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方法文章

通过流式细胞术分离原代小鼠视网膜神经节细胞（RGCs）

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DOI：

10.3791/55785

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2017年7月5日

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1Department of Ophthalmology, Hamilton Eye Institute, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Microbiology, Immunology and Biochemistry, University of Tennessee Health Science Center, 3Department of Anatomy and Neurobiology, University of Tennessee Health Science Center, 4Department of Pharmaceutical Sciences, University of Tennessee Health Science Center

本文内容

摘要

数百万人患有导致不可逆失明的视网膜退行性疾病。这些疾病的一个共同特征是视网膜神经节细胞（RGCs）的丧失。本详细实验方案描述了通过流式细胞术结合阳性与阴性筛选方法分离原代小鼠RGCs的技术。

摘要

神经退行性疾病通常对患者造成毁灭性影响。视网膜神经节细胞（RGC）的丢失与多种疾病相关，包括糖尿病性视网膜病变和青光眼，也见于正常衰老过程。尽管RGC具有重要功能，但由于其仅占视网膜中多种细胞的一小部分，因此一直极难开展研究。此外，目前的分离方法依赖细胞内标志物来鉴定RGC，导致所获得的细胞无法存活。这些技术还涉及耗时较长的分离流程，因此缺乏实用、标准化且可靠的RGC获取与分离方法。本研究描述了一种高效、全面且可靠的方法，通过基于阳性与阴性筛选标准的方案，从小鼠视网膜中分离原代RGC。该方法为未来RGC的研究提供了可能，旨在更深入理解神经退行性疾病中功能性RGC丢失所导致的视力显著下降。

引言

视网膜神经节细胞（RGCs）为终末分化的神经元，因此实验需使用原代细胞。建立一种用于分离与富集原代小鼠视网膜神经节细胞（RGCs）的实验方案，对于揭示RGCs健康与退变机制具有重要意义 体外这一点对于旨在开发潜在疗法以促进视网膜神经节细胞（RGC）功能并减少其死亡的研究尤为重要。RGC的退化与多种视网膜变性疾病相关，例如青光眼、糖尿病性视网膜病变以及正常衰老过程。尽管导致RGC丢失的具体细胞机制尚不明确，但已鉴定出一系列风险因素。视神经头部缺氧1,2,3 导致RGC死亡4 并作为单个视网膜神经节细胞内兴奋性和抑制性受体激活之间稳态平衡的干扰因素5,6一系列挑战阻碍了这些细胞在深入研究中的应用。首先，小鼠视网膜中视网膜神经节细胞（RGCs）的数量较少。RGCs约占视网膜总细胞数的不到1%7,8,9其次，大多数RGC特异性标记物是细胞内蛋白10,11,12基于这些标记物的筛选会导致细胞失去活力，从而无法进行后续的功能分析。最后，目前可用的方案耗时较长且缺乏标准化13,14早期的RGC分离方案基于免疫平皿法。Barres 等15 改良了经典的免疫平皿分离技术，并增加了一个步骤，即在基于抗胸腺细胞抗原（又称Thy1）免疫阳性进行阳性筛选之前，先从大量视网膜细胞中去除单核细胞和内皮细胞。数年后，Hong 等 结合磁珠分离技术与细胞分选策略，以更高纯度分离视网膜神经节细胞16磁性微珠的使用仍在许多科学研究中被广泛应用。磁性微珠与流式细胞术方案结合，可提高分离细胞的纯度。然而，目前尚未建立标准化的纯化系统，用于从解离的鼠视网膜中分离视网膜神经节细胞（RGCs）。

流式细胞术是一种强大的分析方法，可测量细胞悬液的光学和荧光特性。该技术以高灵敏度对细胞进行定性和定量分析，实现对细胞群体的多维度分析。细胞的区分主要基于两个关键物理特性：细胞大小或表面积，以及颗粒度或内部复杂性17。通过结合使用具有相似激发波长但不同发射波长的荧光染料标记抗体，可实现多维度分析。流式细胞术具有快速、可重复且灵敏度高的优点。多种类型的激光器使得流式细胞术能够对单个细胞进行更广泛的多维度分析。因此，该技术是细胞学样本研究中极具吸引力的方法。荧光激活细胞分选（FACS）则利用流式细胞术识别出的多维度表型差异，将单个细胞分选到不同的亚群中。

在过去的十年中，多种细胞表面和细胞内蛋白被鉴定为可用于细胞（包括神经元）筛选的潜在生物标志物。早期从大鼠中分离视网膜神经节细胞（RGCs）的研究采用Thy1作为神经节细胞的标志物。然而，Thy1 又称为 CD90在其他啮齿类物种中具有多种同工型18,19,20 并在多种视网膜细胞类型中表达19,20，使其成为RGCs的一种非特异性标记物。另一种表面标记物CD48存在于视网膜中的单核细胞群体，包括巨噬细胞和小胶质细胞。利用这两种表面标记物，可建立一种改良的RGC特征性标记—Thy1+ 和 CD48阴性 细胞——已开发15,16,21,22遗憾的是，仅靠这两个筛选标准不足以获得高度富集的视网膜神经节细胞（RGC）群体。为解决这一尚未满足的需求，开发了一种流式细胞术方案23 基于已知细胞表面标志物的多层正向与负向筛选标准，富集和纯化原代小鼠视网膜神经节细胞。

