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蛋白质晶体的微晶衍射分析 活细胞内 衍射

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DOI：

10.3791/55793

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2017年7月21日

 ,  , 
1Infection and Immunity Program, Monash Biomedicine Discovery Institute, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

介绍了一种利用蛋白质微晶进行X射线晶体学的实验方案。两个分析实例 体内纯化后生长的微晶 在细胞内 进行比较。

摘要

许多同步辐射装置上高质量微聚焦光束线的出现，使得常规分析最大尺寸小于10 µm的晶体成为可能，而这类晶体过去曾带来巨大挑战。本文介绍了两种通过X射线晶体学进行蛋白质微晶结构解析的替代性实验流程，特别聚焦于在活体（in vivo）条件下生长的晶体。微晶可通过超声破碎从细胞中提取，并利用差速离心法进行纯化；或者在通过流式细胞术分选含晶体的细胞后，直接在细胞内（in cellulo）进行分析。可选地，可将纯化的晶体或含晶体的细胞浸泡于重原子溶液中，以进行实验相位测定。随后，这些样品均以类似方式制备用于衍射实验：将其点样至微网支撑膜上，并在液氮中快速冷冻。我们简要描述并比较了使用微聚焦同步辐射光束线对分离的微晶和含晶体的细胞进行的序列衍射实验，以获得适用于相位确定、模型构建和精修的数据集。

本流程以家蚕质型多角体病毒1型（Bombyx mori cypovirus 1, BmCPV1）多角体蛋白晶体为例，该蛋白通过重组杆状病毒感染昆虫细胞后表达获得。在此案例中，细胞内（in cellulo）分析比纯化晶体的分析更为高效，从表达到结构精修可在约8天内完成。

引言

在过去二十年中，X射线晶体学在解析生物大分子高分辨率结构方面的应用稳步发展。非专业研究人员日益广泛地采用X射线晶体学，体现了该方法在生命科学多个领域中的普及化1。

传统上，尺寸小于约10 µm的晶体被认为难以处理，甚至无法用于结构测定。随着全球同步辐射光源上专用微聚焦光束线的日益普及，以及微晶操作工具等技术的进步，X射线微晶衍射技术广泛应用所面临的诸多障碍已大幅消除。在串行X射线微晶衍射2,3和微电子衍射4方面的进展表明，使用微晶和纳米晶进行结构测定不仅可行，有时甚至优于使用大尺寸晶体5,6,7。

这些技术进步最初被应用于肽类8以及昆虫病毒产生的天然晶体的研究9,10。如今，它们已被用于研究多种生物大分子，包括最具挑战性的体系，如膜蛋白和大型复合物11。为了便于对这些微晶进行分析，研究人员已在介观相（in meso）条件下对其进行分析，特别是针对膜蛋白12，以及在微流控芯片中进行分析13。

这些新型微晶衍射方法的出现，使得利用体内结晶作为结构生物学的一条新途径成为可能14,15,16，为传统的体外晶体生成提供了替代方案。然而，即使能够在体内形成晶体，仍存在若干障碍，例如在从细胞中纯化过程中配体的降解或丢失、在同步辐射光束线上对晶体进行操作和观察的困难，以及繁琐的X射线衍射实验。作为替代方案，晶体也可在细胞内直接分析，无需任何纯化步骤17,18,19。比较分析表明，此类在细胞内的方法可能比纯化晶体的分析更为高效，并能获得更高分辨率的数据20。

本方案旨在帮助初次接触蛋白质微晶晶体学的研究人员。文中提供了在同步辐射光束线上进行X射线衍射实验的样品制备与操作方法。提出了两种选择：一种是使用分离的晶体进行传统的微晶晶体学研究，另一种是使用流式细胞术分选的含晶体细胞进行in cellulo分析（图1）。

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方案

注意： 在体 已在多种生物体中报道了结晶现象，包括细菌、酵母、植物、昆虫和哺乳动物（详见参考文献） 21）。利用哺乳动物细胞的瞬时转染以及昆虫细胞的杆状病毒感染，已在实验室中实现了重组蛋白的结晶。以下方案是基于 Bombyx mori 根据参考文献中的说明，将家蚕质型多角体病毒1型（BmCPV1）多角体蛋白基因克隆至重组杆状病毒中，置于杆状病毒多角体蛋白启动子下游 22因此，尽管本方案可适用于其他细胞类型（例如 哺乳动物细胞），本文将介绍昆虫细胞的相关操作步骤。本方案假设目标蛋白的过表达已经实现。有关重组杆状病毒的制备及其用于目标蛋白表达的方法可参见相关参考文献。 23,24,25,26,27.

