使用靶向 Ca2+ 传感器 CatchER+ 监测内质网/肌浆网钙释放

摘要

我们介绍了靶向基因编码钙离子指示剂（GECI）CatchER 的应用方案⁺ 用于通过实时荧光显微镜监测 HEK293 细胞和骨骼肌 C2C12 细胞内质网/肌浆网（ER/SR）中快速钙瞬变的方案。一种用于 原位 K_d 还讨论了测量与校准。

摘要

细胞外刺激引发的细胞内钙离子（Ca²⁺）瞬变在生物体内启动多种生物学过程。细胞内钙释放的核心是主要的细胞内钙储存细胞器，即内质网（ER）以及在肌细胞中更为特化的肌浆网（SR）。钙离子从这些细胞器中的动态释放由兰诺定受体（RyR）和肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP₃R）介导，而钙的再填充则通过肌浆网/内质网钙离子ATP酶（SERCA）泵完成。为了监测ER/SR中快速的钙释放，研究人员开发了一种名为CatchER的基因编码钙传感器（GECI）。本文详细描述了在HEK293和C2C12细胞中转染并表达经过优化、靶向ER/SR的GECI CatchER⁺的操作步骤，并介绍了利用荧光显微镜在HEK293细胞中监测IP₃R、RyR和SERCA泵介导的钙瞬变的应用方法。所选的受体激动剂或抑制剂被加入灌流液中，荧光强度变化被实时记录。通过该方法可观察到，RyR被4-氯-间甲酚（4-cmc）激活、IP₃R被三磷酸腺苷（ATP）间接激活以及SERCA泵被环匹阿酸（CPA）抑制时，ER内的钙水平均出现下降。我们还讨论了在C2C12细胞中测定in situ K_d值以及定量基础[Ca²⁺]的方法。总之，这些方法结合CatchER⁺的使用，可用于诱导受体介导的ER钙释放，未来可应用于研究与ER/SR钙相关的病理机制。

引言

细胞内钙离子（Ca²⁺）瞬变具有时空特性，可激活多种生物学功能¹。这些Ca²⁺信号事件由细胞外的不同刺激触发，并在细胞内由主要的Ca²⁺储存细胞器以及多种Ca²⁺泵、通道和Ca²⁺结合蛋白进行调控。由于信号调节异常，Ca²⁺瞬变可能发生显著改变，从而导致多种疾病²。鉴于Ca²⁺信号系统的快速性和复杂性，且以内质网（ER）和肌浆网（SR）为核心，需要使用已针对哺乳动物表达优化、具有快速动力学特性的基因编码Ca²⁺探针，以观察不同细胞中的全局性和局部性Ca²⁺变化³。

内质网（ER）及其在肌细胞中的对应结构——肌浆网（SR），是细胞内主要的钙离子储存细胞器。²⁺ 储存细胞器并充当 Ca²⁺ 有助于放大 Ca 的信号接收区²⁺ 信号⁴内质网/肌浆网（ER/SR）是钙信号传导中的一个关键组成部分²⁺ 兼具信号传递与接收双重功能的信号传导⁵. 兰诺碱受体（RyR）和肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP₃R) 是 Ca²⁺ 位于内质网/肌浆网膜上的钙调释放受体^{2+ 6}其他试剂可直接或间接刺激这些受体的功能。4-氯-间甲酚（4-cmc）是兰尼碱受体（RyR）的强效激动剂，其诱导肌浆网钙释放的敏感性比咖啡因高10倍。²⁺ 释放，两者均常用于研究由RyR介导的Ca²⁺ 健康与病变细胞中的释放⁷ATP 增加 IP₃介导的 Ca²⁺ 通过IP释放₃R⁸ATP 结合到嘌呤能受体 P2YR（一种 G 蛋白偶联受体，GPCR），触发 IP 的生成₃ 与IP结合₃R 释放 Ca²⁺ 从内质网^9,10肌浆网/内质网钙离子ATP酶（SERCA）泵是一种P型ATP酶泵，同样位于内质网/肌浆网膜上，可降低胞质中的Ca²⁺浓度²⁺ 并通过主动将离子泵入内质网/肌浆网腔内，使内质网/肌浆网重新充盈¹¹SERCA泵的特异性抑制剂包括毒胡萝卜素（thapsigargin），来源于 Thapsia garganica，以及环匹阿尼酸（CPA） 曲霉属 和 PenicilliumCPA 对泵的亲和力较低，并可逆地阻断 Ca²⁺ 接入点¹². 而毒胡萝卜素（thapsigargin）则不可逆地结合到Ca²⁺ M3 螺旋中 F256 残基处具有纳摩尔亲和力的游离泵¹¹分析并量化Ca相关的变化²⁺ 刺激事件一直是并仍然是一个挑战。由于内质网/肌浆网（ER/SR）是细胞内主要的钙库²⁺ 具有中心功能的区室，参与Ca²⁺信号的传导²⁺ 信号，大量研究工作集中在理解内质网/肌浆网钙离子²⁺ 信号转导⁵.

