通过流式细胞术分析中枢神经系统中的小胶质细胞和单核细胞来源的巨噬细胞

摘要

本方案通过流式细胞术分析成年小鼠中枢神经系统中的巨噬细胞亚群，有助于研究这些细胞表达的多种标志物。

摘要

大量研究已证实免疫细胞，特别是巨噬细胞，在中枢神经系统（CNS）病理过程中的作用。CNS中存在两类主要的巨噬细胞群体：（i）小胶质细胞，即CNS的常驻巨噬细胞，起源于胚胎发育过程中的卵黄囊前体细胞；（ii）单核细胞来源的巨噬细胞（MDM），可在疾病状态下侵入CNS，起源于骨髓前体细胞。不同巨噬细胞亚群的功能因所研究的病理类型而异。此外，目前尚无统一共识确定用于区分这些巨噬细胞亚群的组织学标志物或判别标准。然而，通过流式细胞术分析CD11b和CD45标志物的表达谱，可有效区分小胶质细胞（CD11b⁺CD45^med）与MDM（CD11b⁺CD45^high）。在本实验方案中，我们证明密度梯度离心结合流式细胞术分析可用于表征这些CNS巨噬细胞亚群，并检测这些细胞表达的多种目标标志物，正如我们近期所发表的研究。因此，该技术有助于深入理解巨噬细胞在神经疾病小鼠模型中的作用，也可用于评估药物对这些细胞的影响。

引言

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）实质组织中的常驻巨噬细胞。它们具有两个关键功能：免疫防御以及维持中枢神经系统的稳态。与来源于骨髓造血干细胞并持续更新的单核细胞来源巨噬细胞（MDM）不同，小胶质细胞起源于胚胎发育期间由卵黄囊（YS）产生的原始造血祖细胞，并在胚胎期定植于脑组织^1,2,3。在啮齿类动物中，转录因子Myb对所有骨髓来源的单核细胞和巨噬细胞的发育至关重要，但对于卵黄囊来源的小胶质细胞而言，该因子并非必需，其分化过程仍依赖于转录因子PU.1⁴。

在健康的中枢神经系统（CNS）中，小胶质细胞是具有动态特性的细胞，能够持续监测其周围环境，扫描并识别入侵的病原体或组织损伤⁵。一旦检测到此类信号，便会启动一系列反应以修复损伤。小胶质细胞会迅速从分支状形态转变为阿米巴样形态，随后进行吞噬作用，并释放多种介质，如促炎性或抗炎性细胞因子。因此，根据其所处的微环境不同，活化的小胶质细胞可获得一系列不同的致敏状态⁶。

小胶质细胞对多种神经系统疾病的发育和进展具有深远影响。在阿尔茨海默病（AD）⁷、肌萎缩侧索硬化症（ALS）⁸、多发性硬化症（MS）⁹ 或帕金森病（PD）¹⁰ 的啮齿类动物模型中，小胶质细胞表现出双重作用：既可诱导有害的神经毒性，也可发挥神经保护作用，具体作用取决于特定疾病类型、疾病阶段以及是否受到全身免疫系统的影响^7,8,9,10,11。上述疾病中观察到的大多数中枢神经系统（CNS）病变均包含异质性的髓系细胞群体，不仅包括实质小胶质细胞，还包括血管周围和软脑膜巨噬细胞，以及浸润中枢神经系统的单核细胞来源巨噬细胞（MDM）。这些不同类型的细胞可能在与损伤和修复相关的病理生理机制中发挥差异性作用^{7,12,13,14,15}。目前，研究这些疾病模型的研究人员面临的主要挑战在于：确定外周单核细胞和巨噬细胞是否浸润中枢神经系统，以及如果发生浸润，如何将常驻小胶质细胞与这些浸润细胞区分开来。事实上，小胶质细胞具有高度可塑性；当其被激活时，会重新表达通常由外周单核细胞和巨噬细胞表达的标志物。因此，关键问题在于识别能够区分常驻小胶质细胞与浸润性单核细胞及巨噬细胞的特异性标志物。

