一种通过上转换纳米粒子介导的激酶光激活远端触发细胞内信号转导的集成系统

摘要

在本实验方案中，将细胞信号转导生物效应分子——笼锁型蛋白激酶A（PKA）固定于纳米颗粒表面，显微注射至细胞质中，并通过近红外光（NIR）照射产生的上转换紫外光进行激活，从而诱导细胞质内下游应力纤维的解聚。

摘要

上转换纳米粒子（UCNP）介导的光激活是一种远程控制生物效应分子的新方法，具有更低的光毒性并可实现更深的组织穿透。然而，目前市场上的仪器尚不能直接适用于上转换应用，因此对商用仪器进行改造对该研究至关重要。本文首先介绍了对常规荧光分光光度计和荧光显微镜的改造方法，使其适用于光子上转换实验。随后描述了固定在UCNP复合物上的近红外（NIR）触发型笼锁蛋白激酶A催化亚基（PKA）的合成过程，并报道了显微注射和近红外光激活实验的操作参数。将笼锁PKA-UCNP复合物显微注射至REF52成纤维细胞后，近红外照射能高效激活活细胞内的PKA信号转导通路，其效果显著优于传统的紫外光照射。此外，通过设置阳性和阴性对照实验，证实了NIR照射特异性地触发了由PKA介导并导致应力纤维解聚的信号通路。因此，利用蛋白质修饰的UCNP为远程控制光调控细胞实验提供了一种创新性策略，尤其适用于需要避免直接紫外光暴露的研究场景。

引言

已开发出可光激活的化学修饰蛋白（例如，PKA 笼锁蛋白），作为化学生物学中的新兴领域，用于非侵入性地调控细胞内生化过程^1,2,3。利用光作为刺激手段，在激活这些笼锁蛋白时可实现优异的空间和时间分辨率。然而，紫外光可能引起细胞不必要的形态变化、凋亡以及DNA损伤^4,5。因此，近年来在光笼基团的设计中，研究重点集中在实现长波长或双光子激发下的光裂解，以降低光毒性并增强在深层组织中的穿透能力^6,7。响应长波长的笼锁基团使我们能够在存在两种或多种笼锁基团时，选择合适的解笼波长（即，通道），从而选择性地激活生物效应分子⁷。鉴于这些有益特性，开发新型红光响应光笼基团是光化学方法学中一项重要的前期工作，广泛应用于从反应机制探究到细胞活动调控等各类生物学研究⁸。然而，双光子笼锁基团通常因稠合芳香环结构而过于疏水，而可见光响应的笼锁基团通常为有机金属化合物，含有芳香配体。这种疏水性/芳香性特征在生物效应....

方案

注意：本实验方案详细描述了上转换辅助光激活的仪器改装步骤、笼锁型PKA-UCNP的合成方法、二氧化硅包覆的UCNP及笼锁型PKA-UCNP样品的透射电子显微镜（TEM）检测、紫外光与近红外光解装置、细胞准备、PKA-UCNP的显微注射、光激活研究，以及REF52细胞的应力纤维染色方法。

1. 上转换光谱测量用荧光仪的设置

1. 在荧光光谱仪的比色皿支架旁安装一个4倍物镜，使激光聚焦在比色皿的中心位置。
2. 将一个可调功率为0.5至8 W、波长为980 nm的激光二极管以90°角置于物镜旁。
   注意：操作人员需具备激光安全知识，并佩戴近红外（NIR）激光防护眼镜。
3. 在物镜与激光光路交汇处安装一个全反射镜。放置一块黑色阳极氧化金属板，以遮挡光谱仪的激发窗口，保护内部组件。
4. 将装有二氧化硅包覆上转换纳米粒子（UCNP）溶液（0.2–0.6 mg/mL）的比色皿放入比色皿支架中，以便观察到明亮的上转换发光光束，并利用该光束调整反射镜的最佳光路对准位置。
5. 将光谱仪切换至发光模式，并将光电倍增管（PMT）电压设为最低（若信号过弱，可适当调高）。调节反射镜至最佳对准状态，使光束位于比色皿中心，且PMT接收到最强信号。
6. 完成对准后，使用设定的激光功率测量上转换发光光谱。使用热电堆功率计建立激光功率与激光电源电流读数之间的校准曲线。持续监测激光器性能，确保其工作状态处于....

结果

笼状酶-上转换纳米粒子（UCNP）结构的设计如图1所示。首先将PKA酶与2-硝基苄基溴反应，生成无活性的笼状PKA，随后通过静电作用将其固定在UCNP表面。UCNP发射上转换光，进而光解Cys 199和Cys 343位点上的邻硝基苄基基团，释放出具有活性的PKA。透射电子显微镜（TEM）图像和Bradford测定证实，PKA及笼状PKA已成功固定于UCNP表面，并对紫外光解活化后的笼状PKA-UCNP溶液进行了激酶活性检测（图4）。PKA固定后，动态光散射仪测得PKA-纳米粒子复合物的粒径为120 nm，zeta电位为-16.0 mV。PKA-UCNP溶液的Bradford测定显示颗粒呈现明显的紫色，表明蛋白质固定水平高且稳定。

在细胞实验中，选择REF52大鼠胚胎成纤维细胞用于研究光激活效应。在本实验中，蛋白激酶A（PKA）通路可通.......

