导管剪至10 mm长图1B).
    1. 将剪下的聚氨酯导管片段从第1.9步制作的切口插入主动脉管腔内。将10 mm导管完全置入主动脉管腔，并调整导管中点位置，使其与切口位置对齐即用导管覆盖切口。
12. 用间断缝合修复切口 使用8-0单丝线缝合（图1C).
13. 使用5-0丝线和聚氨酯导管结扎腹主动脉图1D).
    注意：留置导管可维持主动脉管腔通畅。应牢固结扎主动脉，以防止导管位置移位。建议使用外科结，因为在打第一个结扣时增加了一次扭转，形成双叠结，额外的缠绕可提供更大摩擦力，减少结的松脱。
14. 结扎后，移除腹主动脉分叉处的血管夹，然后移除肾动脉下方的血管夹以恢复顺行血流。确认腹主动脉明显的搏动。
15. 用4-0聚丙烯缝线将腹部切口分两层缝合，即腹膜层及其他各层。应严密缝合切口，以防器官脱出。
16. 在腹部切口处涂抹利多卡因。将大鼠置于加热垫上，直至其意识恢复。在大鼠恢复足够意识以维持胸卧位之前，不得无人看管。大鼠在手术后未完全恢复前，不得放回与其他大鼠同笼饲养。
17. 术后密切观察大鼠状态。若大鼠出现痛苦迹象或体重下降，应皮下注射无菌生理盐水（1.0 - 2.0 mL）一次。
18. 术后通过超声心动图观察扩张主动脉的时间进程变化。按照所述方法，测量腹主动脉从内侧缘至外侧缘的最大直径。⁵.

2. 收集、固定及弹性-范吉森（Elastica-van Gieson，EVG）染色

1. 术后28天，通过腹腔注射戊巴比妥钠 ≥ 100 mg/kg 以处死大鼠。
2. 沿腹壁正中切开大鼠腹腔，先用手术刀进行初始切口。使用剪刀取下动脉瘤，并将取出的主动脉置于10%中性缓冲福尔马林溶液中固定24–48小时。
   注意：手术过程中必须小心操作，避免损伤主动脉及其他器官。若观察到腹部器官隆起，则提示腹主动脉瘤（AAA）已形成。图2展示了体内（in vivo）和体外（ex vivo）图像；该代表性AAA样本未发生破裂。
3. EVG染色⁹
   1. 溶液配制
      1. 按以下顺序配制Verhoeff苏木精染液：20 mL 酒精性苏木精、8.0 mL 10% 氯化铁溶液和8 mL 碘-碘化钾溶液（Lugol's碘液），每次加入后充分混匀。该溶液可根据需要新鲜配制。
      2. 配制Van Gieson溶液：将1%酸性品红溶液1 mL与饱和苦味酸溶液45 mL混合，静置过夜后充分混匀。该溶液可稳定保存2周。
      3. 配制分化液（2%氯化铁）：将10 mL 10% FeCl₃溶液加入40 mL蒸馏水中混匀。该溶液可根据需要新鲜配制。
      4. 配制5%硫代硫酸钠溶液（5% hypo）：将5.0 g硫代硫酸钠溶解于100 mL蒸馏水中。该溶液可稳定保存1年。
   2. 染色步骤
      注意：详细步骤参见参考文献⁹。
      1. 将固定后的主动脉石蜡切片用蒸馏水短暂水化10分钟。将切片浸入Verhoeff苏木精染液中染色25分钟。水洗后，在分化液（2% FeCl₃）中浸蘸10–30次。再次水洗，随后置于5% hypo溶液中1分钟。水洗后，再放入Van Gieson溶液中染色5分钟。
      2. 依次以以下浓度酒精脱水：75%、90%、95%、100%和100%酒精，每级30秒。然后用二甲苯透明两次，每次5分钟。最后用树脂封片剂封片。
         注意：弹性纤维呈蓝黑色至黑色；细胞核呈蓝色至黑色；胶原纤维呈红色；其他组织成分呈黄色。

结果

所述手术技术通过结合聚氨酯导管置入与肾下腹主动脉结扎的方法，在大鼠中建立一种由慢性主动脉缺氧诱导的动脉瘤新型动物模型。文中所述大鼠 实验方案 术后28天处死动物，取主动脉进行成像以观察动脉瘤形成情况。 图2 显示梭形腹主动脉瘤的发展。主动脉的上端和下端 离体 直径正常，无扩张。主动脉直径采用经腹超声检查测量（图3直径通常在操作后约14天达到最大值，此后保持不变或略有增加。 图4 显示了EVG染色后动脉瘤在最大直径处的组织病理学图像。第28天（动脉瘤）的组织图像与第0天相比，弹性纤维出现明显降解。

图 1：诱导腹主动脉瘤（AAA）的手术步骤。
（A）将肾下腹主动脉从周围组织中游离出来。（B）将一段长10 mm的聚氨酯导管通过主动脉上的小切口插入。（C）使用8-0单丝缝线缝合切口，并恢复血流。（D）在插入的导管上方，用5-0丝线对主动脉进行结扎。比例尺 = 5 mm。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：术后代表性结果。
术后第28天的大体观显示梭形腹主动脉瘤的形成。腹膜后间隙增高的边缘对应于动脉瘤的外缘（虚线；左）。主动脉的上端和下端 离体 正常（右）。比例尺 = 3 mm。 请点击此处查看此图的放大版本。

