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使用Sholl分析法对大鼠乳腺全组织切片中的分支密度进行定量

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DOI：

10.3791/55789

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2017年7月12日

 , 
1National Toxicology Program Laboratory, Division of the National Toxicology Program, National Institute of Environmental Health Sciences

本文内容

摘要

啮齿类动物乳腺发育通常通过描述性评估或测量基本物理特征来进行评价。分支密度是乳腺发育的一个指标，但难以进行客观量化。本方案描述了一种可靠的方法，用于定量评估乳腺腺体的分支特征。

摘要

越来越多的研究将啮齿类动物的乳腺作为评估化学物质暴露发育毒性的终点指标。这些暴露对乳腺发育的影响通常通过基本的尺寸测量或形态学特征评分来进行评价。然而，解释发育变化的方法多种多样，可能导致不同实验室之间的结果难以一致。为了能够对不同研究之间的数据进行合理比较，亟需一种通用的评估方法。本研究描述了应用Sholl分析法来定量乳腺分支特征的方法。Sholl分析法最初是为定量神经元树突分布模式而开发的。通过使用ImageJ这一开源图像分析软件，以及为此分析专门开发的插件，测定了青春期前雌性大鼠乳腺的分支密度和乳腺结构的复杂性。本文所述方法将有助于将Sholl分析法作为定量乳腺发育重要特征的有效工具。

引言

乳腺分支是评估腺体发育的常用指标，但其客观量化较为困难。1953年，Sholl1描述了一种用于测量猫视觉和运动皮层中神经元树突分枝的方法，Ferreira et al2随后开发了该技术的插件。由于神经元和乳腺均具有类似的树状结构，该插件被用于量化青春期前后大鼠乳腺上皮分支密度的二维图像。选择青春期前后阶段进行分析，是因为断奶期是学术实验室和试验指南研究中常被评估的生命阶段。Sholl分析法是FIJI软件中的一个插件，FIJI是开源图像处理软件ImageJ的扩展版本，包含多种附加插件。该插件围绕一个预定义中心（通常为神经元胞体或乳腺主导管起始点）生成一系列同心圆环，并延伸至目标结构最远端（即包围半径）。然后统计每个圆环上的交点数量（N）。该插件还提供Sholl回归系数（k），用于衡量上皮分支衰减速率。

使用 ImageJ 对乳腺全组织切片生成骨架化图像，并测量乳腺上皮面积（MEA）。利用 Sholl 分析插件对图像进行分析，得到参数 N 和 k 等值（其中部分值在本方法中未使用）。乳腺上皮分支密度通过计算 N/MEA 获得。分支在腺体上皮外周区域的延伸程度反映分支复杂性，是远端上皮均匀生长的指标。由于参数 k 可衡量上皮分支在远端区域的减少程度，因此它是评估分支复杂性的有效参数，也是乳腺发育的可靠指标。

本方案描述了一种借助计算机辅助的方法，用于生成大鼠乳腺全组织制片的骨架化图像，并对青春期前后雄性和雌性大鼠乳腺的分支特征进行定量评估。该方法相对快速，且无需使用专业的显微镜设备。该方法的开发与验证详见 Stanko et al. (2015)3。本报告还描述了大鼠乳腺全组织制片的制备过程。类似的乳腺全组织制片操作流程已在 de Assis et al. (2010)4 和 Plante et al. (2011)5 中有所描述。

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方案

本研究中所有动物使用和操作程序均经国家环境卫生科学研究所（NIEHS）实验动物护理和使用委员会批准，并在经国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）认证的设施中进行。