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方案

本方案中详述的所有操作程序均经田纳西大学健康科学中心（UTHSC）机构动物照护与使用委员会（IACUC）审查委员会批准，并遵循视觉与眼科研究协会（ARVO）关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明，同时遵守实验动物研究指南（国家实验动物资源研究所、公共卫生服务政策关于实验动物的人道照护与使用）。

1. 仪器、溶液和培养基的准备

注意： 本实验方案中报告的所有材料、试剂、工具和仪器的信息均在材料表中详细列出。

  1. 将所有解剖器械进行高压灭菌，并存放于无菌区域。使用以下器械：4 把标准镊子（2 把长镊和 2 把短镊）和 2 把剪刀，以及用于解剖的 2 把镊子（1 把长镊和 1 把短镊）和 1 把剪刀；另备一套作为备用。
  2. 配制 100 mL 无菌 PBS/1% FBS 溶液，用于洗涤、免疫标记和细胞分选步骤。将溶液置于 4 °C 冰浴中保存。
    注意：切勿向溶液中添加叠氮化钠（NaN3），因其对活细胞具有毒性。
    1. 使用 99 mL PBS 和 1 mL FBS 配制 100 mL PBS/1% FBS 溶液。
  3. 配制 100 mL 无菌神经细胞培养基，添加 3% FBS（见材料表），用于细胞收集和培养。将细胞培养基保持无菌状态，并在 4 °C 保存。仅在使用前将其升温至室温（RT）。
    1. 使用 97 mL 神经细胞培养基和 3 mL FBS 配制 100 mL 含 3% FBS 的神经细胞培养基。
  4. 将预先加入 5 mL 收集培养基的收集管（15-mL 管）放入冰桶中进行预冷。仅使用聚丙烯管，以防止细胞黏附于管壁。
  5. 将 40-mm 培养皿、70-µm 尼龙筛网、注射器、细胞筛研磨杵以及无菌聚丙烯管放入生物安全柜中。在操作前对所有物品进行灭菌，并在整个操作过程中保持无菌状态。
    注意：视网膜收集后的所有步骤均需在生物安全柜中进行。

2. 去核

注意：本实验共使用10只幼年（5-7周龄）C57BL/6J小鼠，以分离获得表型为CD90.2+CD48negCD15negCD57neg的1.0 × 106个RGCs。

  1. 使用 CO2 吸入法处死小鼠，随后进行颈椎脱位。务必采用第二种处死方法，以确保动物已死亡。
    注意： 可使用异氟烷作为 CO2 的替代品。不推荐使用氯胺酮，因其作为麻醉诱导剂时可能引起眼内压（IOP）升高24,25。
  2. 将镊子插入眼球下方，夹住视神经并向上提起；眼球将被完整摘除，且视神经保持完整。将收集的眼球置于含有 PBS 的小瓶中，并将小瓶置于冰上，直至进行下一步操作。
    注意： 任何人员在接受实验动物护理单位（LACU）的适当培训后，均可执行此步骤。

3. 视网膜细胞悬液的制备

  1. 将采集的眼球置于解剖显微镜的底板上，开始角膜解剖。每次解剖一个眼球。
  2. 使用镊子小心夹住视神经基部的眼球。此步骤建议使用一把长镊子和一把短标准镊子。
  3. 使用30号（30G）锐利针头穿刺角膜，使房水从眼球中排出，以便更稳固地用镊子夹持眼球。
  4. 用镊子夹住角膜，使用剪刀在角膜上做一小切口。用镊子轻轻剥离角膜和巩膜。当眼球被剥离至一半时，用镊子将视网膜和晶状体卷出。弃去角膜、巩膜和晶状体。
    注意： 此方法可确保视网膜完全与眼球其余部分分离。
  5. 将视网膜放入含有PBS/1% FBS的小型40 mm培养皿中。
    注意： 除培养皿外，也可使用细胞培养皿。务必始终保持视网膜湿润，以模拟生理状态。
    1. 在生物安全柜内，用新鲜无菌的PBS/1% FBS将每个视网膜清洗三次。
  6. 将最多12个视网膜置于已用PBS/1% FBS润湿的无菌70 µm尼龙滤网上。使用10 mL注射器的尾端，以环形动作轻轻研磨视网膜，使细胞解离。
    1. 替代方法：可使用研杵对细胞滤网进行研磨，或使用含15 IU/mL木瓜蛋白酶、5 mM L-半胱氨酸和200 U/mL DNase I的混合液在37 °C下消化15分钟，随后用PBS/10% FBS终止反应。
      注意： 比较酶消化法与注射器尾端或研杵机械研磨法时，细胞回收率百分比未见明显差异。
  7. 为转移分离的细胞，将无菌70 µm尼龙滤网置于聚丙烯收集管上方。使用P1000移液器将收集的细胞通过滤网。用PBS/1% FBS冲洗滤网（步骤3.6），以释放残留细胞，并将其转移至收集管中。
  8. 加入PBS/1% FBS，使终体积达到每只视网膜1 mL。将细胞悬液在室温下以200 × g离心7分钟。
    注意： 根据研磨的视网膜数量（< 6个视网膜），细胞沉淀可能过小而不可见。
    1. 弃去上清液，按每5个视网膜加入1 mL PBS/1% FBS的比例重悬细胞沉淀。
  9. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。
    1. 用70%乙醇清洁玻璃血细胞计数板和盖玻片。轻轻涡旋含有细胞的离心管，确保视网膜细胞悬液均匀分布。取20 µL 0.4%台盼蓝加入微量离心管中，再加入20 µL细胞悬液，混匀。
    2. 轻轻混匀后，取10 µL 0.4%台盼蓝/细胞悬液混合物滴加至血细胞计数板，使两个计数室均被填充；毛细作用会将混合液吸入盖玻片下方。在显微镜下计数所有未被台盼蓝染色的细胞，该数值代表活细胞数量。
    3. 使用以下公式计算细胞活力：活细胞数 / 总细胞数 = 活力百分比。
      注意： 若细胞活力低于95%，在进行流式细胞术（FACS）时需使用荧光染料区分细胞活力。
  10. 使用一种不能穿透活细胞的荧光活力染料。用PBS洗涤细胞以去除任何血清残留。在终体积为100 µL的溶液中，每5.0 × 106个细胞加入1 µL用于细胞活力鉴定的荧光染料。避光、室温孵育15分钟。加入10倍体积的PBS/1% FBS。在室温下以200 × g离心5分钟。
  11. 如有需要，将细胞悬液在4 °C下孵育过夜。若进行此操作，应使用神经细胞培养基而非PBS/1% FBS补满细胞悬液管。将离心管水平放置，并保持在4 °C环境中。

