骨髓衍生祖细胞的低氧预处理作为成熟雪旺细胞产生的来源

摘要

具有神经电位的骨髓基质细胞（MSC）存在于骨髓内。我们的方案通过缺氧预处理丰富了这种细胞群，之后引导他们成为成熟的雪旺氏细胞。

摘要

该手稿描述了一种从骨髓基质细胞（MSC）群体中丰富神经祖细胞并随后将其引导至成熟的施万细胞命运的手段。我们将大鼠和人类MSC接受短暂的缺氧条件（1％氧气16小时），随后在含有表皮生长因子（EGF）/碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）补充的低附着底物上扩增为神经球。将神经球接种到聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白包被的组织培养塑料上，并在含有β-Heregulin，bFGF和血小板衍生生长因子（PDGF）的胶质细胞混合物中培养以产生施旺细胞样细胞（SCLC）。 SCLC通过共同培养2周，以E14-15怀孕的Sprague Dawley大鼠获得的纯化的背根神经节（DRG）神经元为指导。成熟的雪旺氏细胞表现出S100β/ p75表达的持续性，并可形成髓鞘细胞。以这种方式生成的细胞具有潜力脊髓损伤后自体细胞移植中的应用，以及疾病建模。

引言

神经祖细胞及其衍生物的移植显示出创伤神经损伤^1,2和神经变性3,4之后的治疗策略的希望。在临床应用之前，必须确保:i）获取和扩大自体来源的干/祖细胞的方法，以及ii）将其引导到相关的成熟细胞类型的手段³ 。我们对细胞治疗脊髓损伤的兴趣导致我们从成人组织中寻找一个健壮的自体细胞来源的神经祖细胞。

MSCs的亚群源自神经嵴，并且容易从骨髓腔进入。这些细胞是可以产生神经元和神经胶质的神经祖细胞⁵ 。脑缺血的动物模型表明，缺氧促进了唾液脑内神经祖细胞的多发性和多能性⁶ 。这是利用缺氧预处理作为扩展骨髓来源的神经祖细胞的手段的基础。

将施万细胞移植到损伤的脊髓中促进再生² 。 SCLC可以通过补充Gliogenic因子（ 即， β-Heregulin，bFGF和PDGF-AA）从MSC产生，但表现出表型不稳定性。退出生长因子后，它们恢复成为成纤维细胞样表型⁷ 。由于异常分化和致癌的风险，细胞移植中的表型不稳定性是不合需要的。由于施旺细胞前体与胚胎周围神经⁸内的轴突束相关，我们被引导与纯化的胚胎DRG神经元^共培养SCLC ^{7 ，}ass ="xref"> 9。结果成熟的雪旺氏细胞是命运决定的，并在体外证明功能^7,9和体内 ¹⁰ 。

我们用于富集MSC的神经祖细胞的方案是简单和有效的，导致后续测定的细胞数量增加。通过共培养平台推导命运致命的雪旺氏细胞允许研究胶质细胞分化和产生用于潜在临床应用的稳定和功能的施万细胞。

方案

所有涉及动物的手续均严格按照NIH"实验动物护理和使用指南"进行，并经香港大学李嘉诚医学院动物实验动物教学与研究委员会批准。获得知情同意后，从健康供体的髂嵴获得人骨髓样品。香港大学机构审查委员会批准议案。

