骨髓中存在具有神经潜能的骨髓基质细胞（MSCs）。本方案通过低氧预处理富集此类细胞群体，随后诱导其分化为成熟的施万细胞。
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骨髓来源祖细胞的缺氧预处理作为生成成熟施万细胞的来源
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
本论文描述了一种从骨髓基质细胞（MSC）群体中富集神经前体细胞，并进一步将其诱导为成熟施万细胞的方法。我们将大鼠和人类的MSC置于短暂的低氧环境（1%氧气，持续16小时），随后在低黏附基质上添加表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）进行神经球扩增培养。将神经球接种于聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白包被的组织培养塑料表面，并在含有β-神经调节蛋白、bFGF和血小板源性生长因子（PDGF）的胶质诱导混合培养基中培养，以生成施万细胞样细胞（SCLC）。通过与来自E14-15天妊娠Sprague Dawley大鼠的纯化背根神经节（DRG）神经元共培养2周，诱导SCLC向终末命运分化。成熟的施万细胞可持续表达S100β和p75，并能够形成髓鞘片段。采用该方法生成的细胞在脊髓损伤后的自体细胞移植以及疾病建模方面具有潜在应用价值。
引言
神经前体细胞及其衍生物的移植在治疗创伤性神经损伤1,2和神经退行性疾病3,4方面展现出良好的应用前景。在进入临床应用之前，必须确保两点：i) 获得并扩增自体干细胞/前体细胞来源的方法；ii) 能够将这些细胞定向诱导为相关成熟细胞类型的方法3。我们对脊髓损伤的细胞治疗感兴趣，因此致力于从成体组织中寻找一种稳定且自体来源的神经前体细胞。
间充质干细胞（MSCs）的一个亚群起源于神经嵴，并可轻易从骨髓腔中获取。这些细胞是神经前体细胞，能够分化为神经元和胶质细胞5。脑缺血的动物模型表明，缺氧可促进脑内神经前体细胞的增殖及其多向分化潜能6。这为利用缺氧预处理来扩增骨髓来源的神经前体细胞提供了理论基础。
施旺细胞移植至受损脊髓可促进再生2小细胞肺癌（SCLC）可通过向间充质干细胞（MSCs）添加胶质发生相关因子而生成（即， β-Heregulin、bFGF 和 PDGF-AA）可诱导表型转变，但表现出表型不稳定性。在撤除生长因子后，它们会恢复为成纤维细胞样表型7表型不稳定在细胞移植中是不可取的，因其可能导致异常分化和致癌风险。由于施万细胞前体在胚胎期周围神经中与轴突束相关联8，我们由此将SCLC与纯化的胚胎背根神经节（DRG）神经元进行共培养7,9. 结果成熟的施万细胞具有确定的细胞命运，并表现出功能特性 体外7,9 和 体内10.
我们从间充质干细胞（MSCs）中富集神经前体细胞的方案简单高效，可增加细胞数量，便于后续检测。通过共培养平台获得命运已定向的施万细胞，可用于研究胶质细胞分化，并生成稳定且具有功能的施万细胞，具有潜在的临床应用价值。
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方案
所有涉及动物的实验操作均严格遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》进行，并经香港大学李嘉诚医学院实验动物使用伦理委员会批准。人骨髓样本来自健康供体髂嵴，在获得知情同意后采集。相关实验方案已获香港大学机构审查委员会批准。
1. 大鼠MSC培养物的制备
- 从股骨中收获间充质干细胞
- 高压灭菌所有解剖工具（即， 精细解剖剪、钝头剪刀和有齿镊子）在使用前于180 °C下灭菌至少2小时。
- 配制MSC生长培养基，包含添加15%胎牛血清（FBS）和青霉素/链霉素（P/S，1% v/v）的最低必需培养基-α修改型（αMEM）。
- 通过腹腔注射过量戊巴比妥钠（240 mg/kg 体重）处死年轻的雄性 Sprague Dawley 大鼠（体重 200–250 g）。
注意：不同大鼠的骨髓样本应分别处理。 - 将处死的动物置于仰卧位，用70%乙醇彻底清洁其腹部和下肢。
- 使用精细解剖剪和镊子去除大腿内侧的皮肤和皮下组织。环形去除大腿肌肉，直至暴露股骨。向近端和远端继续操作，直至可见膝关节和髋关节。使用钝头剪刀通过髋关节和膝关节离断股骨。
注意：此阶段不要切断股骨以暴露骨髓腔。将完整的股骨转移至层流组织培养罩中，用于后续处理。 - 使用钝头剪刀通过股骨的干骺端横断其远端和近端。