4. 视网膜细胞的免疫标记

  1. 使用以下换算关系确定每细胞数量所需的抗体体积：每 5.0 × 106 个细胞在 100 µL 体积中加入 2 µL 抗体。
  2. 用 PBS/1% FBS 洗涤细胞并维持细胞悬浮状态。在分选设置时，取少量细胞（5.0 × 106 个细胞）作为阴性对照（未标记）。
    注意：该阴性对照对于细胞分选仪的正确校准至关重要。
  3. 为尽量减少抗体与表达 Fcγ 受体 II 和 III 的细胞发生非特异性结合，使用 PBS/1% FBS 将抗小鼠 CD16/32 抗体以每 1.0 × 106 个细胞加入 1 µL 的比例加入，终体积为 50 µL。室温孵育 10 分钟。
  4. 将抗体混合液加入样品中，并通过移液轻轻混匀。在冰浴中孵育 30 分钟。确保冰浴容器加盖，避免光照，以免标记的荧光染料发生光漂白而影响实验结果。
    1. 使用以下荧光标记的抗小鼠抗体配制抗体混合液：CD90.2 AF-700、CD48 PE-Cyanine7、CD15 PE 和未标记的 CD57。
      注意：每种抗体在每 5.0 × 106 个细胞中的使用浓度如下：CD90.2 AF700 为 1 µg；CD48 PE-Cyanine7 为 0.4 µg；CD15 PE 为 0.02 µg；未标记 CD57 为 0.4 µg。
      1. 根据以下计算确定使用体积（基于材料表中列出的商业化抗体）：共需标记 5.0 × 107 个细胞；每 5.0 × 106 个细胞使用 2 µL，即每种抗体使用 20 µL；共 4 种抗体，抗体混合液总体积为 80 µL；终体积 = [(5.0 × 107 总细胞数)/5.0 × 106 个细胞] × 100 = 1,000 µL；80 µL 抗体 + 50 µL 抗小鼠 CD16/32 抗体 + 870 µL PBS/1% FBS = 1,000 µL。
        注意：该组合为当前仪器配置提供了最佳的荧光染料组合。以下参数总结了各染料的激发与发射波长：AF-700 在 638 nm 红色二极管激光激发下，发射波长为 719 nm；PE-Cyanine7 在 488 nm 蓝色二极管激光激发下，发射波长为 767 nm；PE 在 488 nm 蓝色二极管激光激发下，发射波长为 575 nm。
  5. 30 分钟孵育后，用 PBS/1% FBS 将体积补至 5 mL。在室温下以 200 × g 离心 7 分钟，洗涤样品。重复一次该步骤，以彻底去除未结合的抗体。
  6. 加入 2 µL 二抗（0.1 µg），使其结合 5.0 × 106 个细胞上的 CD57。在冰浴中孵育 30 分钟，操作同步骤 4.4。随后按步骤 4.5 洗涤细胞两次。
    1. 若在步骤 4.4中使用了未标记的一抗，则需用二抗对细胞进行标记。
      注意：该实验配置所选用的二抗列于材料表中；其发射波长为 421 nm。使用 405 nm 紫色二极管激光激发时，应配合 450/50 nm 带通滤光片使用。
    2. 根据以下计算确定使用体积（基于材料表中列出的商业化抗体）：每 5.0 × 106 个细胞使用 2 µL，即二抗总体积为 20 µL；终体积 = [(5.0 × 107 总细胞数)/5.0 × 106 个细胞] × 50 = 500 µL；20 µL 抗体 + 480 µL PBS/1% FBS = 500 µL。
  7. 将标记后的细胞维持在 PBS/1% FBS 中。使用血细胞计数板计数细胞；最终视网膜细胞浓度应为 3.0 – 4.0 × 107 个细胞/mL。
    注意：不得使用细胞培养基稀释细胞，因为酚红会增加自发荧光，从而降低阴性与阳性细胞之间的分辨能力。最终每单位体积的细胞浓度高度依赖于仪器配置的流速。
  8. 在设置过程中使用单色对照，以最小化荧光溢出。
    注意：此步骤也称为补偿，用于校正由多种荧光染料组合产生的信号干扰。使用 PBS/0.1% BSA/2 mM NaN3 中的聚苯乙烯微球，其可结合来自多个物种的荧光标记免疫球蛋白（Ig）同型，作为阳性对照以设定补偿参数。
    1. 将 3 滴聚苯乙烯微球加入无菌 FACS 管中，每种荧光染料对应一管。向每管中加入 1 µg 对应的荧光染料。避光、室温孵育 15 分钟。向样品管中加入 3 mL PBS/1% FBS。在室温下以 200 × g 离心 5 分钟。小心吸除上清液，并将沉淀重悬于 250 µL PBS/1% FBS 中。
    2. 设置阴性对照时，使用不能结合 Ig 的聚苯乙烯微球。如有需要，可在前一天完成此步骤。