1. 含晶体细胞的鉴定

  1. 若细胞在单层培养中生长，可直接在培养瓶中观察；若细胞在液体培养中生长，则使用以下方案。
    1. 使用无菌刻度移液管转移 500 µL 将细胞转移至微量离心管中。操作时需确保主培养物的无菌状态；应在II级生物安全柜中处理细胞，并遵循标准的无菌操作技术。
    2. 移液器 5 µL 将细胞从微量离心管转移至玻片上。
    3. 小心地将玻璃盖玻片盖在液体上，避免产生气泡。若15分钟内无法进行观察，需用真空脂密封盖玻片以防止蒸发。
  2. 使用倒置显微镜对培养瓶或载玻片进行成像。如有条件，可采用相差显微技术和/或微分干涉差显微技术（DIC）。这两种技术均可增强透明样本的对比度，并突出线条与边缘，从而有助于识别 体内 晶体
  3. 仔细观察细胞。从200倍放大开始，当发现潜在晶体时，逐步调至最大放大倍数进行观察。晶体的存在可能通过细胞形态的改变间接提示图2）。寻找锋利的边缘和折射率的变化（若使用相差显微镜或微分干涉差显微镜）。已知 体内 晶体呈现多种形态，包括棒状、针状簇集、立方体、锥体和多面体（参见 图2 和 表1 （举例如下）。
    注意：每种情况下的含晶体细胞比例均不相同，甚至不同制备样本之间也可能存在差异，但通常不应期望在所有细胞中都观察到晶体。同样，每个细胞中的晶体数量也存在可变性（参见 表1），且一个细胞中可能发现多个晶体。这些因素需通过调整感染复数、改变表达时间以及优化蛋白构建体等方式尽可能进行优化。一方面，优化蛋白表达和细胞生长条件以最大化含晶体细胞的数量，将提高生产效率（例如 较高的感染复数和较晚的细胞培养收获时间）。另一方面，当细胞中含有单个晶体时，有利于数据收集（例如 低感染复数）。鉴于步骤 2.2 中所述流式分选带来的富集效果，我们建议尽量获得较大的晶体（例如 每个细胞一个晶体，即使含晶体细胞的比例较低。
  4. 若观察到晶体，记录其位置（对培养瓶中单层细胞成像时），并估算含晶体细胞的百分比。如有条件，使用配备相机的显微镜，该相机应具备在单细胞水平追踪变化的能力。
  5. 对于悬浮细胞，按照参考文献中详述的方案测定细胞活力。 28对于单层培养的细胞，通过肉眼观察估算细胞的大致汇合度及脱落细胞的数量。
  6. 每天两次监测晶体生长、细胞生长及活性。
  7. 一旦晶体生长明显停止，立即收获细胞。对于病毒多面体等特别坚固的晶体，可延长孵育时间（>4天）会增加大晶体的数量。然而，对于典型的蛋白质晶体，我们建议在细胞活力降至80%以下时进行收获，以防止细胞裂解造成的损害。
  8. 从培养箱中取出培养瓶，并尽快进行步骤 2.2。除非另有说明，后续步骤中均需将细胞置于冰上。