1.大鼠MSC培养物的制备

1. 从股骨收获MSC
   1. 在使用前，将所有的夹层工具（ 即精细剪切剪刀，钝头切割剪刀和齿形钳子）在180°C下高压灭菌至少2小时。
   2. 制备包含补充有15％胎牛血清（FBS）和青霉素/链霉素（P / S，1％v / v）的最小必需培养基-α修饰（αMEM）的MSC生长培养基）。
   3. 用戊巴比妥过量（240mg / kg体重，腹膜内）牺牲年轻的雄性Sprague Dawley大鼠（体重200-250g）。
      注意:来自不同大鼠的骨髓样品应分开处理。
   4. 将牺牲的动物置于仰卧位。用70％乙醇彻底清洁他们的腹部和下肢。
   5. 使用精细的解剖剪刀和镊子去除内侧大腿上的皮肤和皮下组织。沿周向除去大腿肌肉直到股骨暴露。继续向近端和远端，直到看到膝盖和髋关节。通过髋关节和膝关节脱位股骨，使用钝头切割剪刀。
      注意:在这个阶段不要横断股骨以露出骨髓腔。将完整的股骨转移到层流组织培养罩以进一步处理。
   6. 使用钝头切割剪刀穿过干to端穿过股骨的远端和近端。
   7. 将70μm的细胞过滤器放在50mL锥形管上。将含有磷酸盐缓冲盐水（PBS，10 mM Na ₂ HPO ₄ ，pH 7.4）的21 G，10 mL注射器插入裸露的股管，并通过反复冲洗将骨髓内容物冲洗成锥形管。
      注意:使用约20 mL PBS冲洗每个股骨。如果被冲洗的内容物的颜色保持血染和混浊，则可以使用较大的体积。
   8. 通过480×g离心5分钟收集细胞。丢弃上清液。将细胞沉淀重悬于10mL的MSC生长培养基中。将细胞置于10厘米的组织培养皿上。将组织培养皿放入细胞培养箱（37℃，5％CO ₂ ）中。将电镀的初始日期记录为第0天。
      注意:在涉及离心的所有步骤中，设置最大减速度的制动器。
2. 建立和扩建MSC殖民地
   注意:本协议r组织培养上的精液塑性粘附作为从骨髓腔内选择MSC的手段¹¹ 。允许骨髓含量粘附到组织培养塑料上2天。
   1. 在第2天，用10mL PBS冲洗培养板三次以去除非贴壁细胞。冲洗后用10mL的生长培养基替换PBS。用PBS洗涤细胞，每3天补充MSC生长培养基。
      注意:MSC殖民地在第6-7天应该可见（ 图2A ）。
   2. 在第10天通过除去生长培养基并用PBS冲洗细胞，使细胞通过细胞。加入1.5 mL重组酶切细胞解离试剂，37℃孵育5 min。加入3 mL MSC生长培养基中和反应。通过以250×g离心5分钟收集分离的细胞。
   3. 在PBS中适当稀释后，使用血细胞计数器量化沉淀中的细胞。
   4. 将种子传代细胞以40,000个细胞/ cm ²的密度转移到MSC生长培养基中的10cm培养板中。
      注意:大鼠MSC在传代后2天内应达到80-90％汇合（ 图2B ）。细胞可以如步骤1.2.2所述传代达8代。 MSC可以通过免疫细胞化学和它们的三线分化能力来表征（ 图3 ）。通道3和8之间只有MSC培养物经受随后的缺氧预处理和神经祖细胞富集。更大通道数的MSC采用扁平形态（ 图2C ），不产生足够数量的神经祖细胞。这些文化应该被丢弃。

2.人类BMSC培养物的制备

1. 用9 mL MSC生长培养基稀释1 mL人骨髓抽吸液，细胞在10厘米的组织培养皿上。将培养物保持在细胞培养箱（37℃，5％CO ₂ ）中。
2. 2天后取出培养基，用10mL PBS轻轻冲洗培养液三次以去除非贴壁细胞。最后冲洗后，取出PBS，并用10 mL的MSC生长培养基更换。在PBS冲洗后每3天培养一次，补充生长培养基。
   注意:第6-7天，MSC菌落应该可见。殖民地的数量可能会在受试者之间变化。
3. 在第10天通过细胞，如步骤1.2.2所述。在PBS中适当稀释后，使用血细胞计数器量化沉淀中的细胞。将传代细胞以40,000个细胞/ cm ²的密度接种到MSC生长培养基中的10cm培养板上。
   注意:人类MSC（ 图2D ）显示与大鼠MSC相似的形态，同样应在传代后2天内达到80-90％汇合。他们应该是chara通过免疫细胞化学和它们的三线分化能力进行调整¹² 。与大鼠MSC一样，在第3代和第8代之间的人类MSC接受后续的缺氧预处理和神经祖细胞富集。