5. 细胞分选策略

注意：FACS 仪器设置的具体说明，使用 355 nm（紫外光）、405 nm（紫光）、488 nm（蓝光）和 640 nm（红光）激光器，对应的荧光通道数分别为 2、2、5 和 3。操作软件为 DIVA 版本 8.0.1。细胞分选采用 70 μm 喷嘴，鞘液压力为 70 psi，频率为 87.5，振幅为 48.6，首次液滴断裂位置为 333，间隙设置为 6，分选精度设为四路纯度模式，纯度掩码使用默认值（32），并通过微珠将液滴延迟调整至 42.98。

  1. 使用15 mL聚丙烯圆锥形管作为收集容器。向每根管中加入5 mL收集液（细胞培养基），并旋转管子以润洗管壁。
    注意： 此步骤可防止细胞粘附到收集管的管壁上。作为替代方案，可用未稀释的FBS包被管壁。
  2. 考虑细胞分选仪的分选效率，以估算细胞的最终得率。
    注意： 分选效率因所使用的流式细胞仪而异。表达CD90.2的RGCs+CD48阴性CD15阴性CD57阴性 表型约占所有视网膜细胞的1%。
  3. 由经过培训的操作人员（通常在核心设施中）进行细胞分选。在采集样本前，确保仪器已用70%乙醇清洁并灭菌。同时，用70%乙醇仔细擦拭收集管的外表面。
  4. 如果细胞已沉降或发生聚集，分选前需用移液器反复吹打重悬细胞，并通过无菌的40 µm尼龙滤网过滤。细胞分选过程中必须控制温度，保持在4 °C；否则将导致细胞得率降低。
  5. 在进行实验前，与细胞分选仪操作人员讨论分选的详细步骤。
    注意： 在实验进行时，细胞分选仪操作员将已在流式细胞仪采集软件的工作区工具栏上点击了一系列按钮。这些按钮包括 浏览器, 流式细胞仪, 检查员, 工作表，以及 采集仪表盘此处使用的细胞分选策略称为两路分选。收集两个群体：富集的视网膜神经节细胞（RGCs）和所有其他细胞类型。如果需要收集更多细胞群体，最多可额外分离两个群体，实现四路分选。若需收集额外的细胞群体，细胞分选仪需要使用不同的收集管并进行相应的设置调整。
  6. 进行补偿以校正荧光染料的光谱重叠。
    注意： 此过程可通过手动调节各项设置完成，也可作为所用软件的一部分自动完成。大多数细胞分选设备的软件均提供自动补偿选项，该方法被视为金标准，是目前最准确的补偿类型。此步骤将使用阴性（无荧光染料）样本以及利用专为结合实验中所有相关单克隆抗体而设计的聚苯乙烯微球（补偿微球）制备的单染对照样本。
    1. 选择 实验 > 补偿设置 > 创建补偿对照. 从屏幕上显示的列表中添加荧光染料特异性对照。点击 好的.
      注意： 每个对照组都将显示一个补偿管。
      1. 使用未标记对照（无荧光染料， 步骤 4.2) 以验证前向散射光（FSC）、侧向散射光（SSC），并圈定初始细胞群（P1）。
    2. 将阴性对照管安装到流式细胞仪上，点击加载。确认目标细胞群显示后将其选中，此为细胞群1（P1）。右键点击P1门，选择 应用于所有补偿对照. 点击 记录数据录制完成后，单击 卸载 并移除试管。
    3. 将下一根管子安装到细胞仪上，如屏幕所示。重复此步骤 步骤 5.6.2 直到所有对照组的数据记录完毕。
    4. 选择 实验 > 补偿设置 > 计算补偿保存设置并命名实验。点击 链接 & 保存.
      注意： 补偿是必要的步骤，因为它可以消除检测器之间的光谱重叠。
    5. 若需手动补偿，应调整各荧光染料阳性信号的均值，使其与阴性信号相等。
      注意： 此步骤由细胞分选仪操作完成，可能需要30分钟。
  7. 门控策略（ 图3A).
    1. 通过绘制FSC与SSC的散点图来设定P1；其中FSC反映细胞大小，SSC反映细胞内部复杂性。参见 图3A.
    2. 使用选定的细胞群绘制SSC-H（高度）与SSC-W（宽度）的伪彩色图 步骤 5.7.1 （P1）；伪彩色图可直观呈现细胞间相对密度的分布情况。
      注意： 较低的细胞密度以蓝色和绿色表示，而较高的细胞密度则以红色和橙色区域表示。
      1. 执行此步骤以仅收集单细胞；单细胞门称为 P2。参见 图3A.
    3. 重复步骤 5.7.2 使用P2圈选单细胞，以FSC-H为横轴、FSC-W为纵轴作图。确保单细胞的选群准确 "双联体" 或细胞团块同时含有阳性和阴性标记物，导致假阳性结果。
    4. 绘制 CD90.2 与 CD48 的伪彩色图。选择所有 CD90.2+CD48阴性 细胞以去除RGC富集中的单核细胞；将此门设为CD90.2+CD48阴性，或 P3。参见 图3A.
    5. 使用选定的CD90.2+CD48阴性 群体或 P3 门控，绘制 CD57 与 CD15 的伪彩图，以从 RGC 富集中去除无长突细胞污染。圈选 CD15阴性CD57阴性 群体。参见 图3A.
  8. 确定样本采集的目标人群 "排序布局" 窗口并继续进行细胞分选；待收集的样本为 CD90.2+CD48阴性CD15阴性CD57阴性.
    注意： 待分选的群体从下拉菜单中选择 添加 排序窗口中的菜单。添加群体后，系统将提示输入目标事件数或需要收集的事件数量。随时可通过点击 排序位置 含有该细胞群的区域中，表型为CD90.2的RGCs占0.9% ± 0.3+CD48阴性CD15阴性CD57阴性 来自年轻（5-7周龄）和0.5% ± 0.3以及年老（>12月龄的C57BL/6J小鼠23.
  9. 使用25,000个细胞进行纯度检测23参见 图3B- E.
    注意： 纯度检测是重新分析已分选细胞以验证细胞分选准确性的过程。取少量已分选的细胞上样至流式细胞仪，以确认分选效果。