由于缺乏特异性抗体，通过免疫组织化学方法在脑切片上区分这些细胞群体存在局限性。然而，流式细胞术是一种有效的技术，可用于检测多种标志物的表达，并区分不同的细胞群体（例如淋巴细胞、巨噬细胞/单核源性巨噬细胞 CD11b⁺CD45^high，以及小胶质细胞 CD11b⁺CD45^med）以及细胞亚群^16,17,18。本实验方案描述了在神经系统疾病小鼠模型中，通过优化的酶法组织解离和密度梯度离心法分离中枢神经系统单个核细胞的操作步骤；同时介绍了一种利用流式细胞术区分中枢神经系统中小胶质细胞与单核源性巨噬细胞群体的方法。

另一种方法是利用与特异性抗体偶联的磁珠去除髓鞘并纯化细胞^19,20,21。使用抗髓鞘磁珠去除髓鞘的方法成本较高，且会影响分离细胞的存活率和得率²²。该步骤以及后续的小胶质细胞免疫磁珠分离过程，限制了对特定免疫细胞亚群的进一步研究^21,22。

这些实验步骤为研究疾病发展过程中巨噬细胞亚群提供了简便的方法，并可用于确定药物作用或基因修饰对巨噬细胞表型及活化状态的影响。

方案

本研究所述所有方法均已获得ICM研究所机构动物护理和使用委员会以及Darwin French动物伦理委员会的批准，涵盖在方案01407.02之下。

1. 准备

1. 在1.5 mL离心管中配制消化液混合物，每只小鼠所需成分为：1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）；123 µL消化酶（见材料表），浓度为13 wunsch/mL（储存液），终浓度为1.6 wunsch/mL；以及5 µL DNase I（见材料表），浓度为100 mg/mL（储存液），终浓度为0.5 mg/mL。

2. 灌注与解剖

1. 使用戊巴比妥钠致死剂量（100 µL，400 mg/mL）处死小鼠。
2. 将动物仰卧放置，并用70%乙醇润湿身体表面。
3. 用精细剪刀在剑突下方剪开腹侧皮肤，暴露胸腔。
4. 切开膈肌，并用精细剪刀从尾侧向头侧方向剪开肋骨两侧，以暴露心脏（注意避免损伤其他器官）。辨认左心室（LV）和右心房（RA）。
5. 将带有25 G针头的蝶形导管插入左心室。用精细剪刀剪开右心房，在血液开始流出时，通过左心室以10 mL/min的流速灌注20 mL PBS，以清除血管中的细胞和血液；当肺和肝脏因血液被置换而变苍白时，表明灌注成功。
6. 用中型剪刀剪下动物头部。用精细剪刀解剖脊柱，并通过切除脊柱腹侧的腹壁肌肉以及在尾部基底处切断椎骨，将脊柱与身体分离。
7. 将装有PBS的10 mL注射器和连接的200 µL移液器吸头插入脊柱腰段，从颈段冲洗脊髓。
   注意：将200 µL移液器吸头的最宽端（约1 cm）用剪刀剪开，并紧密安装在预先装满PBS的10 mL注射器上。
8. 去除颅骨上方的皮肤，用镊子暴露脑组织。将剪刀尖插入颅底，沿矢状缝剪开颅骨。将小镊子插入切口，轻轻抬起颅骨。将脑组织从小鼠头部剥离，并切除嗅球和小脑。
9. 将脑组织和脊髓收集至含有1.128 mL PBS消化液混合物（来自步骤1.1）的1.5 mL离心管中。

3. 细胞解离

1. 用小剪刀将1.5 mL离心管中的脑和脊髓组织（步骤2.9）精细剪切成1–2 mm³大小的组织块（图1）。
2. 将含有剪碎组织的1.5 mL离心管置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育30分钟。
   注意：在此步骤中准备密度梯度液。
3. 向1.5 mL离心管中加入20 µL 0.5 M EDTA（储存液），终浓度为10 mM，以终止酶反应。
4. 用5 mL移液器轻轻吹打，制成单细胞悬液。
5. 将细胞悬液通过装在50 mL离心管上的尼龙滤网（孔径70 µm），使用10 mL注射器的推杆推动细胞悬液过滤。
6. 用20 mL含5%胎牛血清（FBS）的PBS冲洗尼龙滤网。
7. 室温（18 °C）下离心7分钟（300 × g）。用移液器小心吸弃上清液后进入下一步操作。去除上清液时务必格外小心，避免扰动沉淀物，以防沉淀被移液器吸入而丢失。