- 将70 µm细胞滤网置于50 mL锥形管上。插入一支含有磷酸盐缓冲液（PBS，10 mM Na2HPO4，pH 7.4）注入暴露的股骨骨髓腔，通过反复冲洗将骨髓内容物冲入锥形管中。
注意：每根股骨约使用 20 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）进行冲洗。若冲洗液颜色仍呈血性且浑浊，可增加冲洗体积。 - 以480 × g离心5分钟收集细胞，弃去上清液。将细胞沉淀重悬于10 mL间充质干细胞生长培养基中。将细胞接种至10 cm组织培养皿中，将培养皿置于细胞培养箱（37 °C，5% CO₂）中培养。2记录铺板的初始日期为第0天。
注意：在涉及离心的所有步骤中，将刹车设置为最大减速。
- 间充质干细胞集落的建立与扩增
注意：本方案依赖于组织培养用塑料器皿的贴壁特性，作为从骨髓腔内筛选间充质干细胞（MSCs）的方法11骨髓内容物在组织培养塑料表面贴壁培养2天。- 第2天，用10 mL PBS冲洗培养板三次，以去除未贴壁的细胞。冲洗后，将PBS更换为10 mL间充质干细胞（MSC）生长培养基。此后每3天用PBS洗涤细胞一次，并补充新鲜的MSC生长培养基。
注意：MSC 克隆应在第 6–7 天可见（图 2A). - 在第10天传代细胞，移除生长培养基，用PBS洗涤细胞。加入1.5 mL重组酶细胞解离试剂，于37 °C孵育5 min。加入3 mL间充质干细胞（MSC）生长培养基以中和反应。在250 × g离心5 min收集解离的细胞。
- 使用血细胞计数板，在 PBS 中适当稀释后对沉淀中的细胞进行计数。
- 以40,000个细胞/cm²的密度传代培养细胞2 加入10厘米培养皿中，使用MSC生长培养基。
注意：大鼠MSCs在传代后2天内应达到80-90%的融合度图2B). 细胞可按照步骤1.2.2所述方法传代，最多可传代8次。间充质干细胞（MSCs）可通过免疫细胞化学方法及其三系分化潜能进行表征（图3)12仅使用第3至第8代的MSC培养物进行后续的低氧预处理和神经前体细胞富集。代次更高的MSC会呈现扁平化的形态（图 2C）且无法产生足够数量的神经前体细胞，此类培养物应予以弃用。
- 第2天，用10 mL PBS冲洗培养板三次，以去除未贴壁的细胞。冲洗后，将PBS更换为10 mL间充质干细胞（MSC）生长培养基。此后每3天用PBS洗涤细胞一次，并补充新鲜的MSC生长培养基。
2. 人骨髓间充质干细胞培养物的制备
- 取1 mL人骨髓穿刺液，用9 mL间充质干细胞（MSC）生长培养基稀释后，接种于10 cm组织培养皿中。将培养物置于细胞培养箱中（37 °C，5% CO2）维持培养。
- 培养2天后移除培养基，用10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻冲洗培养物三次，以去除非贴壁细胞。最后一次冲洗后，吸除PBS，并加入10 mL MSC生长培养基。PBS冲洗后，每隔3天更换一次生长培养基。
注意：间充质干细胞克隆通常在第6–7天可见，克隆数量因供体而异。 - 在第10天进行细胞传代，操作如步骤1.2.2所述。用PBS适当稀释后，使用血细胞计数板对沉淀中的细胞进行定量。将传代后的细胞以40,000个细胞/cm2的密度接种至含MSC生长培养基的10 cm培养皿中。
注意：人源MSCs（图2D）形态学特征与大鼠MSCs相似，传代后通常在2天内达到80–90%汇合度。应通过免疫细胞化学方法对其进行表征，并检测其三系分化潜能12。与大鼠MSCs相同，处于第3至第8代的人源MSCs可用于后续的低氧预处理及神经前体细胞富集实验。
3. 缺氧预处理
- 拆卸缺氧培养室的组件（即， 底座、盖子、托盘）在松开环形夹后，用70%乙醇擦拭各部件至清洁。将培养室组件置于超净台内的层流组织培养罩中，经紫外灯照射15分钟进行灭菌。
- 在缺氧预处理之前，移除培养基，用 10 mL PBS 清洗大鼠和人源间充质干细胞培养物（第 1 和第 2 部分）。弃去 PBS，加入 10 mL 添加了 25 mM HEPES 的间充质干细胞生长培养基。
注意：用于低氧预处理的MSCs应在10 cm培养皿中培养至80-90%融合度。 - 将培养皿放入低氧培养箱中。重新组装培养箱组件并拧紧环形夹。通入99% N₂21% O2 以10 L/min的流速向腔室内通入5分钟。
- 密封缺氧室的连接端口，确保无气体泄漏。将该室置于细胞培养箱内（37 °C，5% CO₂）。216 小时
- 低氧预处理结束后，将培养物从培养舱中取出，准备进行后续的神经前体细胞富集培养。
4. 神经前体细胞富集培养