6. 视网膜神经节细胞内标志物的验证

  1. 细胞内标记。
    1. 将分选后的细胞在 4 °C 条件下固定 1 小时并进行透化处理，以使细胞代谢失活，并允许细胞内抗体进入细胞。
    2. 在透化溶液中稀释以下抗体：RNA 结合蛋白多剪接体（RBPMS）抗体，按 1:100 稀释，原液浓度为 100 µg/mL；γ-突触核蛋白（SNCG）抗体，1:100 稀释，原液浓度为 1 mg/mL；脑特异性同源盒/POU 结构域蛋白 3A（BRN3A）抗体，1:100 稀释，原液浓度为 200 µg/mL；神经元特异性 III 类 β-微管蛋白（TUJ1）抗体，1:100 稀释，原液浓度为 1 mg/mL。将细胞与抗体溶液在加盖的冰桶中孵育 1 小时。
    3. 用 PBS/1% FBS 洗涤样品两次。
    4. 将细胞重悬于适当的一抗来源的 AF488 标记二抗中，按 1:200 稀释，在冰桶中孵育 30 分钟。
    5. 样品洗涤步骤同 步骤 6.1.3。将细胞保存在 PBS/1% FBS（250 µL）中，待分析时使用。

7. 通过qPCR分析验证细胞分选结果

注意：参见图4。

  1. RNA 提取23。
    1. 通过细胞裂解和匀浆，随后加入氯仿，从 5.0 × 105 个分选细胞中提取 RNA。
    2. 将上层无色相转移至洁净的微量离心管中，进行醇沉淀，然后通过离心柱浓缩提取物。在柱上进行 DNase 消化。
    3. 用无 RNase 的水洗涤柱子，以洗脱 RNA。
    4. 通过分光光度法测定 RNA 浓度。
  2. cDNA 合成与预扩增。
    1. 取 100 ng RNA 样品，与含有逆转录酶、重组核糖核酸酶抑制剂（防止 RNA 降解）、氯化镁（MgCl2）和脱氧核苷三磷酸的溶液混合。
    2. 混匀管内成分，先在 25 °C 孵育 10 分钟，再在 42 °C 孵育 60 分钟。最后在 85 °C 孵育 5 分钟以终止反应。将所得 cDNA 储存于 -20 °C，待用。
      注意：若无法立即进行预扩增步骤，cDNA 样品可在 -20 °C 保存长达一个月。
  3. cDNA 预扩增。
    1. 使用一系列针对多种视网膜细胞类型的特异性引物对 cDNA 进行预扩增，包括：视网膜神经节细胞、无长突细胞、星形胶质细胞、Müller 细胞、双极细胞、水平细胞、光感受器细胞以及视网膜色素上皮细胞，具体引物见参考文献 23 及材料表。
      注意：预扩增反应旨在提高定量检测的灵敏度。该反应包含来自材料表中的引物混合物、2.5 µL 起始量为 100 ng RNA 的 cDNA、逆转录酶以及无核酸酶水，最终体积为 10 µL。
    2. 先在 95 °C 激活酶 10 分钟，随后进行 14 个循环：95 °C 变性 15 秒，60 °C 退火延伸 4 分钟。将预扩增产物用 Tris-EDTA 缓冲液按 1:10 稀释后，保存于 -20 °C，待用。
  4. 7.4 qPCR 反应。
    1. 使用稀释后的预扩增 cDNA（2.5 µL）、引物（见材料表）、无核酸酶水以及含有 DNA 聚合酶和脱氧核苷三磷酸的浓缩液，配制终体积为 10 µL 的所有 qPCR 反应体系。
    2. 采用以下仪器程序运行 qPCR：50 °C 保持 2 分钟，随后 95 °C 保持 10 分钟；然后进行 40 个循环，每个循环为 95 °C 变性 15 秒，60 °C 退火延伸 1 分钟。所有测定均设三个重复。
    3. 在确定每个样品中内参基因和目标基因的 CT 值后，使用比较阈值法（CT）进行相对定量。相对表达倍数（Rq）按以下公式计算：Rq = 2T –∆C，其中 ∆CT = CT 目标基因 – CT 参考基因23。
      注意：CT 定义为报告荧光染料信号超过人为设定阈值时所对应的 PCR 循环数26。CT 值与反应中扩增子（PCR 产物）的初始量呈反比。