1. 切取乳腺组织

  1. 使用耐二甲苯的方法预先标记所有载玻片（铅笔标记效果最佳），并在最后覆盖封片液以保护标签。
  2. 采用经机构动物护理和使用委员会批准的方法对动物实施安乐死。
  3. 安乐死后，将动物仰卧于解剖板上（图1）拉伸并固定四肢，使后肢呈倒V形（使用固定针或细针效果良好）。
  4. 用70%乙醇充分喷洒腹部，以防止毛发污染乳腺样本。
  5. 用镊子提起腹中线处的皮肤，用解剖剪做一个小切口，注意不要刺破腹膜。
    1. 从切口处开始，沿皮肤向颈部方向切开，然后向远端延伸至前肢；继续向下切至腹股沟区域，再向远端延伸至同侧后肢的第一关节处。该切口通常可分离第5和第6对乳腺。注意避免切破腹膜。
    2. 用镊子夹住附着的乳腺脂肪垫并向后拉开皮肤，使用解剖剪的钝端轻轻将其与腹膜分离。尽可能向背侧分离，以充分暴露第4对乳腺th 和 5th 皮肤腹面的腹股沟乳腺；将皮肤固定在解剖板上（图2).
    3. 轻轻抓住5号乳腺组织th 用弯镊的圆头一侧轻轻压住腺体，并缓慢地将腺体从皮肤上剪下，注意不要损伤腺体或皮肤。
    4. 继续修剪，向背侧移动，直至第4th 和 5th 腺体已完全从皮肤上剥离。确保乳头区域随腺体其余部分一同移除，因为该区域将作为Sholl分析的起始点。在第4对腺体附着处，将乳腺组织从身体上剪下。
  6. 将腺体从动物体内取出后，将其均匀铺展在一块静电充电的25 mm × 75 mm × 1 mm显微镜载玻片上，使原先紧贴皮肤的一面朝下。
    注意：对于来自较年长或泌乳期动物的腺体，可能需要使用51 x 75 x 1 mm的载玻片。
  7. 佩戴手套后，轻轻挤出任何气泡。用塑料石蜡膜覆盖腺体，并在其上放置另一张载玻片，轻压腺体使其贴附于载玻片上。
    注意：一个装有水的50 mL锥形管可作为合适的重物。腺体贴附在载玻片所需的时间取决于腺体的厚度。较薄的出生后第4天（PND 4）腺体至少应压迫30分钟，而较厚的成年腺体可能需要压迫2–5小时。

2. 准备乳腺全组织制片

  1. 至少提前 24 小时配制卡红明矾溶液，因为该溶液需要煮沸并冷藏。
    1. 将 1 g 卡红明矾和 2.5 g 硫酸铝钾（AlK(SO4)2·12H2O）溶解于 500 mL 蒸馏水中，在 1-L 锥形瓶中煮沸 20 分钟。用蒸馏水补足最终体积至 500 mL。
    2. 在减压条件下通过滤纸过滤溶液，并冷藏保存。
      注意：卡红明矾溶液可重复使用，但当颜色开始褪去时应予以弃置。
  2. 固定前，小心地将腺体上的石蜡膜剥离，注意不要将腺体从载玻片上拉下。将载玻片放入玻璃染色缸中，浸入固定液（乙醇、氯仿和冰醋酸按 6:3:1 比例混合）中固定 12–48 小时，具体时间取决于腺体厚度。
  3. 倒去固定液，将腺体在 70% 乙醇中浸泡 15 分钟。通过倒出 1/3 乙醇溶液并补充蒸馏水的方式逐步水化腺体，每次浸泡 5 分钟，重复此过程三次。
  4. 最后一次冲洗后，倒去所有乙醇/水溶液，更换为 100% 蒸馏水，将腺体浸泡 5 分钟。
  5. 倒去蒸馏水，将腺体浸入卡红明矾溶液中染色 12–24 小时，具体时间取决于腺体厚度。
    注意：腺体不会过度染色，但多批次染色时间应保持一致，以确保染色强度相同。
  6. 倒去卡红明矾溶液，用 100% 蒸馏水冲洗腺体 30 秒。随后逐步脱水：依次在 70% 乙醇中浸泡 15 分钟、95% 乙醇中浸泡 15 分钟、100% 乙醇中浸泡 20 分钟。
  7. 通过在二甲苯中浸泡 12–72 小时去除腺体中的脂肪，具体时间取决于腺体厚度。
    注意：腺体应变为半透明（澄清）。若仍有不透明（白色）区域，需继续在二甲苯中浸泡直至透明。若为泌乳期或特别厚的腺体，可能需要更换一次二甲苯才能完全清除脂肪。
  8. 使用基于二甲苯的封片介质进行封片，用移液器滴加足量介质以刚好覆盖腺体。加盖盖玻片，确保无气泡产生。
  9. 让载玻片自然干燥。随着封片介质干燥，其在盖玻片下会收缩，可能需要补充少量封片介质。当不再需要添加介质后，让载玻片完全干燥，此过程可能需要 2–3 周。
  10. 载玻片完全干燥后，可用棉签蘸取少量二甲苯去除残留的封片介质。注意避免使用过多二甲苯，否则可能溶解封片介质并导致盖玻片松动。若发生此情况并出现气泡，应在二甲苯中取下盖玻片并重新封片。