4. 密度梯度

1. 通过向密度梯度介质中加入适量的10倍浓度磷酸盐缓冲液（10x PBS），配制密度梯度介质的储备液。
   注意：将1份10x PBS加入9份密度梯度介质中。
2. 按照 表1 所述，用1x PBS将储备密度梯度介质稀释成不同浓度。
3. 用4 mL 30%密度梯度介质重悬步骤3.7所得沉淀，并转移至15 mL离心管中。
4. 将一根巴斯德吸管插入15 mL离心管底部，缓慢加入4 mL 37%密度梯度介质，使其位于下层。
5. 按照上述方法，加入4 mL 70%密度梯度介质。
6. 在室温（18 °C）下以800 × g离心40分钟。确保离心机停止时制动最小或无制动，以免干扰界面层。
   注意：离心后管内液体将呈现分层现象。位于70%与37%密度梯度界面处的细胞为单核免疫细胞（小胶质细胞和巨噬细胞亚群）；上层分别为细胞碎片和髓鞘（图2）。
7. 使用移液器小心移除髓鞘层。
8. 收集3–4 mL位于70%–37%密度梯度界面的细胞悬液（含巨噬细胞亚群），转移至洁净的15 mL离心管中。
9. 用PBS洗涤细胞3次，每次总体积为15 mL。确保含有细胞的密度梯度介质至少被PBS稀释三倍，并在4 °C下以500 × g离心7分钟，离心时制动需设为 "开启"。
10. 用1 mL PBS重悬细胞沉淀，用于细胞标记或其他功能检测。

5. 流式细胞术的细胞标记

1. 将细胞（步骤 4.10）转移至流式细胞术管中。
2. 向步骤 4.10 中获得的每份细胞样品加入 1 µL 可固定死细胞染色试剂。冰上孵育 30 分钟，避光。
3. 用 2 mL PBS 洗涤细胞一次，离心 5 分钟（300 × g，4 °C）。
4. 吸除上清液，用 400 µL 含 1% BSA 和 0.1% 叠氮化钠的 PBS 重悬细胞沉淀。
5. 向 100 µL 细胞中加入 1 µg CD16/CD32 抗体以阻断 Fc 受体。冰上孵育 10–15 分钟，避光。
6. 在含 1% BSA 和 0.1% 叠氮化钠的 PBS 或含 1% BSA、0.1% 叠氮化钠和 0.25% 皂苷的 PBS 中配制一抗混合液，用于细胞通透及胞内染色。
7. 加入 100 µL 一抗混合液（2×），冰上孵育 30 分钟，避光。
   注意：所有抗体在实验前均应进行滴定，以确保最佳结果。
8. 用 2 mL PBS 洗涤细胞，离心 5 分钟（300 × g，4 °C）。重复此步骤三次。
9. 若一抗未直接偶联荧光染料，则加入 100 µL 二抗，冰上孵育 30 分钟，避光。
10. 用 2 mL PBS 洗涤细胞，于 300 × g、4 °C 离心 5 分钟。重复此步骤三次。
11. 用 100 µL 1% 多聚甲醛（PFA）在室温下固定细胞 15 分钟，避光。
    注意：警告：PFA 具有毒性。应在通风橱中操作，并穿戴个人防护装备。
12. 用 2 mL PBS 洗涤细胞，于 300 × g、4 °C 离心 5 分钟。重复此步骤三次。
13. 用 200 µL PBS 重悬细胞沉淀，进行流式细胞术检测与分析。参照图 3中的设门策略。