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结果

RGCs 的深入研究受到多种因素的阻碍，包括其数量稀少以及缺乏高效且标准化的分离方法。 图1 展示了用于视网膜分离的方法学。根据分析类型的差异，去眼球操作步骤可能存在变异，例如当去眼球是作为 体内 实验27本方案中的去核操作在已实施安乐死的小鼠上进行。如图所示 图1A-B用镊子置于眼球下方并轻轻上提，以引起最少出血，并完整摘除带有视神经的眼球。

不同小鼠品系之间的视网膜神经节细胞（RGC）数量存在差异，尤其是在基因改造小鼠中尤为明显23,28,29

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讨论

FACS 是纯化细胞群体的首选技术。其他分离方法包括免疫贴壁法、磁珠分选以及补体固定耗竭法。FACS 相较于这些方法的优势在于能够同时识别具有不同强度的细胞表面标志物。荧光分子的强度与蛋白表达量成正比。迄今为止，RGC 的分离仅依赖于 Thy1（CD90）阳性及 CD48 阴性15,16,22,34，无论采用何种分离方法。最近研究表明，Thy1+CD48neg 表型不足以分离出表达 RGC 胞内标志物的均一细胞群体23。准确识别 RGC 群体对其分离至关重要，尤其是因为它们仅占视网膜细胞的一小部分7,8,9。...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者谨此感谢微生物学、免疫学与生物化学系高级插画师蒂姆·希金斯先生（Tim Higgins）在技术视频方面的协助；感谢马修·威尔逊博士（Matthew W. Wilson）的讨论，以及贾布隆斯基（Jablonski）和莫拉莱斯-蒂拉多（Morales-Tirado）实验室成员提供的有益意见。本研究得到了阿尔康研究基金会青年研究者奖（VMM-T）、田纳西大学研究基金会（VMM-T）、国立眼科研究所 EY021200（MMJ）、格尔温奖学金（VMM-T）、格尔温博士前奖学金（ZKG）、美国国防部陆军医学研究与物资司令部（VMM-T）以及防盲研究基金会（Research to Prevent Blindness）的无限制资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗小鼠 CD15 PEBioLegend125606克隆 MC-480
抗小鼠 CD48 PE-Cy7BioLegend103424克隆 HM48-1
抗小鼠 CD57Sigma AldrichC6680-100TST克隆 VC1.1
抗小鼠 CD90.2 AF700BioLegend105320克隆 30-H12
Brilliant Violet 421 山羊抗小鼠 IgGBioLegend405317克隆 Poly4053
纯化抗小鼠 CD16/32BioLegend101302FcgRII/III 阻断剂，克隆 93
Zombie Aqua BioLegend423102活细胞/死细胞区分
胎牛血清HycloneSH30071.03美国来源
AbC 总抗体补偿微珠试剂盒Thermo Fisher ScientificA10497多物种 Ig
Neurobasal 培养基Thermo Fisher Scientific21103049培养前向培养基中添加血清
磷酸盐缓冲盐水 (PBS)Thermo Fisher Scientific10010049生理盐水溶液
解剖显微镜OlympusSZ-PT 型号体视显微镜
Sorvall 离心机Thermo ScientificST 16R所有离心操作均 在室温下进行
底板 – 解剖盘Fisher ScientificSB15233FIM也可使用石蜡板
镊子Aesculap5002-74 ½ 英寸
直头虹膜剪Aesculap13605 ½ 英寸
Falcon 15 mL 圆锥形离心管Fisher Scientific352097聚丙烯管
Falcon 50 mL 圆锥形离心管Fisher Scientific352098聚丙烯管
BD FACS 管Fisher Scientific352003聚丙烯管
40 mm 培养皿MidSciTP93040经组织培养处理
70 μm 尼龙滤网MidSci70ICS无菌
40 μm 尼龙滤网MidSci40ICS无菌
 BD 10 mL 注射器Fisher Scientific301604无针一次性注射器
研磨杵MidSciPEST无菌
Wheaton 小瓶Fisher Scientific986734无衬垫
BD 30 G 针头Fisher Scientific3051281 英寸
Hausser Scientific Bright-Line 玻璃计数板Fisher Scientific0267151B血细胞计数板
Gibco 台盼蓝 0.4% 溶液Fisher Scientific15250061细胞活力染料
Eppendorf 管Fisher Scientific05-402-251.5 mL