讨论

此前，Hofmann 及其同事发现，在将游离的 PKA 显微注射到 REF52 细胞后，可观察到显著的形态学变化¹⁹在另一项研究中，Lawrence 团队证明了笼锁型 PKA 可被激活 体内，导致在紫外线光解作用下发生形态学改变及应力纤维解体²⁰早期关于利用上转换紫外光进行光活化的报道表明，可通过上转换纳米粒子辅助实现多种笼锁小分子生物效应物的活化^21,22,23然而，利用上转换纳米颗粒（UCNP）辅助的光激活技术作用于最重要的一类生物效应分子——酶——的实验方案仍有待建立。因此，本研究中，我们描述了一种包含利用UCNPs实现近红外光激活笼锁型蛋白激酶A（PKA）的细胞实验方案。在此近红外光激活平台中，笼锁型PKA²⁰ 固定在二氧化硅包覆的上转换纳米颗粒（UCNPs）表面的物质被用于验证利用近.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
三（羟甲基）氨基甲烷	Sigma	154563
六水合氯化镁	Sigma	M9272
MOPS	Sigma	M1254
HEPES	Sigma	H4034
氯化钠	Sigma	31434
氯化钾	Sigma	12636
乙酸钇 水合物	Sigma	326046	Y(C2H3CO2)3 · xH2O
三水合乙酸铥	Alfa Aesar	14582	Tm(CH3CO2)3 · xH2O
四水合三水合乙酸镱	Sigma	326011	Yb(C2H3O2)3 · 4H2O
1-十八碳烯	Sigma	O806
油酸	Sigma	364525
甲醇	macron	304168
氢氧化钠	Sigma	30620
氟化铵	J.T.Baker	69804
IGEPAL CO-520	Sigma	238643
环己烷	J.T.Baker	920601
氢氧化铵（28% - 30%）	J.T.Baker	972101	氨
正硅酸四乙酯（TEOS）	Sigma	8658
二硫苏糖醇（DTT）	Sigma	D0632
N-羟基马来酰亚胺（NHM）	Sigma	226351	PKA 活性阻断试剂
猪胶原蛋白来源的 Prionex 蛋白稳定剂溶液	Sigma	81662	蛋白稳定剂溶液
2-硝基苄基溴（NBB）	Sigma	107794	PKA 笼锁试剂
8-(4-氯苯基硫代)腺苷 3′,5′-环磷酸单钠盐	Sigma	C3912	8-CPT-cAMP
兔骨骼肌来源的丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶酶	Sigma	P0294	PK/LDH
腺苷 5'-三磷酸二钠	Sigma	A2387	ATP
β-NADH 二钾盐还原型	Sigma	N4505
磷酸烯醇式丙酮酸	Sigma	P7127	PEP
考马斯亮蓝蛋白检测试剂，950 mL	Thermo Scientific	23200	Bradford 检测试剂
cAMP 依赖性蛋白激酶	Promega	V5161	PKA 活性对照
pET15b-PKACAT 质粒	Addgene	#14921
pKaede-MC1 质粒	CoralHue	AM-V0012
磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4	Thermo Scientific	10010023
DMEM，高糖，含丙酮酸	Gibco	12800-017	细胞培养基
Leibovitz L-15 培养基	Biological Industries	01-115-1A	细胞培养基
胎牛血清	Biological Industries	04-001-1A
多聚甲醛	ACROS	416785000
DAPI	Invitrogen	D1306	细胞核染色染料
Alexa 594-鬼笔环肽	Invitrogen	A12381	F-肌动蛋白染色染料
5(6)-羧基四甲基罗丹明	Novabiochem	8.51030.9999
Pierce 考马斯亮蓝（Bradford）蛋白检测试剂盒	Thermo Scientific	23200
CelluSep T4 透析管/标称滤膜截留分子量 12,000 - 14,000 Da	Membrane Filtration Products, Inc.	1430-33	透析膜
Millex-HV 注射器滤器，0.45 µm，PVDF，13 mm，γ 射线灭菌	EMD Milipore	SLHVX13NL
设备
动态光散射/ζ电位 Zetasizer nano-ZS	Malvern	M104
透射电子显微镜	JEOL	JEM-1400
荧光分光光度计	Agilent Technologies	10075200	Cary Eclipse
紫外-可见分光光度计	Agilent Technologies	10068900	Cary 50
荧光显微镜	Olympus	IX-71
950 nm 长通滤光片	Thorlabs	FEL0950
850 nm 短通二向色镜	Chroma	NC265609
RT3 彩色 CCD 系统	SPOT	RT2520
荧光照明系统	PRIOR	Lumen 200
980 nm 红外二极管激光器	CNI	MDL-N-980-8W
UV LED 点光源	UVATA	UVATA-UPS412	配备 365 nm UPH-056 LED，输出功率 200 mW/cm2
热电堆传感器	OPHIR	12A-V1-ROHS
Picospritzer III	Parker Hannifin	052-0500-900	细胞内微量注射分配系统
PC-10 玻璃毛细管拉制仪	Narishige	PC-10
MANOMETER 数字压力计	Lutron	PM-9100
单轴液压显微操作器	Narishige	MMO-220A
Heraeus Fresco 17 制冷离心机	Thermo Scientific	75002421