结果

密度梯度离心和抗体染色后，使用流式细胞仪采集细胞，并采用以下形态学设门策略进行分析。首先在前向散射面积（FSC-A）点图中设定第一个门 与 前向散射高度（FSC-H）用于区分单细胞与双联体图3A）。随后将单细胞在FSC-A上设门 与侧向散射面积（SSC-A）点图，用于根据细胞相对大小和细胞颗粒度排除细胞碎片和浓缩细胞图3B然后，根据小胶质细胞和单核细胞来源的巨噬细胞（MDM）对CD11b和CD45标志物的表达水平进行鉴定（图 3C，3D）。最后，针对每种巨噬细胞亚群分析了其他表达标志物（图3E-3G报道称，小胶质细胞表达CX3CR1，但不表达CCR2标志物，而单核细胞来源的巨噬细胞则不同²³

讨论

已有研究表明，小胶质细胞和骨髓源性巨噬细胞（MDM）在中枢神经系统中具有不同的功能和表型，因此鉴定和分析这些巨噬细胞亚群对于深入理解神经系统疾病至关重要。^9,18,25通过使用两种标记物（CD11b 和 CD45）进行流式细胞术分析，可区分各亚群图3C）。该策略先前已通过使用其他特异性标志物（如用于单核细胞来源巨噬细胞的 CCR2 和用于小胶质细胞的 CX3CR1）进行验证，并结合最近开发的一种使用抗 Tmem119 抗体的方法图3E-3G）。我们使用 CCR2 和 CX3CR1 抗体进行了实验（图3F，3G如我们先前发表的那样¹⁸

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5月龄小鼠	Janvier	C57BL/6J
Liberase TL 研究级	Sigma-Aldrich	5401020001	消化酶
牛胰脱氧核糖核酸酶 I	Sigma-Aldrich	DN25
Percoll	GE Healthcare Life Sciences	17-0891-01	密度梯度介质
70 µm 尼龙细胞滤筛	Corning	731751
Venofix 25 G	BRAUN	4056370
活塞式注射器 10 mL	Terumo	SS+10ES1
巴斯德吸管 230 mm	Dustcher	20420
1.5 mL 离心管	Eppendorf	0030 123.328
15 mL 离心管	TPP	91015
50 mL 离心管	TPP	91050
5 mL 聚苯乙烯圆底管	BD Falcon	352054
D-PBS (1x)，不含 Ca2+/Mg2+	Thermo Fisher Scientific	14190-094
D-PBS (10x)，不含 Ca2+/Mg2+	Thermo Fisher Scientific	14200-067
胎牛血清	Thermo Fisher Scientific	10270-106
EDTA	Sigma-Aldrich	E4884
30% 牛血清白蛋白溶液	Sigma-Aldrich	A7284
32% 多聚甲醛溶液	Electron Microscopy Sciences	15714-S	注意 - 有毒
皂苷	Sigma-Aldrich	S2002
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	47036
PerCPCy5.5 大鼠抗小鼠 CD11b（克隆 M1/70）	eBioscience	45-0112
PerCP-氰青5.5 标记大鼠 IgG2b K 同型对照	eBioscience	45-4031
BV421 大鼠抗小鼠 CD45（克隆 30-F11）	BD Biosciences	563890
BV421 大鼠 IgG2b, κ 同型对照 RUO	BD Biosciences	562603
兔抗小鼠 TMEM119（克隆28 - 3）	Abcam	ab209064
AlexaFluor 647 驴抗兔 IgG	Life Technologies	A31573
抗小鼠 CD16/CD32 纯化抗体	eBioscience	14-0161	小鼠 Fc 封闭
可固定死细胞染色试剂盒	Invitrogen	L34969
小鼠 CCR2 APC 标记抗体	R&D	FAB5538A
大鼠 IgG2B APC 标记同型对照	R&D	IC013A
小鼠 CX3CR1 PE 标记抗体	R&D	FAB5825P
山羊 IgG PE 标记抗体	R&D	IC108P
离心机	Eppendorf	5804R
细胞分析仪	BD Biosciences	BD FACSVERSE
数据分析软件	FlowJo LLC	FlowJo
精细剪刀	F.S.T	14090-11
标准型镊子	F.S.T	11000-13
梅奥剪刀	F.S.T	14010-15
Dumont #5 镊子	F.S.T	11251-20