- 准备神经前体细胞培养基，包含补充有B27（2% v/v）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，20 ng/mL）、表皮生长因子（EGF，20 ng/mL）和青霉素-链霉素（P/S，1% v/v）的DMEM/F12培养基（Dulbecco改良Eagle培养基/Ham's F12营养混合物）。
- 按照步骤1.2.2所述方法消化低氧预处理的大鼠/人源MSCs，通过250 × g离心5分钟收集细胞。用PBS适当稀释后，使用血细胞计数板对沉淀中的细胞进行定量。
- 将细胞重悬于神经前体细胞培养基中，以6,000个细胞/cm2的密度接种至低黏附性6孔板中。将培养物置于细胞培养箱（37 °C，5% CO2）中培养12天，每3天更换75%的神经前体细胞培养基。
注意：第6至7天可见明显的非黏附性细胞簇；第10至12天可观察到直径≥100 µm的神经球（图4）。与常氧条件下培养的MSCs相比，低氧预处理的MSCs应能形成更多的神经球9。 - 第12天用10 mL移液器吸取收集神经球，并转移至15 mL圆锥形离心管中，于250 × g离心5分钟。
注意：可在第12天对神经球进行神经前体细胞标志物（如nestin和GFAP）的鉴定7。
5. 通过与背根神经节神经元共培养生成命运限定的施万细胞
- 纯化大鼠DRG神经元的制备
- 高压灭菌所有解剖工具（即， 解剖剪、镊子、两把显微解剖镊和显微解剖剪）在使用前于180 °C下灭菌至少2小时。
- 在4 °C下用多聚-D-赖氨酸（PDL，10 µg/mL溶于PBS）包被6孔组织培养板过夜。移除PDL溶液，每孔加入1.5 mL PBS洗涤。
- 在37 °C下用层粘连蛋白（10 µg/mL溶于PBS）包被培养板，持续2 h。每孔加入1.5 mL PBS冲洗培养板。
- 制备背根神经节（DRG）神经元维持培养基，该培养基由添加了B27（2% v/v）、L-谷氨酰胺（1% v/v）、神经生长因子（NGF，20 ng/mL）和青霉素-链霉素溶液（P/S，1% v/v）的Neurobasal培养基组成。
- 制备DRG神经元纯化培养基，其成分为添加了B27（2% v/v）、L-谷氨酰胺（1%）、NGF（20 ng/mL）、青霉素-链霉素（P/S，1%）、氟脱氧尿苷（FDU，10 µg/mL）和尿苷（10 µg/mL）的Neurobasal培养基。
- 在妊娠第14至15天通过过量戊巴比妥钠（240 mg/kg体重，腹腔注射）处死孕鼠。
- 将处死后的动物置于仰卧位，用70%乙醇彻底清洁其腹部。
- 使用精细解剖剪和镊子沿动物腹部下侧纵向剪开腹壁。辨认子宫并用解剖剪将其取出。切开子宫壁，暴露并取出胚胎。将胚胎转移至盛有PBS的无菌10 cm培养皿中。将培养皿置于冰上。
- 将拟进行解剖的胚胎转移至含有磷酸盐缓冲液（PBS，室温）的无菌10 cm培养皿中，并置于解剖显微镜下。使胚胎呈俯卧位。
注意：通过胚胎半透明的皮肤，可在其背侧观察到呈白色的脊髓及附着的背根神经节。 - 沿脊髓两侧插入显微解剖镊，使用钝性分离法开始将脊髓与周围软组织分离。用显微解剖镊在颈部切口和尾部残端处将脊髓从动物体内剪下。在脊髓腹侧进一步进行钝性分离，以彻底清除周围软组织。
- 使用显微解剖镊去除游离脊髓背侧残留的软组织。
注意：此时仅应保留脊髓、神经根及附着的背根神经节（DRG）。 - 使用显微解剖镊将单个背根神经节从其连接的神经根上分离。用连接1 mL吸头的移液器将背根神经节转移至含有PBS的1.5 mL无菌离心管中。
注意：每个1.5 mL离心管最多可容纳100个背根神经节。 - 将DRG在250 × g离心5分钟，并用重组酶消化细胞解离试剂重悬（每管200 µL）。于37 °C、5% CO₂条件下孵育2) 10分钟。将背根神经节在250 × g离心5分钟，弃去上清液，并重悬于背根神经节神经元维持培养基中。使用200 µL移液枪头轻轻吹打重悬沉淀以进行解离。适当稀释后，使用血细胞计数板对沉淀中的细胞进行计数。
- 以每平方厘米5,000个细胞的密度接种细胞2 接种于经PDL/层粘连蛋白包被的6孔板中，每孔加入1.5 mL背根神经节神经元维持培养基。培养两天后，移除背根神经节神经元维持培养基，用PBS洗涤，更换为背根神经节神经元纯化培养基。
注意：每个纯化周期中，先用纯化培养基处理背根神经节（DRG）培养物2天，随后在维持培养基中孵育1天。经过3–4个纯化周期后，可预期完全去除内源性胶质细胞。7。这大约需要14天。纯化后的细胞培养物对神经元标志物TUJ1呈阳性，且不表达S100β（图5).