3. 准备用于分析的全组织染色图像

  1. 使用体视显微镜或解剖显微镜配合数码相机及相应软件拍摄乳腺全组织制片图像（图3）。
    注意：虽然可以选择任何能够完整捕获整个腺体上皮的放大倍数，但必须确保所有相互比较的全组织制片图像均在相同放大倍数下拍摄。
  2. 下载 ImageJ 软件（或 FIJI 软件）6。
  3. 在 ImageJ 中点击“文件” → “打开”，载入乳腺全组织制片图像。选择“自由手工具”，沿腺体上皮边缘描迹，然后选择“编辑” → “清除外部”。
    1. 使用自由手工具围绕淋巴结描迹，然后选择“编辑” → “剪切”，以去除淋巴结。
  4. 选择“图像” → “颜色” → “拆分通道”，将颜色通道分离。选择对比度最佳的通道，通常为蓝色通道。
    注意：RGB 图像由红、绿、蓝三个分量组成的图像堆栈构成。此操作会将这些分量分离为三个 8 位灰度图像。
  5. 选择“处理” → “减去背景”，设定所需参数后点击“预览”以查看变化效果。
    注意：“减去背景”可去除平滑连续的背景。此外，也可使用“处理” → “滤波” → “反卷积锐化”来增强对比度。
  6. 选择以下两种方法之一自动去除噪声：去斑点或去除异常值。
    注意：ImageJ 提供第三种自动去噪方法——去除 NaN 值。但由于该命令仅适用于 32 位图像，而当前方法使用 8 位图像，因此不适用。
    1. 选择“处理” → “噪声” → “去斑点”，使用去斑点命令去除噪声。
      注意：该操作等同于添加中值滤波器，即将每个像素替换为其 3 × 3 邻域内的中值。
    2. 选择“处理” → “噪声” → “去除异常值”，使用去除异常值命令去除噪声。
      注意：若某像素与其周围像素中值的偏差超过设定阈值，则该像素将被其邻近像素的中值替代。
  7. 手动去除任何残留的噪声（图4）。
    1. 打开原始图像的副本，并以此作为判断噪声与否的参考。点击工具栏最右侧的双红箭头按钮，选择绘图工具，此时绘图工具按钮将显示在工具栏中。
    2. 点击橡皮擦工具。通过右键点击橡皮擦工具按钮调整橡皮擦直径。按住鼠标左键擦除噪声。
      注意：仅可撤销一次擦除操作。一旦释放鼠标左键并再次点击，先前的擦除操作将无法撤销。
  8. 选择“图像” → “调整” → “阈值”，调节阈值。移动滑块调整最小值（上方滑块）和最大值（下方滑块），直至获得对腺体结构的充分呈现。
    注意：设定阈值可将灰度图像分割为感兴趣特征与背景两部分。
    1. 点击“应用”。如有必要，可按照步骤 3.6.1 和 3.6.2 进一步去除额外噪声。
  9. 重建因阈值分割和去噪处理而丢失的腺体上皮部分（图5）。
    1. 图像重建应谨慎进行，且仅限最小范围，以保持原始图像的完整性。参考原始图像判断哪些区域属于或不属于上皮组织。
    2. 点击喷枪工具（位于绘图工具栏中）。通过右键点击喷枪工具按钮调整喷枪直径和速率。通过点击或按住鼠标左键，仔细填补腺体缺失的部分。
  10. 生成用于进行 Sholl 分析的腺体骨架化图像。确保阈值化图像为二值图像，选择“处理” → “二值” → “转为二值”。
    1. 若图像为黑背景上的白色结构，选择“处理” → “二值” → “选项”，取消勾选“黑背景”。然后选择“处理” → “二值” → “骨架化”。
      注意：此操作会反复从二值图像边缘移除像素，直至结构缩减为单像素宽度的形态。
    2. 选择“处理” → “二值” → “膨胀”，对图像进行一次膨胀处理。
      注意：此操作通过向二值图像边缘添加像素，填充由阈值化和骨架化产生的间隙。
  11. 选择“文件” → “另存为”，保存图像。选择图像格式（通常为 jpeg），输入文件名，点击“确定”。
  12. 通过将骨架化图像叠加至原始图像，检查骨架化图像的准确性（图6）。
    1. 同时打开原始图像和骨架化图像，选择“图像” → “叠加” → “添加图像”。在“添加图像”对话框中，从“要添加的图像”下拉菜单中选择骨架图像，并将透明度设为 30%。
    2. 选择“文件” → “另存为”，保存骨架图像叠加在原始图像上的结果图像。选择图像格式，输入文件名，点击“确定”。