缺氧预处理

1. 拆开环形夹具后，拆除缺氧室部件（ 即底座，盖子，托盘），并用70％乙醇清洁各个部件。将腔室部件置于层流组织培养罩内，在UV光下灭菌15分钟。
2. 在缺氧预处理之前，取出培养基，并用10mL PBS冲洗大鼠和人MSC培养物（第1和第2部分）。用10mL补充有25mM HEPES的MSC生长培养基替换PBS。
   注意:培养在10厘米盘子上的MSC在进行缺氧预处理前应达到80-90％的汇合度。
3. 放cul在缺氧室内的菜肴。重新组装腔室部件并拧紧环夹。将99％N ₂ /1％O ₂的气体混合物以10升/分钟的流速冲洗到室中5分钟。
4. 密封缺氧室的连接端，确保没有气体泄漏。将细胞培养箱（37℃，5％CO ₂ ）放置室16小时。
5. 完成缺氧预处理后，从室中取出培养物，为后续的神经祖细胞富集培养做准备。

神经祖细胞丰富文化

1. 制备由补充有B27（2％v / v），碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，20ng / mL），表皮生长因子（EGF，EGF）的Dulbecco修饰的Eagle培养基/ Ham的营养混合物F12（DMEM / F12）组成的神经祖细胞培养基20ng / mL）和P / S（1％v / v）。
2. 分离缺氧预处理的大鼠/人类MSC，如步骤1.2.2所述。通过以250×g离心5分钟收集分离的细胞。使用血细胞计数器在PBS中适当稀释后，定量细胞沉淀。
3. 将细胞重悬于神经祖细胞培养基中，并以6,000个细胞/ cm ²的密度将其种子置于低附着的6孔板上。将培养物置于细胞培养箱（37℃，5％CO ₂ ）中12天。每3天补充75％的神经祖细胞。
   注意:在第6-7天应该观察到大小的非粘附细胞簇。在第10-12天，可以观察到直径≥100μm的神经球（ 图4 ）。与在正常氧条件下培养的MSC相比，低氧预处理的MSC应该产生更多的神经球。
4. 通过将其吸入10 mL移液管并将其转移到15 mL锥形管中，在第12天收集神经球。离心神经球250 xg 5分钟。
   注意:神经球可以特征在第12天用于神经祖细胞标志物，如巢蛋白和GFAP ⁷ 。