- 施万细胞样细胞的制备
- 配制胶质细胞诱导培养基，包含添加了β-神经调节蛋白（100 ng/mL）、bFGF（10 ng/mL）、血小板源性生长因子（PDGF-AA，5 ng/mL）、胎牛血清（FBS，10%）和青霉素-链霉素溶液（P/S，1% v/v）的αMEM培养基。
- 将第4节制备的神经球接种于多聚赖氨酸/层粘连蛋白包被的6孔板中，密度为每平方厘米5–10个神经球2 每孔加入1.5 mL胶质细胞诱导培养基。用PBS洗涤细胞后，每2天更换一次胶质细胞诱导培养基。
注意：接种后的神经球细胞在第2天可见向外迁移。到第7天时，迁移细胞呈锥形，且应表现出对施万细胞标志物p75神经营养因子受体（p75）和S100β的免疫阳性。7这些细胞被称为小细胞肺癌（SCLC）。
- 小细胞肺癌细胞与背根神经节神经元的共培养
- 配制共培养基，将背根神经节神经元维持培养基（步骤5.1.4）与胶质细胞诱导培养基（步骤5.2.1）按1:1的体积比混合。
- 制备含 DMEM/F12 培养基的雪旺细胞维持培养基，添加 FBS（5%）、β-Heregulin（10 ng/mL）和 P/S（1% v/v）。
- 从第7天的SCLC细胞中移除培养基，用PBS洗涤一次，随后加入0.5 mL/孔的重组酶消化细胞解离试剂，在37 °C孵育5 min。用共培养基重悬SCLC细胞。
- 使用血细胞计数板在适当稀释后对细胞进行计数。
- 将SCLC细胞以每平方厘米1,000个细胞的密度接种至纯化的DRG神经元培养物中2共培养14天，每2天更换一次培养基。
注意：在共培养过程中，SCLCs 获得了成熟施万细胞典型的纺锤形形态（图6。这些细胞在撤除生长因子后仍能保持其表型，并具有髓鞘化轴突的能力 体外 和 体内7,10. 雪旺细胞标志物的阳性率（即， p75 和 S100β 应通过免疫荧光进行检测。 - 共培养结束后，按步骤1.2.2所述传代命运已决定的施万细胞。每孔使用0.5 mL解离试剂。适当稀释后，使用血细胞计数板对细胞进行计数。
- 将命运已定的施万细胞重悬于施万细胞维持培养基中，密度为10,000个细胞/cm²2将种子细胞接种至经PDL/层粘连蛋白包被的6孔板中，用于免疫荧光实验。
注意：共培养体系中不可避免地含有已转化为成纤维细胞命运的MSCs7这些细胞在共培养结束后与命运已定的施万细胞一同传代。位于成纤维细胞基质上方的施万细胞，经冲洗后可轻松脱离并进一步扩增 "冷射流" PBS（4 °C）冲洗，具体步骤参见其他文献13命运决定的施万细胞可在维持培养基中扩增1个月。
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结果
本方案中关键步骤的概述见图1。简言之，通过贴壁法筛选大鼠和人源间充质干细胞（MSCs）。扩增后的MSCs经低氧预处理，随后置于神经球形成条件下培养。将形成的神经球接种并诱导其分化为脊髓样细胞（SCLCs）。SCLCs与纯化的背根神经节（DRG）神经元共培养，以获得命运特化的施万细胞。
培养的大鼠和人源MSC的形态如图2所示。健康的MSC呈锥形形态，与高传代后失去多向分化潜能的MSC所呈现的四边形外观形成对比。扩增后的大鼠和人源MSC克隆应表达MSC标志物，不表达造血干细胞标志物，并具备三系分化能力（图3）。选取第3至第8代之间健康的MSC进行16小时的低氧预处理，随后将其传代至低黏附性培养板中，并添加EGF/bFGF。低氧预处理可导致神经球数量增多，且平均神经球尺寸更大（
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讨论
在通过低氧预处理和神经球培养富集神经前体细胞之前，必须保持间充质干细胞（MSCs）的"干性"。根据我们的经验，多能性MSCs可通过其细长的成纤维细胞样形态可靠地识别。相比之下，那些呈现更扁平、四边形形态并具有明显细胞骨架应力纤维的MSCs难以向神经细胞命运转化，应予以弃用。通常情况下，我们不使用传代次数超过八代的MSCs。为维持其干性，必须在细胞达到100%融合度之前及时传代。相反，将MSCs维持在过低的融合度也不理想。根据我们的经验，以40,000个细胞/cm2的密度接种细胞，或简单地以1:2比例传代融合度达80%的细胞，可获得最佳效果。
背根神经节（DRG）网络的正确建立和维持是共培养成功的关键因素。背根神经节的取材时间应尽可能缩短。在操作单个神经节时应避免造成损伤，尤其是在从脊髓上分离时，最好仅操作神经根。通常情况下，我们力求在动物处死后至收获的DRG开始酶消化之间的时间不超过2小时，因为过长的取材时间会导致组织糜烂并降低细胞活力。在培养过程中，DRG神经元从基质上脱落的情况时有发生。为防止此类情况发生，包被步骤应使用新鲜配制的试剂，并尽...