2. 样品纯化

注：我们描述了两种分析方法 体内 从纯化的晶体中分离晶体 细胞内分别。

  1. 晶体纯化
    注意：除非有证据表明目标晶体对低温敏感，否则应在冰上操作并使用预冷缓冲液，以避免晶体降解。
    1. 用移液器将50 mL感染的Sf9细胞转移至50 mL锥形离心管中。这相当于约4 x 108 典型实验中的细胞。
    2. 450 × g 离心 10 分钟，沉淀细胞 4 °C.
    3. 弃去上清液，将沉淀重悬于40 mL预冷的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中。
      注意：磷酸盐缓冲液（PBS）被提议作为纯化的起始点，因其是模拟体内晶体生长环境的标准等渗缓冲液。大多数情况下已采用 PBS 体内 迄今为止在细胞培养中生长的晶体9,14,29. 或者，DMEM培养基也已成功用于纯化过程 体内 来自哺乳动物细胞的晶体 19如果晶体在 PBS 转移过程中明显受损或表现出较差的衍射质量，应将此参数视为潜在的降解来源进行考察。
    4. 使用配备19 mm探头的超声破碎仪，在10 mA条件下对重悬的沉淀物超声处理30秒。为避免样品过热，超声过程中将样品置于盛有冰的烧杯中。如果在步骤2.1.7中评估发现晶体因超声处理而受损，可选用化学或机械方法破碎细胞作为替代方案。
    5. 在 450 × g 条件下，4 °C 离心 10 分钟 4 °C离心后可见两层：上层为细胞碎片，呈浅棕色；下层为多面体晶体沉淀，呈白色粉状。
    6. 弃去上清液，并通过小心移液去除上层。将下层沉淀物重悬于 40 mL 预冷的 PBS 中。
    7. 使用光学显微镜观察样品以评估其质量。
      1. 移液器 5 µL 将细胞或纯化的晶体点样到载玻片上。此步骤可在室温下进行。
      2. 将玻璃盖玻片小心地放置在液体上，避免产生气泡。
      3. 使用倒置显微镜以200倍放大倍数对载玻片进行成像。样本制备后15分钟内完成载玻片上的成像。若无法在15分钟内完成观察，需用真空脂密封盖玻片以防止蒸发。
        注意：对于多面体而言，晶体将呈现为折射性的立方体，大小约为 1 - 10 µm 每侧。通过观察晶体是否出现钝化迹象来检查其完整性（例如 圆润的边缘）、裂纹或溶解现象。同时观察细胞碎片的存在，细胞碎片表现为大小和形状不规则的团块和颗粒状物。
    8. 重复步骤 2.1.5 至 2.1.7，每次循环中用于重悬沉淀的 PBS 体积减半，直至晶体中无可见杂质。将最终沉淀重悬于 1 mL 预冷的 PBS 中，并将晶体转移至微量离心管。将纯化后的晶体储存于 4 °C.
    9. 使用血细胞计数板，按照制造商说明书估算晶体浓度。计数晶体时，方法与计数细胞相同。

蛋白质结晶过程；离心管、碎片与晶体示意图，显微镜图像。
图3：纯化 体内 微晶 BmCPV1 多角体蛋白从 Sf9 昆虫细胞中纯化的代表性结晶结果展示（a) 离心去除超声处理后的细胞碎片和晶体，以及 (b）碎屑层和晶体层的特写。可将碎屑层小心地重悬于上清液中并弃去，以加快晶体纯化。c纯化多面体的光学显微镜图像。比例尺 = 50 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。

  1. 通过流式细胞术分离含晶体细胞
    注意：为了便于在流式细胞术中定义门控，建议平行培养一个对照细胞样本，与表达目标蛋白的样本同时进行。可通过用非相关的重组杆状病毒转染一皿 Sf9 细胞，或制备模拟感染的细胞来实现。样品的分选与成像通常在室温下进行。
    注意：碘化丙啶为疑似致癌物，应小心操作。
    1. 移液4 mL感染的Sf9细胞，代表约3 x 107 细胞——置于适合流式细胞分析的试管中。同时，准备第二管含有等量感染非重组型杆状病毒的Sf9细胞。
    2. 向两个样品中加入碘化丙啶（PI），使其终浓度为 1 µg/mL 流式细胞术检测前立即进行此步骤。该步骤对于识别死亡细胞、细胞团块及碎片至关重要，因为这些成分可能干扰或掩盖前向散射与侧向散射图中的细胞分布情况。配制浓度为1 mg/mL的PI水溶液储备液，并保存于 4 °C 避光
    3. 将细胞上样至标准流式细胞仪，该仪器需具备根据前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）进行细胞分选的能力。对对照样本至少分析20,000个事件即 不含晶体的）样本。在分析中排除死细胞、细胞团块和碎片后，生成FSC对SSC的散点图。
    4. 分析至少 20,000 个含晶体样品的事件。将FSC与SSC图谱与对照样品进行比较。寻找对应于含晶体细胞的独特细胞群。通常，由于形态复杂性增加，含有细胞内晶体的细胞会表现出更高的SSC。如果晶体生长导致细胞体积增大，FSC也可能升高。根据散点图中与对照图谱不同的区域，设定流式分选仪的分选门，以分离相应的细胞群体。按照步骤1所述，通过光学显微镜对分选后的样品进行成像，以确认哪一群体与含晶体细胞相关联。
    5. 使用步骤 2.2.4 中定义的门控，将含有晶体的细胞在 PBS 或其他等渗缓冲液中分选。记录分选的含晶体细胞数量以及最终体积，以便后续操作。将分选后的细胞置于冰上或在 4 °C.
      注：一小时内， >含有30万个包涵体的细胞使用配备100 mm喷嘴的细胞分选仪进行分选（压力138 kPa，频率39 kHz）。此数量的细胞足以用于制备 >1,000 目
    6. 按照步骤 2.1.7 中详述的方案，使用光学显微镜对细胞成像，以确认含晶体细胞的富集情况。细胞分选后应尽快进行数据采集的样品制备，因为晶体可能随时间降解，或因细胞裂解而释放。