图3：通过经腹超声测量的最大腹主动脉直径。
在此大鼠模型中，腹主动脉直径随时间持续增加。腹主动脉直径以均值±标准差表示（n = 12）。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：经Elastica van Gieson染色的动脉瘤组织代表性图像。
EVG染色组织学评估显示，术后28天中膜弹性板发生退行性变，并形成腔内血栓（右图）。第28天可见主动脉中膜弹性纤维断裂以及主动脉外膜胶原纤维稀疏。第0天为术前（左图）。比例尺 = 500 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

在生理条件下，主动脉壁的内层由管腔内血流通过扩散作用提供营养，而外层和中层则由滋养血管（VV）供血，这些血管从外膜穿透至中膜的滋养血管¹。进入腹主动脉壁的滋养血管血流可来源于以下三个方向/区域：（1）通过主动脉壁近端方向，（2）通过主动脉壁远端方向，以及（3）周围血管外组织¹⁰。既往我们对人类组织的组织学分析发现，腹主动脉瘤（AAA）壁中的滋养血管存在显著狭窄或闭塞，提示进入腹主动脉壁的滋养血管血流可能减少⁴。本实验方案中一个极为关键的要点是，肾下腹主动脉瘤是通过聚氨酯导管插入联合肾下腹主动脉结扎共同诱导形成的。为了精细剥离组织层次，外科操作必须将聚氨酯导管顺利插入主动脉，并牢固结扎主动脉，从而导致外膜滋养血管灌注不足，引发慢性缺氧及动脉瘤形成。采用这些技术后，主动脉壁内的血流随之减少，并诱导形成局部缺氧环境。血流减少及缺氧诱导的动脉瘤形成表明，滋养血管向腹主动脉壁的供血在AAA发病机制中具有重要作用。

具体而言，主动脉瘤模型必须满足以下条件：与基线相比，血管直径增加1.5倍，中膜发生退变，以及主动脉壁出现炎症。目前最常用的动物模型是通过使用某些物质诱导炎症反应构建的，例如CaCl₂¹¹、弹性蛋白酶¹²和血管紧张素II¹³。这些模型具有较高的可重复性，并能明显引起病理改变，因此在研究中被广泛使用。在本模型中，我们从手术前开始至术后第28天，每隔7天通过超声成像评估一次主动脉直径（图3）。结果显示，在28天内主动脉直径呈中度增加，表明该直径变化与既往啮齿类动物模型中的变化相似。对血管形态的大体观察显示为光滑的梭形结构（图2）。术后第28天，处死大鼠并取主动脉组织进行组织病理学分析。结果显示中膜和外膜的弹性纤维与胶原纤维出现撕裂和消失现象（图4）。此外，在外膜至中膜区域可见包括巨噬细胞在内的炎性细胞浸润。

目前，腹主动脉瘤（AAA）的治疗选择仅限于手术修复和血管内支架移植物植入，对于发生AAA破裂的患者，其死亡率高达30–50%¹⁴。然而，尚无任何药物被批准用于AAA的临床治疗。在AAA研究中，人类与常用动物模型之间的病理学表现是否存在差异，目前仍存在争议。人类AAA与动物AAA模型在发病机制上的相似性，对于开发药理学治疗方法至关重要。就啮齿类动物模型的有效性而言，本研究中的大鼠模型在管腔内血栓形成⁵和脂肪生成⁸方面在形态学上与人类具有相似性。此外，本研究中约20%的大鼠在手术后28天内发生了AAA破裂并死亡。尽管主动脉瘤破裂是该疾病最关键的事件，但在现有的实验性AAA模型中，破裂现象并不常见，其机制尚未阐明。因此，该模型有助于理解主动脉直径扩张及动脉瘤破裂的机制。

该模型的建立对于某些外科手术是必需的。因此，研究人员必须练习建立此模型，而这正是该模型的一个局限性。未来，我们希望创建一种啮齿类动物模型，通过逐渐增厚VV管壁以减少血流，从而导致自发性主动脉瘤的形成。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
大鼠	Japan SLC.Inc	Slc:SD 大鼠	Sprague–Dawley 大鼠TM
聚维酮碘溶液	Libatape Pharmaceutical Co., Ltd.	4987335 111457
5-0 丝线	Akiyama Medical MFG. CO.,LTD	JIS No.1
血管夹	Natsume Seisakusho Co., Ltd.	C-42-S-2
聚氨酯导管（24 号留置针）	MEDIKIT	24G	Supercath Z4VTM, 24 号留置针
聚氨酯导管（18 号留置针）	MEDIKIT	18G	Supercath Z3VTM, 18 号留置针
8-0 单股缝线	Ethicon Suture	c-42-S-2	PROLENE 聚丙烯缝线，用于缝合切口