4. 进行Sholl分析

  1. 打开骨架图像，并通过选择“Process” → “Binary” → “Make Binary”将其转换为二值图像。
    1. 在设置放大倍数标尺之前，使用显微测微尺测量图像采集时放大倍数下的像素/毫米数。
    2. 通过选择“Analyze” → “Set Scale”设置测得的放大倍数标尺。输入像素/毫米数值。“Known Distance”和“Pixel Aspect Ratio”均设为1。在“Unit of Length”中输入“mm”，并勾选“Global”（为每幅图像保持相同标尺）。
  2. 通过从主导管起始处（分析中心）画线至腺上皮最远端点来确定Sholl分析的终止半径（包围半径）（图7）。
    1. 使用工具栏中的直线绘制工具，在感兴趣点之间画一条线。按下“M”键进行测量，此时将打开结果窗口。
      注： “Length”列中的数值即为该直线的毫米长度。此值将在设置Sholl参数时自动作为终止半径输入。Sholl插件将使用该直线的起点作为同心圆环的中心。
  3. 运行Sholl分析。
    1. 通过选择“Plugins” → “Advanced Sholl Analysis”运行分析，参数设置窗口将出现。
    2. 在“I. Definition of Shells”中将起始半径设为0.00 mm；第4.2步中测得的线段长度将自动填入“Ending Radius”。
    3. 将“Radius Step Size”设为0.1 mm。
      注： 半径步长决定了圆环的数量（即迭代次数）；较小的步长会增加圆环数量，而较大的步长会减少圆环数量。半径不能设置过小，尽管过小的半径会导致不必要的大量圆环；但半径可被设得过大，这将导致圆环数量过少，从而低估真实的交点数量。有关步长确定的更多信息，请参见Stanko et al. (2015)。
    4. 在“II. Multiple Samples per Radius”中，将“# Samples”设为1，将“Integration”设为“Mean”。
    5. 在“III. Descriptors and Curve Fitting”中，将“Enclosing radius cutoff”设为1，并勾选“# Primary branches”下的“infer from starting radius”。
      注： 可根据需要勾选“Fit profile and compute descriptors”和“Show fitting details”。
    6. 在“IV. Sholl Methods”中，勾选“Linear”，选择“Profiles Without Normalization”下的“Best fitting degree”，并勾选“Most informative”；在“Area for Normalized Profiles”中进行选择。
    7. 在“V. Output options”中勾选“Create Intersections Mask”，以生成交点的热图（可选）。
    8. 点击“Cf. Segmentation”生成带圆环的图像预览窗口，以确认分析区域。
  4. 点击“OK”开始运行分析。

5. 测量MEA

  1. 通过沿上皮树外围追踪最短距离来测量乳腺上皮面积（MEA）（图8）。
    1. 在 ImageJ 中打开腺体的骨架图像后，点击多边形工具。在上皮树边缘上的某一点单击以开始绘制多边形，沿腺体边缘移动，并单击以添加线段。
    2. 当整个上皮区域被完全环绕后，双击以闭合多边形。按下“M”键打开结果窗口；“Area”列中的数值即为 MEA。
  2. 当腺体上皮延伸超过淋巴结时，在计算分支密度时需从 MEA 中减去淋巴结面积（LNA）。
    1. 以与追踪上皮树相同的方法追踪淋巴结并按下“M”键测量 LNA。
      注意：在此类情况下，必须从 MEA 中减去 LNA，因为淋巴结会阻碍分析程序对 LNA 内交叉点的计数。当上皮未到达淋巴结时，LNA 为零。

6. 数据报告

  1. 报告封闭半径、MEA、N、k 和分支密度的数值。
    注意：封闭半径在步骤 4.2 中确定，MEA 在步骤 5.1 中确定。
    1. 运行分析以生成 Sholl 结果窗口。
      注意：报告的 N 值为“sum inters”（交点总数）。报告的 k 值为 Sholl 回归系数（半对数形式）的值。Sholl 分析将返回腺体上皮任何测量区域的 k 值。为了在整个上皮范围内获得准确的 k 值，必须包含导管末端。
    2. 通过使用输出的 N 值计算分支密度（本方法的基本终点），对乳腺组织的 Sholl 分析进行调整。使用公式 N/(MEA-LNA) 计算分支密度，并以 N/mm2 报告该值。