流式细胞术散点图，比较FSC与SSC；显示颗粒门控；散射分析结果。
图4：细胞分选。来自以下样本的代表性流式细胞术散点图：（a）未感染细胞（模拟处理），不含晶体；（b）感染了过表达BmCPV1多面体蛋白的重组杆状病毒的Sf9细胞。两群细胞在散射模式上的差异使得可对含晶体的细胞群进行门控（红色门控，侧向散射SSC值较高）。每张图显示20,000次分选事件。SSC：侧向光散射；FSC：前向光散射。（c）分选后细胞代表性群体的光学显微镜图像，显示细胞内存在晶体。比例尺 = 50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

3. 数据采集的样品制备

注意：如果需要对细胞或晶体进行衍生化以用于实验相位测定，请遵循第 3.1 节中详述的方案。否则，直接进入第 3.2 节进行纯化晶体的分析，或第 3.3 节进行 in cellulo 分析。

  1. 纯化或衍生化 在细胞内 微晶
    警告：使用前请查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。实验相位测定中使用的大多数化学试剂具有急性毒性。应采取一切适当的安全措施，包括使用化学通风橱和个人防护装备。废弃物应按照所在机构的规定进行处置。
    注意：对于BmCPV1包涵体蛋白晶体，重原子的种类、浓度及孵育时间仅作为参考性示例给出。针对每一种新的目标蛋白，这些参数必须通过实验另行确定。若所用的相位确定化合物已能使细胞明显着色，则步骤3.3.2中后续的台盼蓝染色可省略。
    1. 制备所需重原子的饱和溶液（或其他用于实验相位测定的化学物质溶液）。通常，所需体积小于 100 µL 每种重金属原子都需要进行此操作。在室温下，将溶液于微型离心机中以最大速度离心5分钟，以去除未溶解的盐分和杂质。
    2. 按每种重原子化合物准备约 50,000 个晶体或分选细胞的分装样品。如果 PBS 与用于衍生化的化学试剂不兼容（即 沉淀形成，溶液变浑浊），在微量离心机中于室温下以 4,000 × g 离心 3 分钟收集晶体，或以 150 × g 离心 3 分钟收集细胞，弃去上清液，轻轻重悬晶体或细胞于 20 µL 合适缓冲液。重复离心和重悬步骤，以确保无PBS残留。调整最终体积至 20 µL 所有等分试样。
    3. 添加 20 µL 向晶体或细胞中加入重原子溶液或其他选定的化学化合物。重原子的最佳浓度取决于多种细胞参数（通透性、脱靶蛋白等）以及目标蛋白晶体的性质。作为起始点，测试3种不同浓度：完全饱和、1/10e、1/100e。
    4. 保持样品在 4 °C 最长可达3天。多角体蛋白晶体非常致密且抗性强，需要较长的浸泡时间才能掺入重原子；对于其他类型的晶体，应通过实验确定重原子的孵育时间和浓度。孵育时间过短将无法充分掺入重原子，而孵育时间过长则可能影响晶体的完整性，从而降低其衍射质量，甚至导致晶体溶解。作为起始条件，建议针对每种重原子溶液尝试3个不同的孵育时间（例如 1 分钟、1 小时和过夜）。成功的衍生化通过衍射数据的分析进行评估，具体方法简述于第 5 节及其中参考文献。
    5. 在微量离心机中，于室温下以 4,000 × g 离心 3 分钟去除过量的重原子溶液（针对晶体），或以 150 × g 离心 3 分钟（针对细胞），弃去上清液，并将晶体或细胞轻轻重悬于 10 µL 缓冲液
  2. 微晶纯化微网支撑的制备
    警告：使用液氮存在窒息、冻伤、富氧环境下的火灾及爆炸等危险。请查阅您所在机构的风险管理规定与安全操作规范。