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披露
本文所有作者均无任何利益冲突需要声明。
致谢
作者谨此感谢黄乃森博士提供缺氧培养箱设备，以及吕爱慈女士提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| αMEM | Sigmaaldrich | M4526 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher scientific | 12400-024 | |
| Neurobasal 培养基 | Thermofisher scientific | 21103-049 | |
| FBS | Biosera | FB-1280/500 | |
| B27 | Thermofisher scientific | 17504-001 | |
| 表皮生长因子（EGF） | Thermofisher scientific | PHG0313 | |
| 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF） | Peprotech | 100-18B/100UG | |
| 神经生长因子（NGF） | Millipore | NC011 | |
| 血小板源性生长因子-AA（PDGF-AA） | Peprotech | 100-13A | |
| Heregulin beta-3，EGF 结构域（β-Her） | Millipore | 01-201 | |
| 尿苷 | Sigmaaldrich | U3003 | |
| 5-氟-2'-脱氧尿苷（FDU） | Sigmaaldrich | F0503 | |
| 多聚-D-赖氨酸（PDL） | Sigmaaldrich | P7886-1G | |
| 层粘连蛋白 | Thermofisher scientific | 23017015 | |
| GlutaMAX | Thermofisher scientific | 35050061 | |
| 青霉素/链霉素（P/S） | Thermofisher Scientific | 15140-122 | |
| TrypLE Express | Thermofisher Scientific | 12604-013 | |
| 10 cm 贴壁培养板 | TPP | 93100 | 用于通过组织培养贴壁法筛选间充质干细胞（MSCs） |
| 6 孔贴壁培养板 | TPP | 92006 | 用于传代后间充质干细胞（MSCs）的扩增 |
| 超低吸附 6 孔非贴壁培养板 | Corning | 3471 | 用于神经前体细胞富集 |
| 抗人 CD90（Thy-1） | BD Biosciences | 555593 | |
| 抗人 CD73 | BD Biosciences | 550256 | |
| 抗人/大鼠 STRO-1 | R&D Systems | MAB1038 | |
| 抗人 nestin | R&D Systems | MAB1259 | |
| 抗人 CD45 | BD Biosciences | 555480 | |
| 抗大鼠 CD90（Thy-1） | BD Biosciences | 554895 | |
| 抗大鼠 CD73 | BD Biosciences | 551123 | |
| 抗大鼠 nestin | BD Biosciences | MAB1259 | |
| 抗大鼠 CD45 | BD Biosciences | 554875 | |
| 抗 S100β | Dako | Z031101 | |
| 抗 p75 | Millipore | MAB5386 | |
| 抗 GFAP | Sigmaaldrich | G3893 | |
| 抗 III 类 β-微管蛋白（Tuj-1） | Covance | MMS-435P | |
| 抗人细胞核抗原 | Millipore | MAB1281 | |
| 缺氧培养箱 | Billups-Rothenberg | MIC-101 | |
| HEPES 缓冲液 | Sigmaaldrich | H4034-100G |
参考文献
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重印与许可