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结果

测量所得的封闭半径、MEA、N 的数值， k，本方案中分析的乳腺的分支密度计算结果如报告所示 表1. Sholl 分析生成每个半径处交点数量的线性图和半对数图图9）以及，若选择，则显示交集的热图（图10）。发育较不完善的腺体在同一MEA内的交点较少，因此分支密度较低。发育良好的腺体将在整个腺上皮中持续均匀地分支，尤其是在远端区域。这些区域分支延伸的程度可称为分支复杂性，复杂性的降低可用衰减速率（即Sholl回归系数）来表示。 k）。衰减速率反映了远端上皮分支的变化，通过绘制交点数量随包围半径变化曲线的斜率来测量即， 上皮细胞的纵向生长）。因此，Sholl 回归系数通过计算 log(N/S) 对径向距离 (r) 作图所得直线的斜率来确定，其中 log(N/S) = -k r + m，其中 N 为每个半径为 r、面积为 S（πr2）...

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讨论

从出生到青春期，乳腺的生长呈异速生长。青春期后，乳腺通过广泛的导管分支和延伸而发育，这一过程持续至乳腺上皮占据整个脂肪垫。分支特征是乳腺发育的重要方面，能够客观地量化这些特征对于评估正常的乳腺发育以及识别生命早期暴露于乳腺毒性物质后出现的异常发育具有重要意义。

评估乳腺发育的常用方法包括评分形态学特征、量化基本尺寸测量值以及计数乳腺结构。然而，由于啮齿类动物乳腺的大小和形状存在较大变异，这些方法的敏感性通常较低，且对于经验不足的评估者而言，发育阶段的判读可能较为困难。此外，在未充分设盲的研究中还可能存在偏倚风险。Sholl 分析法提供了一种高效方案，可准确量化乳腺上皮分支密度和分支复杂性——这些是乳腺发育的明确形态学特征，且易于在不同研究和实验室之间进行比较。

本方案的多个步骤中存在关键环节。第一个也是最重要的环节与乳腺全组织切片的制备状态相关。该方法的准确性依赖于完整采集的乳腺组织，要求组织无破损地进行铺片，固定和染色得当，且无腺体氧化或封片介质明显变色的现象。如果腺体发生撕裂或折叠，则无法准确测量分支密度。若导管末端缺失，...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢 Michael Easterling 博士（美国北卡罗来纳州德罕的社会与科学研究系统公司）在本方法验证过程中提供的帮助，以及 Tiago Ferreira 博士（加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学）在 Sholl 分析工具使用过程中持续提供的协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
解剖板NANA大小约为 10"x12" 的泡沫板即可使用。
解剖T型针DaiggerEF7419A
含乙醇的喷雾瓶NANA70% 乙醇适用。
弯头解剖剪Fine Science Tools14569-09
直头解剖剪Fine Science Tools14568-09
弯头镊子Fine Science Tools11003-12
Superfrost Plus 24 x 75 x 1 mm 显微镜载玻片ThermoFisher Scientific4951PLUS-001Thermo Scientific Superfrost Plus & Colorfrost Plus 载玻片可在免疫组化和解剖病理学应用中永久固定组织切片，无需使用昂贵的涂层。该处理方式可减少染色过程中的组织脱落，并节省数小时的载玻片制备时间。此类载玻片通过静电吸引冷冻组织切片和细胞学样本，其化学性质类似于硅烷，但经过优化以提升应用性能。
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4. 
Fisherfinest Premium 盖玻片 24 x 60 x 1 mmFisher scientific12-548-5P
Bemis Parafilm M 实验室包装膜Fisher scientific13-374-12
氯仿Sigma-AldrichC2432
冰醋酸Sigma-AldrichA9967
无水乙醇，≥99.8% (GC) Sigma-Aldrich24102
二甲苯Sigma-Aldrich214736
明矾卡红 Sigma-AldrichC1022
硫酸铝钾 Sigma-AldrichA6435
Permount 封片介质Fisher ScientificSP15
体视显微镜LeicaZ16 APO 本实验室使用的图像采集硬件和软件。由于存在多种不同选择，不同实验室的方法和应用可能有所差异。 
数码相机LeicaDFC295
相机软件LeicaLeica Application Suite v3.1 
ImageJ 软件开源http://imagej.net/Welcome
Sholl 分析 开源http://imagej.net/Sholl_Analysis

参考文献

  1. Sholl, D. A. Dendritic organization of the neurons in the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).
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  14. Hovey, R. C., Coder, P. S., Wolf, J. C., Sielken, R. L., Tisdel, M. O., Breckenridge, C. B. Quantitative assessment of mammary gland development in female Long Evans rats following in utero exposure to atrazine. Toxicol Sci. 119 (2), 380-390 (2011).
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