    1. 根据步骤 2.1.9 中计算的晶体浓度，将浓度调整至 107 通过稀释样品来调整为每毫升含多少晶体；或在微量离心机中以4,000 × g在室温下离心3分钟使晶体沉淀，通过去除上清液调节终体积，并轻轻重悬晶体。
    2. 如果样品需要预先冷冻，请使用液氮预冷干式液氮运输罐或杜瓦瓶。根据需要准备好冻存管或载样杯，并用液氮将其预冷。
    3. 重悬晶体沉淀，并加入 0.5 µL 通过移液将晶体液滴转移至微网格上。使用 700 µm 25-的网筛µm 以方孔作为起点。筛网的面积并非关键，但较大的面积可使每张筛网上形成更多晶体，并在制备过程中减缓蒸发速度。孔径大小可能需要根据晶体尺寸进行优化，以适应大于 25 µm如系统性研究需要，可使用索引网格以在数据采集过程中辅助进行系统性的网格扫描。
    4. 用滤纸芯吸去大部分多余液体。晶体应均匀分散在网格上，彼此不接触。重复步骤 3.1.1 以优化样品浓度。操作应迅速，避免去除过多液体。若无 cryoprotectant，液体将迅速蒸发，可能导致盐晶体形成和/或薄膜丢失。
    5. 添加冷冻保护剂：用移液器移取 0.5 µL 将50%乙二醇水溶液加到载网上（冷冻缓冲液的组成需根据样品进行调整；有关 cryoprotectant 优化的建议可参见参考文献）30）。用纸捻吸去多余液体。与前一步骤不同，此处残留的溶剂薄膜应尽可能薄，以减少晶体、光束路径和测角仪之间对准时产生的视差效应，并最大限度降低光束路径中液体散射X射线所造成的背景干扰。
    6. 立即将微网在液氮中快速冷却，并转移至样品管或机器人载具中，随后放入干式运输罐或杜瓦瓶中储存。
  3. 含晶体细胞的微网制备
    警告：使用液氮存在窒息、冻伤、富氧环境下的火灾以及爆炸等危险。请查阅您所在机构的风险管理和安全操作规范。
    1. 将分选后的细胞转移至一个1.5 mL微量离心管中。根据细胞分选仪记录的细胞计数，将浓度调整至107 通过用 PBS 稀释样品至细胞浓度为 cells/mL；或在微量离心机中以 150 × g 离心 3 分钟（室温）使细胞沉淀，通过移除上清液调节终体积，并轻轻重悬细胞。
    2. 将细胞与等体积的台盼蓝溶液（0.4% w/v）混合，使终浓度为 0.2% w/v。
    3. 若需预先冷冻样品，先用液氮预冷干式运输罐或杜瓦瓶。根据需要准备好冻存管或载网盒，并同样用液氮预冷。
    4. 轻柔重悬细胞，并用移液器移取 0.5 µL 分选细胞至微孔滤膜上。
    5. 用纸条吸去多余液体。细胞应均匀分散在网格上，彼此不接触。若不使用冷冻保护剂（步骤 3.3.6），残留的溶剂薄膜应尽可能薄，以减少晶体制样、光束路径与测角仪之间对准时产生的视差效应，并最大限度降低光束路径中液体散射X射线所导致的背景信号。
    6. 可选：向细胞中加入冷冻保护剂：用移液器吸取 0.5 µL 50% 乙二醇和 50% PBS 溶液的混合液滴加到网格上。冷冻缓冲液的组成应根据样品进行调整；有关 cryoprotectant 优化的建议可参见参考文献30用纸芯吸去多余液体，仅留下一层薄薄的溶剂膜。
      注：在分析多面体蛋白晶体时，省略冷冻保护步骤并未影响X射线衍射的质量 细胞内，尽管此步骤仅适用于纯化的晶体20这仅适用于细胞与冷冻保护剂溶液的孵育过程；样品仍应在100 K下进行分析，以最大限度减少辐射损伤对晶体的影响。
    7. 立即将微网格在液氮中速冻，并转移至冻存管或机器人载具中，随后根据需要转移至干式运输罐或储存杜瓦瓶中。