EVOS Floid 细胞成像系统Thermo Fisher Scientific447113使用 20X 物镜进行荧光成像
100% 乙醇Fisher Scientific04-355-452用于配制 70% 乙醇
Pipet-Lite LTS 移液器 L-1000XLS+Rainin17014282LTS 移液器
Pipet-Lite LTS 移液器 L-200XLS+Rainin17014391LTS 移液器
Pipet-Lite LTS 移液器 L-20XLS+Rainin17014392LTS 移液器
Rack LTS 1000 mL – GPS-L1000SRainin17005088蓝色架，无菌吸头
Rack LTS 250 mL – GPS-L250SRainin17005092绿色架，无菌吸头
Rack LTS 20 mL – GPS-L10SRainin17005090红色架，无菌吸头
FACSAria II 细胞分选仪BD BiosciencesN/A定制订单
LSR II 流式细胞仪BD BiosciencesN/A定制订单
Abca8aThermo Fisher ScientificMm00462440_m1Müller 细胞
Aldh1alThermo Fisher ScientificMm00657317_m1Müller 细胞
Aqp4Thermo Fisher ScientificMm00802131_m1星形胶质细胞
Calb2Thermo Fisher ScientificMm00801461_m1无长突细胞、水平细胞
Cd68Thermo Fisher ScientificMm03047340_m1视网膜色素上皮细胞
Gad2Thermo Fisher ScientificMm00484623_m1无长突细胞
HprtThermo Fisher ScientificMm01545399_m1管家基因
Lhx1Thermo Fisher ScientificMm01297482_m1水平细胞
Lim2Thermo Fisher ScientificMm00624623_m1水平细胞
NrlThermo Fisher ScientificMm00476550_m1光感受器细胞
Ntrk1Thermo Fisher ScientificMm01219406_m1水平细胞
Pcp4Thermo Fisher ScientificMm00500973_m1双极细胞、无长突细胞
Pou4f1Thermo Fisher ScientificMm02343791_m1视网膜神经节细胞
Prdx6Thermo Fisher ScientificMm00725435_s1星形胶质细胞
PrkcaThermo Fisher ScientificMm00440858_m1双极细胞
Prox1Thermo Fisher ScientificMm00435969_m1水平细胞
PvalbThermo Fisher ScientificMm00443100_m1无长突细胞
RbpmsThermo Fisher ScientificMm02343791_m1视网膜神经节细胞
Rom1Thermo Fisher ScientificMm00436364_g1光感受器细胞
Rpe65Thermo Fisher ScientificMm00504133_m1视网膜色素上皮细胞
Slc1a3Thermo Fisher ScientificMm00600697_m1星形胶质细胞
Slc6a9Thermo Fisher ScientificMm00433662_m1无长突细胞
SncgThermo Fisher ScientificMm00488345_m1视网膜神经节细胞
Tubb3Thermo Fisher ScientificMm00727586_s1视网膜神经节细胞
VimThermo Fisher ScientificMm01333430_m1Müller 细胞
Taqman 通用预混液Thermo Fisher Scientific4440047qPCR 试剂
miRNeasy Mini 试剂盒Qiagen217004RNA 提取
SuperScript VILO cDNA 合成试剂盒Thermo Fisher Scientific11754250cDNA 合成
Taqman 预扩增预混液Thermo Fisher Scientific4391128预扩增步骤
BD Cytofix/CytopermBD Biosciences554714固定/通透缓冲液
BD Perm/WashBD Biosciences554723通透溶液
RBPMSSanta Cruz Biotechnologysc-86815细胞内抗体
SNCGGene TexGTX110483细胞内抗体
BRN3ASanta Cruz Biotechnologysc-8429细胞内抗体
TUJ1BioLegend801202细胞内抗体