合成Ca²⁺染料的开发推动了Ca²⁺成像领域的发展与实践。尽管诸如Mag-Fura-2等染料已被广泛用于测量不同细胞中的区室化Ca^2+13,14,15，但其存在染料加载不均、光漂白以及无法靶向特定细胞器等局限性。绿色荧光蛋白（GFP）的发现以及基于荧光蛋白的Ca²⁺探针的发展进一步推动了Ca²⁺成像领域的进步¹⁶。目前已有的一些基因编码钙指示剂（GECI）是基于福斯特共振能量转移（FRET）的配对系统，包含黄色荧光蛋白（YFP）、青色荧光蛋白（CFP）、钙调蛋白及M13结合肽^17,18。基于肌钙蛋白C的GECI也已开发成功，可作为CFP与Citrine的FRET配对，也可作为单荧光团探针使用^19,20,21 。其他如GCaMP2和R-GECO则是基于钙调蛋白的单荧光团传感器^22,23。为了克服传统Ca²⁺结合域中多个Ca²⁺结合位点所导致的K_d调节范围窄及协同结合等局限性²⁴，研究人员通过在增强型绿色荧光蛋白（EGFP）发色团敏感位置的β桶状结构表面设计新的Ca²⁺结合位点，开发出一类新型钙传感器^25,26。这一备受关注的传感器称为CatchER，其K_d约为0.18 mM，k_on接近扩散极限，k_off为700 s^-1。CatchER已被用于监测HeLa、HEK293和C2C12等多种哺乳动物细胞系中受体介导的内质网/肌浆网（ER/SR）钙释放²⁵。由于其快速的动力学特性，CatchER被应用于年轻和老年Friend Virus B NIH Jackson（FVB）小鼠的趾短屈肌（FDB）肌纤维，研究发现，在去极化2秒后，老年小鼠FDB肌纤维中残留于肌浆网（SR）的Ca²⁺多于年轻小鼠²⁷。为克服其在37 °C时荧光信号较弱而限制其在哺乳动物细胞钙成像中应用的问题，我们开发了CatchER的改进版本——CatchER⁺。CatchER⁺在37 °C下表现出更强的荧光，更适用于哺乳动物细胞。通过在CatchER中引入额外的突变，进一步提升了其在37 °C下的热稳定性和荧光强度^28,29，从而获得CatchER⁺。CatchER⁺的信噪比（SNR）较CatchER提高了六倍³⁰。

此处为使用CatchER对HEK293和C2C12细胞进行培养和转染的实验方案⁺ 及其在监测内质网/肌质网受体介导的钙瞬变中的应用。展示了CatchER的代表性实验结果。⁺ 在经4-CMC、CPA和ATP处理的HEK293细胞中表达。我们还提供了一种测定的方案 原位 K_d 捕获剂⁺ 在C2C12成肌细胞中检测基础[Ca²⁺].

方案

1. 载玻片制备

1. 将 22 mm × 40 mm 的玻璃载玻片放入 6 cm 的细胞培养皿中，每皿放置一片。
2. 在无菌操作台中，将每片载玻片的两面以及 6 cm 培养皿整体暴露于紫外（UV）光下照射 15–20 分钟，以进行消毒灭菌。
3. 用封口膜覆盖装有载玻片的培养皿，并于 4 °C 保存，直至使用前。

2. 培养基、缓冲液、溶液和试剂的制备

1. 配制1 L Hank's平衡盐溶液（HBSS），溶于去离子水中，并加入10 mM HEPES、5 mM NaHCO₃₃，以及1 mM EGTA。用NaOH调节pH至7.2–7.3。使用0.22 µm滤器过滤缓冲液，收集至已灭菌的瓶中。
2. 在去离子水中配制900 mL高糖型Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）。加入44 mM NaHCO₃₃ 用 HCl 调节 pH 至 7.2–7.3。使用 0.22 µm 滤器过滤培养基至已灭菌的瓶中。向培养基中加入 100 mL 胎牛血清（FBS），使 FBS 终浓度为 10%。4 °C 保存。
3. 配制1 L细胞内液缓冲液（125 mM KCl，25 mM NaCl，10 mM HEPES，0.2 mM CaCl₂）₂，0.5 mM EGTA，0.2 mM MgCl₂) 于去离子水中，并调节 pH 至 7.25。最终 [Ca²⁺] 的浓度约为 100 nM。使用前添加 0.5 mM ATP。室温保存。
4. 配制 1 L 林格氏缓冲液（121 mM NaCl，2.4 mM KCl，1.3 mM CaCl₂，0.5 mM MgCl₂，10 mM 葡萄糖，10 mM HEPES，pH 7.4）₂HPO₄，0.4 mM KH₂PO₄，10 mM HEPES，和 1.2 mM MgCl₂) 于去离子水中，调节 pH 至 7.2。室温保存。使用时，取 50 mL 分装至 50 mL 离心管中，并加入 1.8 mM Ca²⁺ 和 10 mM 葡萄糖。
5. 配制 1 L KCl 冲洗液（125 mM KCl，25 mM NaCl，10 mM HEPES，0.2 mM MgCl₂）₂) 于去离子水中溶解，并调节 pH 至 7.25。
6. 将5 mg离子霉素溶解于1 mL二甲基亚砜（DMSO）中。分装30 µL至微量离心管中，于-20 °C保存。
7. 通过将环匹阿酸（CPA）溶解于DMSO中制备CPA储备液。确保加入细胞的CPA溶液中DMSO终浓度≤1%，以防止细胞凋亡。通过将4-氯-间甲酚（4-cmc）溶解于过滤后的H₂O中制备20 mM的4-cmc溶液。₂O，并在37 °C下振荡过夜使其溶解。通过将ATP溶解于过滤的H₂0 到 100 mM
8. 确定 原位 K_d，分别准备 15 mL 的 1 mM EGTA 以及 0.2 mM、0.6 mM、2 mM、5 mM、10 mM、20 mM、50 mM 和 100 mM Ca²⁺ 在KCl缓冲液中，使用100 mM EGTA储备液和1 M CaCl₂₂ 溶于去离子水的储存液。