4. 数据采集

注意：数据收集所用参数仅作为参考，应针对每种晶体类型和同步辐射光束线进行优化。

  1. 在微聚焦晶体学光束线上收集数据（参见参考文献7以获取微聚焦光束线及其特性的列表）。如有条件，使用与晶体尺寸相匹配的准直光束。
  2. 采用单波长反常散射法（SAD）进行实验相位测定时，应在所选重原子反常信号最强的能量下收集数据。若采用多同晶置换法（MIR）进行相位测定，则应在所选重原子合适吸收边能量以上收集数据（相关信息可访问 http://skuld.bmsc.washington.edu/scatter/AS_periodic.html）。
  3. 将微网格装载至测角仪后，首先通过正面（凸面）和侧面方向将微网格中心与光束路径对齐。然后保持微网格正面朝向，通过精细调整对准微网格中某一特定水平通道的中心（例如，可从中央通道开始）。随后沿此水平通道进行数据收集，并仅对对准进行微小调整。如有条件，可使用低剂量X射线衍射光栅扫描进行中心定位，以优化对准（可咨询同步辐射光束线的本地联系人）。
    注意：由于辐射损伤的限制，微晶上可收集的数据量有限（通常为10至30张图像，每张1°振荡），理论上晶体只需在10–30°范围内与光束路径对齐即可。然而，精确对准至关重要，因为微束（通常准直至直径约10 µm或更小）极易错过晶体。
  4. 持续收集衍射数据，直至因辐射损伤导致衍射信号消失。对于多面体蛋白晶体，在13 keV能量、光通量约为3.6 × 1011 光子/秒、使用CCD探测器的条件下，通常采用每1°振荡10秒的曝光时间（总剂量 <30 MGy）。应根据所用光束线及晶体性质优化上述参数。特别是对于像素X射线探测器，建议采用低剂量和精细角度切片。
    注意：若采用细胞内（in cellulo）策略，经台盼蓝染色的细胞在支撑背景上呈现为蓝色斑点，便于与光束对准。若准直微束的尺寸与细胞相近（约10 µm），则细胞内所有晶体将同时被照射。对于含有多个微晶的细胞，这将导致出现多个衍射图样，数据处理较为困难。然而，通常其中一个晶体的衍射信号占主导地位，并在数据处理过程中优先被指标化。对于X射线束显著小于细胞尺寸的光束线，应在数据收集前使用极低X射线通量（>95%衰减）进行光栅扫描，以实现单个晶体的精准定位。
  5. 移至通道中的下一个晶体。
  6. 完成当前通道所有晶体的测试后，转入下一个通道并重复对准程序。持续操作，直至获得足够数据或所有晶体均已被测试。
    1. 确保已处理的通道被明确标识，以避免遗漏或重复照射晶体（必要时可绘制示意图）。通常，细胞经辐照后台盼蓝会变为黄色，可作为标记参考。

显微镜网格检查；聚焦于结构模式的网格排列示意图；研究研究。
图 5：微网支撑样品上的数据采集策略。（a）每条通道的数据采集策略；在每条通道的起始处进行对齐（圆点），然后沿通道采集数据。（b）网格上含有晶体的台盼蓝染色细胞的放大图像，显示于微晶衍射线束屏幕上的实际观察效果。（c）网格上纯化的多面体颗粒的放大图像，显示于微晶衍射线束屏幕上的实际观察效果。网格方格为 25 µm × 25 µm。请点击此处查看此图的放大版本。

5. 数据处理

注意：此处仅简要提及专用于序列微晶衍射的数据处理步骤，即来自多个晶体的数据合并过程。许多优秀的文献已对数据处理进行了深入描述31,32,33,34,35,36，而结构解析不在本实验方案的范围之内。

