介绍了一种利用蛋白质微晶进行X射线晶体学的实验方案。两个分析实例 体内纯化后生长的微晶 在细胞内 进行比较。
介绍了一种利用蛋白质微晶进行X射线晶体学的实验方案。两个分析实例 体内纯化后生长的微晶 在细胞内 进行比较。
许多同步辐射装置上高质量微聚焦光束线的出现，使得常规分析最大尺寸小于10 µm的晶体成为可能，而这类晶体过去曾带来巨大挑战。本文介绍了两种通过X射线晶体学进行蛋白质微晶结构解析的替代性实验流程，特别聚焦于在活体（in vivo）条件下生长的晶体。微晶可通过超声破碎从细胞中提取，并利用差速离心法进行纯化；或者在通过流式细胞术分选含晶体的细胞后，直接在细胞内（in cellulo）进行分析。可选地，可将纯化的晶体或含晶体的细胞浸泡于重原子溶液中，以进行实验相位测定。随后，这些样品均以类似方式制备用于衍射实验：将其点样至微网支撑膜上，并在液氮中快速冷冻。我们简要描述并比较了使用微聚焦同步辐射光束线对分离的微晶和含晶体的细胞进行的序列衍射实验，以获得适用于相位确定、模型构建和精修的数据集。
本流程以家蚕质型多角体病毒1型（Bombyx mori cypovirus 1, BmCPV1）多角体蛋白晶体为例，该蛋白通过重组杆状病毒感染昆虫细胞后表达获得。在此案例中，细胞内（in cellulo）分析比纯化晶体的分析更为高效，从表达到结构精修可在约8天内完成。
在过去二十年中，X射线晶体学在解析生物大分子高分辨率结构方面的应用稳步发展。非专业研究人员日益广泛地采用X射线晶体学，体现了该方法在生命科学多个领域中的普及化1。
传统上，尺寸小于约10 µm的晶体被认为难以处理，甚至无法用于结构测定。随着全球同步辐射光源上专用微聚焦光束线的日益普及，以及微晶操作工具等技术的进步，X射线微晶衍射技术广泛应用所面临的诸多障碍已大幅消除。在串行X射线微晶衍射2,3和微电子衍射4方面的进展表明，使用微晶和纳米晶进行结构测定不仅可行，有时甚至优于使用大尺寸晶体5,6,7。
这些技术进步最初被应用于肽类8以及昆虫病毒产生的天然晶体的研究9,10。如今，它们已被用于研究多种生物大分子，包括最具挑战性的体系，如膜蛋白和大型复合物
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注意： 在体 已在多种生物体中报道了结晶现象，包括细菌、酵母、植物、昆虫和哺乳动物（详见参考文献） 21）。利用哺乳动物细胞的瞬时转染以及昆虫细胞的杆状病毒感染，已在实验室中实现了重组蛋白的结晶。以下方案是基于 Bombyx mori 根据参考文献中的说明，将家蚕质型多角体病毒1型（BmCPV1）多角体蛋白基因克隆至重组杆状病毒中，置于杆状病毒多角体蛋白启动子下游 22因此，尽管本方案可适用于其他细胞类型（例如 哺乳动物细胞），本文将介绍昆虫细胞的相关操作步骤。本方案假设目标蛋白的过表达已经实现。有关重组杆状病毒的制备及其用于目标蛋白表达的方法可参见相关参考文献。 23,24,25,26,27.
1. 含晶体细胞的鉴定
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使用替代方法进行结构测定的概述 体内 微晶的制备方法被介绍（图1）。多面体可通过超声处理和离心轻松纯化。由于其密度较高，多面体会在离心管底部形成一层，其上覆盖一层碎片，可通过移液去除该碎片层（图3a 和 3b）。然后对样品进行多轮超声处理和洗涤，直至达到足够的纯度，这一标准通过观察沉淀物呈现的白色 chalky 外观来判断（图3c).
对于 in cellulo 方法，将非感染细胞的流式细胞术图谱与含晶体细胞的图谱进行比较，以确定应选择哪一群细胞，从而将含晶体细胞与其他细胞分选开来（图4）。在此示例中，含有多面体晶体的细胞比非感染细胞具有更高的侧向.......
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本方案提供了两种分析微晶的方法，旨在促进对过去可能被忽略的极小晶体的分析。
微晶纯化的关键步骤
本方案已通过以下方式优化： Bombyx mori 以在Sf9细胞中表达的CPV1多面体蛋白作为模型系统。然而， 体内 微晶在机械强度方面表现出极大的差异性。例如，在昆虫细胞中生长的组织蛋白酶B针状晶体具有较高的刚性和机械稳定性，可采用与本文所述相似的纯化方案进行纯化。 14另一方面，萤火虫荧光素酶晶体也在培养的昆虫细胞中生长，且具有类似的针状形态，但在细胞裂解后会立即溶解 38因此，提取与纯化的方案 体内 晶体的培养需要根据具体情况，通过试错法进行调整，具体步骤如1.3、2a.3-4、2b.4、3.1.3-4和3.2a.5所述。
对于脆弱的晶体，可通过低速离心实现（部分）与细胞碎片的分离即 200 × g）或在管底添加蔗.......
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作者无任何利益冲突需要披露。
作者谨此感谢Chan-Sien Lay提供纯化微晶的照片，感谢Daniel Eriksson和Tom Caradoc-Davies在澳大利亚同步加速器MX2光束线提供的支持，以及感谢莫纳什大学FlowCore设施的Kathryn Flanagan和Andrew Fryga所给予的宝贵帮助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Sf9细胞 | Life Technologies | ||
| SF900-SFM昆虫细胞培养基 | Life Technologies | ||
| 1 L细胞培养瓶 | Thermofisher Scientific | ||
| 用于昆虫细胞培养的摇床培养箱 | Eppendorf | ||
| 50 mL锥形管 | Falcon | ||
| 配有50 mL管摆动转子的离心机 | Eppendorf | ||
| 配备19 mm探头的超声破碎仪 | MSE Soniprep 150 | ||
| 玻璃载玻片 | Hampton Research | ||
| 血细胞计数板 | Sigma-Aldrich | ||
| 碘化丙啶 | Thermofisher Scientific | ||
| BD Influx细胞分选仪 | BD Biosciences | ||
| Hampton重金属筛选试剂盒 | Hampton Research | ||
| 微量离心机 | Eppendorf | ||
| 微网（Micromesh） | Mitigen | 700/25目微网提供更大的表面积。可购买带索引的微网用于系统性研究。 | |
| 滤纸引线（Paper wick） | Mitigen | 可根据晶体性质和所用冷冻保护剂的不同，调整滤纸引线的尺寸以实现最佳流动效果。 | |
| 乙二醇 | Sigma-Aldrich | ||
| 台盼蓝 | Life Technologies | ||
| MX2微聚焦光束线 | 澳大利亚同步辐射中心（Australian Synchrotron） | 有关可用微聚焦光束线的列表，请参见Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793–1806, doi:10.1071/CH14455。 |
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