通过与DRG神经元的共培养生成命运致命的雪旺氏细胞

1. 制备纯化的大鼠DRG神经元
   1. 在使用前，将所有的夹层工具（ 即，夹层剪刀，镊子，两个显微切割钳和显微解剖剪刀）高压灭菌至少2小时。
   2. 在4℃下，将具有聚-D-赖氨酸（PDL，10μg/ mL PBS）的6孔组织培养板过夜。取出PDL，每孔用1.5 mL PBS冲洗。
   3. 继续在37℃下用层粘连蛋白（10μg/ mL，PBS）包被2小时。每孔用1.5 mL PBS冲洗平板。
   4. 制备DRG神经元维持培养基，其中包括补充有B27（2％v / v），L-谷氨酰胺（1％v / v），神经生长因子（NGF，20ng / mL）和P / S（1 ％v / v）。
   5. 制备DRG神经元纯化培养基，由补充B27（2％v / v），L-谷氨酰胺（1％），NGF（20ng / mL），P / S（1％），氟脱氧尿苷（FDU，10 μg/ mL）和尿苷（10μg/ mL）。
   6. 通过戊巴比妥过量（240mg / kg体重，腹膜内）在妊娠14-15日怀孕大鼠。
   7. 将牺牲的动物置于仰卧位。用70％乙醇彻底清洁腹部。
   8. 使用精细的解剖剪刀和镊子纵向切割动物的下腹壁。使用解剖剪刀识别并清除子宫。切割子宫壁暴露和提取胚胎。将胚胎转移到装有PBS的无菌10cm培养皿中。将培养皿放在冰上。
   9. 将用于解剖的胚胎转移到装有PBS的无菌10cm培养皿（室温）中并将其置于解剖显微镜下。让胚胎处于俯卧位。
      不E:发白的脊髓和附着的DRG可以通过其半透明的皮肤在胚胎的背部看到。
   10. 沿脊髓的两侧插入微分解钳，并使用钝性剥离开始将脊髓与周围的软组织分开。使用显微解剖镊子沿着颈部开口和尾巴切割没有动物的脊髓。在电线的腹侧进行进一步的钝性剥离，以将其从周围的软组织中释放出来。
   11. 使用微分解钳去除残留的软组织，在脱离脊髓的背侧。
       注意:在这个阶段，只有脊髓，神经根和附着的DRG应该保留。
   12. 使用显微解剖钳从其连接的神经根分离个体DRG。使用连接到1 mL尖端的移液器笔将DRG转移到含有PBS的1.5 mL无菌离心管中。
       注意:对于每个1.5 mL管，最多为可以容纳100个DRG。
   13. 以250 xg的速度将DRG离心5分钟，并重新悬浮于重组酶切细胞解离试剂（每管200μL）。孵育（37℃，5％CO ₂ ）10分钟。以250 xg离心DRG 5分钟，取出上清液，重悬于DRG神经元维持培养基中。通过使用200μL移液管尖端轻轻研磨分离沉淀。在适当稀释后使用血细胞计数器量化沉淀中的细胞。
   14. 将细胞以5,000个细胞/ cm ²的密度种植在每孔1.5mL的DRG神经元维持培养基中的PDL /层粘连蛋白包被的6孔板中。培养两天后，取出DRG神经元维持培养基，用PBS冲洗，更换为DRG神经元纯化培养基。
       注意:对于每个纯化周期，用纯化培养基处理DRG培养物2天，然后在维持培养基中孵育1天。 3-4次纯化循环后，预期所有内源性神经胶质的卵圆形⁷ 。这应该需要大约14天。纯化的培养物对神经元标记TUJ1测试为阳性，并且S100β表达缺失（ 图5 ）。
2. 雪旺细胞样细胞的产生
   1. 制备补充有β-非调白蛋白（100ng / mL），bFGF（10ng / ml），血小板衍生生长因子（PDGF-AA，5ng / mL），FBS（10％）和P / S（1％v / v）。
   2. 将第4部分制备的神经球以每孔5-10微米的密度，每孔5-10毫升的神经胶质细胞诱导培养基在PDL /层粘连蛋白包被的6孔板中制备。用PBS清洗细胞后，每2天更换一次胶质细胞诱导培养基。
      注意:接种的神经球的细胞被认为在第2天向外迁移。到第7天，迁移细胞具有锥形外观，并应证明施万细胞的免疫阳性标志物p75神经营养因子受体（p75）和S100β7。这些细胞被称为SCLC。
3. SCLCs与DRG神经元的共培养
   1. 以1:1体积与体积比制备由DRG神经元维持培养基（步骤5.1.4）和胶质诱导培养基（步骤5.2.1）组成的共培养培养基。
   2. 准备由补充有FBS（5％），β-非调白蛋白（10ng / mL）和P / S（1％v / v）的DMEM / F12组成的施万细胞维持培养基。
   3. 从第7天SCLC中取出培养基，用PBS冲洗，并将其与0.5mL /孔的重组酶切细胞解离试剂在37℃孵育5分钟。将SCLC重悬于共培养培养基中。
   4. 在适当稀释后用血细胞计数器量化细胞。
   5. 将SCLC以1,000个细胞/ cm ²的密度接种到纯化的DRG神经元培养物上。保持共培养14天，每2天更换一次。
      注意:在共培养期间，SCLC获得了成熟的施万细胞典型的纺锤状形态（ 图6 ）。这些细胞在生长因子撤出后仍然保持其表型，并且能够在体外和体内髓鞘髓鞘7,10。施万细胞标志物（ 即 p75和S100β）的阳性应通过免疫荧光进行监测。
   6. 共同培养完成后，通过命运提出的施万细胞，如步骤1.2.2所述。每孔使用0.5 mL离解试剂。在适当稀释后用血细胞计数器量化细胞。
   7. 以10,000个细胞/ cm ²的密度重悬在施万细胞维持培养基中的命运承诺的雪旺氏细胞。将种子细胞分成PDL /层粘连蛋白包被的6孔板进行免疫荧光。
      注意:共培养不可避免地含有已经采用成纤维细胞的MSC细胞命运⁷ 。在共同培养完成后，这些细胞与命运致命的施万细胞一起传播。位于该成纤维细胞基质顶部的雪旺氏细胞可以容易地分离，并且在PBS（4℃）的"冷喷"中冲洗后进一步扩大，如其他地方所述。命运承诺的施万细胞可以在维持培养基中扩增1个月。

结果

我们的协议关键阶段的概述如图1所示 。总之，通过依靠组织培养塑料选择大鼠和人类MSC。扩张的MSC被缺氧预处理，然后经历神经球形成条件。电镀神经球，使其分化成SCLC。 SCLC与纯化的DRG神经元共培养以产生命运赋予的施旺细胞。

