使用Sholl分析法对大鼠乳腺全组织切片中的分支密度进行定量

摘要

啮齿类动物乳腺发育通常通过描述性评估或测量基本物理特征来进行评价。分支密度是乳腺发育的一个指标，但难以进行客观量化。本方案描述了一种可靠的方法，用于定量评估乳腺腺体的分支特征。

摘要

越来越多的研究将啮齿类动物的乳腺作为评估化学物质暴露发育毒性的终点指标。这些暴露对乳腺发育的影响通常通过基本的尺寸测量或形态学特征评分来进行评价。然而，解释发育变化的方法多种多样，可能导致不同实验室之间的结果难以一致。为了能够对不同研究之间的数据进行合理比较，亟需一种通用的评估方法。本研究描述了应用Sholl分析法来定量乳腺分支特征的方法。Sholl分析法最初是为定量神经元树突分布模式而开发的。通过使用ImageJ这一开源图像分析软件，以及为此分析专门开发的插件，测定了青春期前雌性大鼠乳腺的分支密度和乳腺结构的复杂性。本文所述方法将有助于将Sholl分析法作为定量乳腺发育重要特征的有效工具。

引言

乳腺分支是评估腺体发育的常用指标，但其客观量化较为困难。1953年，Sholl¹描述了一种用于测量猫视觉和运动皮层中神经元树突分枝的方法，Ferreira et al²随后开发了该技术的插件。由于神经元和乳腺均具有类似的树状结构，该插件被用于量化青春期前后大鼠乳腺上皮分支密度的二维图像。选择青春期前后阶段进行分析，是因为断奶期是学术实验室和试验指南研究中常被评估的生命阶段。Sholl分析法是FIJI软件中的一个插件，FIJI是开源图像处理软件ImageJ的扩展版本，包含多种附加插件。该插件围绕一个预定义中心（通常为神经元胞体或乳腺主导管起始点）生成一系列同心圆环，并延伸至目标结构最远端（即包围半径）。然后统计每个圆环上的交点数量（N）。该插件还提供Sholl回归系数（k），用于衡量上皮分支衰减速率。

使用 ImageJ 对乳腺全组织切片生成骨架化图像，并测量乳腺上皮面积（MEA）。利用 Sholl 分析插件对图像进行分析，得到参数 N 和 k 等值（其中部分值在本方法中未使用）。乳腺上皮分支密度通过计算 N/MEA 获得。分支在腺体上皮外周区域的延伸程度反映分支复杂性，是远端上皮均匀生长的指标。由于参数 k 可衡量上皮分支在远端区域的减少程度，因此它是评估分支复杂性的有效参数，也是乳腺发育的可靠指标。

....

方案

本研究中所有动物使用和操作程序均经国家环境卫生科学研究所（NIEHS）实验动物护理和使用委员会批准，并在经国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）认证的设施中进行。

1. 切取乳腺组织

1. 使用耐二甲苯的方法预先标记所有载玻片（铅笔标记效果最佳），并在最后覆盖封片液以保护标签。
2. 采用经机构动物护理和使用委员会批准的方法对动物实施安乐死。
3. 安乐死后，将动物仰卧于解剖板上（图1）拉伸并固定四肢，使后肢呈倒V形（使用固定针或细针效果良好）。
4. 用70%乙醇充分喷洒腹部，以防止毛发污染乳腺样本。
5. 用镊子提起腹中线处的皮肤，用解剖剪做一个小切口，注意不要刺破腹膜。
   1. 从切口处开始，沿皮肤向颈部方向切开，然后向远端延伸至前肢；继续向下切至腹股沟区域，再向远端延伸至同侧后肢的第一关节处。该切口通常可分离第5和第6对乳腺。注意避免切破腹膜。
   2. 用镊子夹住附着的乳腺脂肪垫并向后拉开皮肤，使用解剖剪的钝端轻轻将其与腹膜分离。尽可能向背侧分离，以充分暴露第4对乳腺^th 和 5^th 皮肤腹面的腹股沟乳腺；将皮肤固定在解剖板上（图2).
   3. 轻轻抓....