  1. 选择衍射分辨率和质量最佳的晶体作为参考。
  2. 使用标准晶体学软件包（如 HKL-200031、Mosflm32 或 XDS33）对每颗晶体进行单独处理。为确保辐射损伤不会降低数据集质量，需仔细选择可接受辐射损伤的最末图像。判断辐射损伤过重的截断标准因晶体类型、处理方法及实验目的而异。在 BmCPV1 多面体晶体的定相过程中，当每张图像的信噪比 /<σ(I)> 降至 2 以下，或 HKL-200031 报告的 Rsym 超过 50% 时，即舍弃该数据。
  3. 对每颗晶体，确定其分辨率极限和帧数，并以正确的参数重新处理，以避免积分无信号或信号极弱的数据。
  4. 使用标准软件包（如 HKL-200031 中的 Scalepack、CCP434,35 中的 SCALA 或 XDS33 中的 XSCALE）将最佳晶体的数据与参考晶体进行标度校正并合并。逐步加入不同晶体的数据，同时监测数据集的整体质量，理想情况下直至数据集达到可接受的完整性（>95%）。若某晶体与最佳/参考晶体的同晶型性较差，表现为晶胞参数差异明显或每张图像的 Rmerge/卡方值较差，则应予以剔除。若过多高质量数据集无法与参考晶体标度一致，可使用如 BLEND36 等进行分层聚类分析的程序，以确定最佳的数据组合用于合并。
    注意：在某些空间群中，需测试交替的指标化方案以匹配参考晶体。
  5. 使用标准晶体学软件包进行实验定相、分子置换或结构精修。

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结果

使用替代方法进行结构测定的概述 体内 微晶的制备方法被介绍（图1）。多面体可通过超声处理和离心轻松纯化。由于其密度较高，多面体会在离心管底部形成一层，其上覆盖一层碎片，可通过移液去除该碎片层（图3a 和 3b）。然后对样品进行多轮超声处理和洗涤，直至达到足够的纯度，这一标准通过观察沉淀物呈现的白色 chalky 外观来判断（图3c).

对于 in cellulo 方法，将非感染细胞的流式细胞术图谱与含晶体细胞的图谱进行比较，以确定应选择哪一群细胞，从而将含晶体细胞与其他细胞分选开来（图4）。在此示例中，含有多面体晶体的细胞比非感染细胞具有更高的侧向...

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讨论

本方案提供了两种分析微晶的方法，旨在促进对过去可能被忽略的极小晶体的分析。

微晶纯化的关键步骤
本方案已通过以下方式优化： Bombyx mori 以在Sf9细胞中表达的CPV1多面体蛋白作为模型系统。然而， 体内 微晶在机械强度方面表现出极大的差异性。例如，在昆虫细胞中生长的组织蛋白酶B针状晶体具有较高的刚性和机械稳定性，可采用与本文所述相似的纯化方案进行纯化。 14另一方面，萤火虫荧光素酶晶体也在培养的昆虫细胞中生长，且具有类似的针状形态，但在细胞裂解后会立即溶解 38因此，提取与纯化的方案 体内 晶体的培养需要根据具体情况，通过试错法进行调整，具体步骤如1.3、2a.3-4、2b.4、3.1.3-4和3.2a.5所述。

对于脆弱的晶体，可通过低速离心实现（部分）与细胞碎片的分离即 200 × g）或在管底添加蔗...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢Chan-Sien Lay提供纯化微晶的照片，感谢Daniel Eriksson和Tom Caradoc-Davies在澳大利亚同步加速器MX2光束线提供的支持，以及感谢莫纳什大学FlowCore设施的Kathryn Flanagan和Andrew Fryga所给予的宝贵帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Sf9细胞Life Technologies
SF900-SFM昆虫细胞培养基Life Technologies
1 L细胞培养瓶Thermofisher Scientific
用于昆虫细胞培养的摇床培养箱Eppendorf
50 mL锥形管Falcon
配有50 mL管摆动转子的离心机Eppendorf
配备19 mm探头的超声破碎仪MSE Soniprep 150 
玻璃载玻片Hampton Research
血细胞计数板Sigma-Aldrich
碘化丙啶Thermofisher Scientific
BD Influx细胞分选仪 BD Biosciences
Hampton重金属筛选试剂盒Hampton Research
微量离心机Eppendorf
微网（Micromesh）Mitigen700/25目微网提供更大的表面积。可购买带索引的微网用于系统性研究。
滤纸引线（Paper wick）Mitigen可根据晶体性质和所用冷冻保护剂的不同，调整滤纸引线的尺寸以实现最佳流动效果。
乙二醇Sigma-Aldrich
台盼蓝Life Technologies
MX2微聚焦光束线澳大利亚同步辐射中心（Australian Synchrotron）有关可用微聚焦光束线的列表，请参见Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein
Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793–1806,
doi:10.1071/CH14455。

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