参考文献

  1. Flammer, J., Orgul, S. Optic nerve blood-flow abnormalities in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 17 (2), 267-289 (1998).
  2. Bathija, R. Optic nerve blood flow in glaucoma. Clin Exp Optom. 83 (3), 180-184 (2000).
  3. Osborne, N. N., Melena, J., Chidlow, G., Wood, J. P. A hypothesis to explain ganglion cell death caused by vascular insults at the optic nerve head: possible implication for the treatment of glaucoma. Br J Ophthalmol. 85 (10), 1252-1259 (2001).
  4. Morgan, J. E. Circulation and axonal transport in the optic nerve. Eye (Lond). 18 (11), 1089-1095 (2004).
  5. Tian, N., Hwang, T. N., Copenhagen, D. R. Analysis of excitatory and inhibitory spontaneous synaptic activity in mouse retinal ganglion cells. J Neurophysiol. 80 (3), 1327-1340 (1998).
  6. Schmidt, K. G., Bergert, H., Funk, R. H. Neurodegenerative diseases of the retina and potential for protection and recovery. Curr Neuropharmacol. 6 (2), 164-178 (2008).
  7. Dreher, B., Sefton, A. J., Ni, S. Y., Nisbett, G. The morphology, number, distribution and central projections of Class I retinal ganglion cells in albino and hooded rats. Brain Behav Evol. 26 (1), 10-48 (1985).
  8. Williams, R. W., Strom, R. C., Rice, D. S., Goldowitz, D. Genetic and environmental control of variation in retinal ganglion cell number in mice. J Neurosci. 16 (22), 7193-7205 (1996).
  9. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).
  10. Surgucheva, I., Weisman, A. D., Goldberg, J. L., Shnyra, A., Surguchov, A. Gamma-synuclein as a marker of retinal ganglion cells. Mol Vis. 14, 1540-1548 (2008).
  11. Nadal-Nicolas, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3860-3868 (2009).
  12. Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: a new marker for retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (2), 1052-1058 (2010).
  13. Van Bergen, N. J., et al. Recharacterization of the RGC-5 retinal ganglion cell line. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (9), 4267-4272 (2009).
  14. Wood, J. P., Chidlow, G., Tran, T., Crowston, J. G., Casson, R. J. A comparison of differentiation protocols for RGC-5 cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (7), 3774-3783 (2010).
  15. Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1 (9), 791-803 (1998).
  16. Hong, S., Iizuka, Y., Kim, C. Y., Seong, G. J. Isolation of primary mouse retinal ganglion cells using immunopanning-magnetic separation. Mol Vis. 18, 2922-2930 (2012).
  17. Julius, R. S. The sensitivity of exponentials and other curves to their parameters. Comput Biomed Res. 5 (5), 473-478 (1972).
  18. Reif, A. E., Allen, J. M. The Akr Thymic Antigen and Its Distribution in Leukemias and Nervous Tissues. J Exp Med. 120, 413-433 (1964).
  19. Watanabe, M., Noguchi, T., Tsukada, Y. Regional, cellular, and subcellular distribution of Thy-1 antigen in rat nervous tissues. Neurochem Res. 6 (5), 507-519 (1981).
  20. Haeryfar, S. M., Hoskin, D. W. Thy-1: more than a mouse pan-T cell marker. J Immunol. 173 (6), 3581-3588 (2004).
  21. Sahagun, G., Moore, S. A., Fabry, Z., Schelper, R. L., Hart, M. N. Purification of murine endothelial cell cultures by flow cytometry using fluorescein-labeled griffonia simplicifolia agglutinin. Am J Pathol. 134 (6), 1227-1232 (1989).
  22. Shoge, K., et al. Rat retinal ganglion cells culture enriched with the magnetic cell sorter. Neurosci Lett. 259 (2), 111-114 (1999).
  23. Chintalapudi, S. R., et al. Isolation and Molecular Profiling of Primary Mouse Retinal Ganglion Cells: Comparison of Phenotypes from Healthy and Glaucomatous Retinas. Front Aging Neurosci. 8, 93(2016).
  24. Nagdeve, N. G., Yaddanapudi, S., Pandav, S. S. The effect of different doses of ketamine on intraocular pressure in anesthetized children. J Pediatr Ophthalmol Strabismus. 43 (4), 219-223 (2006).
  25. Ding, C., Wang, P., Tian, N. Effect of general anesthetics on IOP in elevated IOP mouse model. Exp Eye Res. 92 (6), 512-520 (2011).
  26. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  27. Aerts, J., Nys, J., Arckens, L. A highly reproducible and straightforward method to perform in vivo ocular enucleation in the mouse after eye opening. J Vis Exp. (92), e51936(2014).
  28. Li, X., et al. Loss of AP-2delta reduces retinal ganglion cell numbers and axonal projections to the superior colliculus. Mol Brain. 9 (1), 62(2016).
  29. Moshiri, A., et al. Near complete loss of retinal ganglion cells in the math5/brn3b double knockout elicits severe reductions of other cell types during retinal development. Dev Biol. 316 (2), 214-227 (2008).
  30. Danias, J., et al. Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (12), 5151-5162 (2003).
  31. Jakobs, T. C., Ben, Y., Masland, R. H. CD15 immunoreactive amacrine cells in the mouse retina. J Comp Neurol. 465 (3), 361-371 (2003).
  32. Uusitalo, M., Schlotzer-Schrehardt, U., Kivela, T. Ultrastructural localization of the HNK-1 carbohydrate epitope to glial and neuronal cells of the human retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (3), 961-964 (2003).
  33. Jackson, C. J., Garbett, P. K., Nissen, B., Schrieber, L. Binding of human endothelium to Ulex europaeus I-coated Dynabeads: application to the isolation of microvascular endothelium. J Cell Sci. 96 ( Pt 2), 257-262 (1990).
  34. Pennartz, S., Perraut, M., Pfrieger, F. Purification of retinal ganglion cells from postnatal rats by magnetic cell sorting. MACSmore. 12 (2), 16-18 (2010).
  35. Nadal-Nicolas, F. M., et al. Displaced retinal ganglion cells in albino and pigmented rats. Front Neuroanat. 8, 99(2014).
  36. Nadal-Nicolas, F. M., Salinas-Navarro, M., Vidal-Sanz, M., Agudo-Barriuso, M. Two methods to trace retinal ganglion cells with fluorogold: from the intact optic nerve or by stereotactic injection into the optic tract. Exp Eye Res. 131, 12-19 (2015).
  37. Barnstable, C. J., Drager, U. C. Thy-1 antigen: a ganglion cell specific marker in rodent retina. Neuroscience. 11 (4), 847-855 (1984).
  38. Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus. J Vis Exp. (16), (2008).

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细胞分离小鼠原代细胞细胞分选免疫标记CD90.2阳性CD48阴性补偿对照活细胞群体
通过流式细胞术分离原代小鼠视网膜神经节细胞（RGCs）
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