结果

测量所得的封闭半径、MEA、N 的数值， k，本方案中分析的乳腺的分支密度计算结果如报告所示 表1. Sholl 分析生成每个半径处交点数量的线性图和半对数图图9）以及，若选择，则显示交集的热图（图10）。发育较不完善的腺体在同一MEA内的交点较少，因此分支密度较低。发育良好的腺体将在整个腺上皮中持续均匀地分支，尤其是在远端区域。这些区域分支延伸的程度可称为分支复杂性，复杂性的降低可用衰减速率（即Sholl回归系数）来表示。 k）。衰减速率反映了远端上皮分支的变化，通过绘制交点数量随包围半径变化曲线的斜率来测量即， 上皮细胞的纵向生长）。因此，Sholl 回归系数通过计算 log(N/S) 对径向距离 (r) 作图所得直线的斜率来确定，其中 log(N/S) = -k r + m，其中 N 为每个半径为 r、面积为 S（πr²）.......

讨论

从出生到青春期，乳腺的生长呈异速生长。青春期后，乳腺通过广泛的导管分支和延伸而发育，这一过程持续至乳腺上皮占据整个脂肪垫。分支特征是乳腺发育的重要方面，能够客观地量化这些特征对于评估正常的乳腺发育以及识别生命早期暴露于乳腺毒性物质后出现的异常发育具有重要意义。

评估乳腺发育的常用方法包括评分形态学特征、量化基本尺寸测量值以及计数乳腺结构。然而，由于啮齿类动物乳腺的大小和形状存在较大变异，这些方法的敏感性通常较低，且对于经验不足的评估者而言，发育阶段的判读可能较为困难。此外，在未充分设盲的研究中还可能存在偏倚风险。Sholl 分析法提供了一种高效方案，可准确量化乳腺上皮分支密度和分支复杂性——这些是乳腺发育的明确形态学特征，且易于在不同研究和实验室之间进行比较。

本方案的多个步骤中存在关键环节。第一个也是最重要的环节与乳腺全组织切片的制备状态相关。该方法的准确性依赖于完整采集的乳腺组织，要求组织无破损地进行铺片，固定和染色得当，且无腺体氧化或封片介质明显变色的现象。如果腺体发生撕裂或折叠，则无法准确测量分支密度。若导管末端缺失，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
解剖板	NA	NA	大小约为 10"x12" 的泡沫板即可使用。
解剖T型针	Daigger	EF7419A
含乙醇的喷雾瓶	NA	NA	70% 乙醇适用。
弯头解剖剪	Fine Science Tools	14569-09
直头解剖剪	Fine Science Tools	14568-09
弯头镊子	Fine Science Tools	11003-12
Superfrost Plus 24 x 75 x 1 mm 显微镜载玻片	ThermoFisher Scientific	4951PLUS-001	Thermo Scientific Superfrost Plus & Colorfrost Plus 载玻片可在免疫组化和解剖病理学应用中永久固定组织切片，无需使用昂贵的涂层。该处理方式可减少染色过程中的组织脱落，并节省数小时的载玻片制备时间。此类载玻片通过静电吸引冷冻组织切片和细胞学样本，其化学性质类似于硅烷，但经过优化以提升应用性能。 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4.
Fisherfinest Premium 盖玻片 24 x 60 x 1 mm	Fisher scientific	12-548-5P
Bemis Parafilm M 实验室包装膜	Fisher scientific	13-374-12
氯仿	Sigma-Aldrich	C2432
冰醋酸	Sigma-Aldrich	A9967
无水乙醇，≥99.8% (GC)	Sigma-Aldrich	24102
二甲苯	Sigma-Aldrich	214736
明矾卡红	Sigma-Aldrich	C1022
硫酸铝钾	Sigma-Aldrich	A6435
Permount 封片介质	Fisher Scientific	SP15
体视显微镜	Leica	Z16 APO	本实验室使用的图像采集硬件和软件。由于存在多种不同选择，不同实验室的方法和应用可能有所差异。
数码相机	Leica	DFC295
相机软件	Leica	Leica Application Suite v3.1
ImageJ 软件	开源	http://imagej.net/Welcome
Sholl 分析	开源	http://imagej.net/Sholl_Analysis