培养的大鼠和人类MSC的形态如图2所示 。显示出与健康的锥形形态相比，MSCs维持高通道数的四边形出现，这些丢失了它们的多能性。扩大的大鼠和人类殖民地应该证明MSC标志物的表达，造血干细胞标志物的缺失和三线性的能力差（ 图3 ）。第3代和第8代之间的健康MSC经历缺氧预处理16小时，然后在补充有EGF / bFGF的低粘附培养板上传代。低氧预处理导致更多的神经球，以及更大的平均神经球大小（ 图4

讨论

在通过缺氧预处理和神经球培养富集神经祖细胞之前，必须保持MSC的"干性"。根据我们的经验，可以通过其细长的成纤维细胞样形态可靠地鉴定多能MSC。相比之下，采用更扁平，四边形形态，具有突出的细胞骨架应力纤维的MSC不容易采用神经细胞命运，应该被丢弃。一般来说，我们不使用通道数大于8的MSC。为了保持它们的干性，在达到100％汇合之前及时通过MSC是至关重要的。相反，保持MSC在一个太低的汇合是不合需要的。根据我们的经验，以40,000个细胞/ cm ²的密度接种MSC，或者以1:2比例汇合80％的传代细胞，可以获得最好的结果。

DRG网络的正确建立和维护是一个评论家共同成功的决定因素。 DRG收获所需的时间应保持在最低限度。单独的神经节应以无创伤的方式处理，特别是在脱离脊髓时，最好只处理神经根。通常，我们的目标是在动物处理时间和收获的DRG的酶消化之间的时间不到2小时，因为延长的收获导致组织浸渍和细胞活力的丧失。经常遇到培养过程中DRG神经元与基质脱落。为了防止这种情况发生，涂层应该在组织收获时间附近新鲜制备和进行。一般来说，大的未消化的DRG群体分离较多，不...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
&MEM	Sigmaaldrich	M4526
DMEM/F12	Thermofisher scientific	12400-024
Neurobasal 培养基	Thermofisher scientific	21103-049
FBS	Biosera	FB-1280/500
B27	Thermofisher scientific	17504-001
表皮生长因子 （EGF）	Thermofisher scientific
碱性成纤维细胞生长因子 （bFGF）	Peprotech	100-18B/100UG
神经生长因子 （NGF）	Millipore	NC011
血小板衍生生长因子-AA （PDGF-AA	）Peprotech	100-13A
Heregulin beta-3， EGF 结构域 （β-Her）	Millipore	01-201
尿苷	Sigmaaldrich	U3003
5-氟尿苷-2' - 脱氧尿嘧啶 （FDU）	Sigmaaldrich	F0503
聚-D-赖氨酸 （PDL）	Sigmaaldrich	P7886-1G
层粘连蛋白	Thermofisher scientific	23017015
GlutaMAX	Thermofisher scientific	35050061
青霉素/链霉素 （P/S）	Thermofisher Scientific	15140-122
TrypLE Express	Thermofisher Scientific	12604-013
10 cm 板，用于贴壁培养	TPP	93100	用于通过组织培养粘附选择MSC 用于
贴壁培养的6孔板	TPP	92006	用于传代后MSC的扩增
用于非贴壁培养的超低6孔板	康宁	3471	用于神经祖细胞富集
抗人CD90（Thy-1）	BD Biosciences	555593
抗人CD73	BD Biosciences 550256
抗人/大鼠 STRO-1	R&D Systems	MAB1038
抗人巢蛋白	研发D Systems	MAB1259
抗人 CD45	BD Biosciences	555480
抗大鼠 CD90（Thy-1）	BD Biosciences	554895
抗大鼠 CD73	BD Biosciences 551123
抗大鼠巢蛋白	BD Biosciences	MAB1259
抗大鼠 CD45	BD Biosciences	554875
抗 S100β	Dako	Z031101
抗 p75	Millipore	MAB5386
抗 GFAP	Sigmaaldrich	G3893
抗 III 类β微管蛋白 （Tuj-1）	Covance	MMS-435P
抗人核	Millipore	MAB1281
缺氧室	Billups-Rothenberg	MIC-101
HEPES缓冲液	Sigmaaldrich	H4034-100G