3. 细胞培养

1. 按照 ATCC 提供的各自培养方案，在无菌超净工作台中使用 10 cm 细胞培养皿培养 C2C12 成肌细胞和 HEK293 细胞。
   注意：C2C12 细胞的融合度不应超过约 70%，因为成肌细胞在此之后会开始分化为肌管。HEK293 和 C2C12 细胞均易于生长，为保持细胞完整性，不应让其生长至 100% 以上的融合度。此外，为维持细胞健康，用于实验前细胞传代次数不应超过 10 代。

4. HEK293 细胞的转染

1. 将HEK293细胞接种于6 cm培养皿中的无菌22 mm × 40 mm玻璃载玻片上，使细胞在转染当天达到约70%融合度。
2. 次日，按照转染试剂生产商的说明书，使用2 µg CatchER⁺ cDNA和1:3（质量/体积）的DNA:转染试剂比例，在低血清培养基（例如 Opti-MEM）中进行细胞转染。
3. 吸去培养皿中的DMEM培养基，加入3 mL低血清培养基。将DNA:转染试剂混合物加入培养皿中，在37 °C孵育4–6小时。
4. 孵育结束后，用5–6 mL HBSS洗涤细胞。弃去HBSS，更换为3 mL新鲜DMEM，于37 °C继续孵育48小时，以允许GECI表达。
5. C2C12成肌细胞的转染
   1. 对于C2C12成肌细胞，加入足量胰蛋白酶覆盖培养皿底部（1–2 mL）进行消化。将培养皿置于37 °C培养箱中孵育2–6分钟，使胰蛋白酶松动细胞与皿底的贴附。
   2. 孵育完成后，吸去胰蛋白酶，并用8 mL DMEM重悬细胞。用移液器充分吹打细胞，使其均匀分散并重新悬浮，然后接种至含有3 mL DMEM的6 cm细胞培养皿中的无菌盖玻片上，使最终融合度为60%。
   3. 于同日按照步骤4.2–4.3所述方法进行细胞转染。在37 °C孵育24小时。
   4. 重复步骤4.4。

5. 载玻片的制备与荧光显微镜观察

1. 打开显微镜和光源，然后启动 Simple PCI 程序。让显微镜预热 15–20 分钟，或直至电荷耦合器件（CCD）相机冷却至 -65 °C。在此期间，准备含有细胞的灌流腔室和载玻片。
2. 使用棉签在低剖面开放式钻石浴成像腔室的底部涂上一层薄薄的密封剂。
3. 从培养箱中取出转染细胞的载玻片，用预热至 37 °C 的含 10 mM 葡萄糖和 1.8 mM Ca²⁺ 的 Ringer 缓冲液轻轻冲洗三次，每次 1 mL。
4. 在培养皿中保留 1 mL Ringer 缓冲液以防止细胞干燥，用镊子将载玻片从培养皿中取出。通过将载玻片边缘轻触实验室用纸巾，吸去多余的液体。然后将载玻片放入已涂有封固剂的腔室侧面，细胞面朝上对准封固剂，并用螺丝刀将腔室固定在显微镜载物台上。
5. 向腔室中加入 1 mL Ringer 缓冲液，以防止在将腔室安装到载物台及完成其余显微镜设置过程中细胞干燥。一旦真空吸管连接到腔室，腔室的最终持液体积约为 450 µL。
6. 将显微镜物镜切换至 40X 油镜。
7. 使用镜头纸和镜头清洁液清洁并擦干物镜。切勿用力擦拭物镜，应轻轻蘸拭直至表面洁净。
8. 在物镜上滴加一滴浸油。
9. 将载物装置放置于显微镜载物台上，并将真空吸头连接至腔室。一旦真空吸管连接并开启，腔室的最终持液体积约为 450 µL。此最终液面应与腔室侧壁齐平。实验过程中必须确保腔室液面水平，以避免因过度填充导致液体流入物镜。
10. 升高物镜，使用粗调旋钮，直至物镜上的浸油接触载玻片底部。
11. 使用明场模式，将增益调节至 175，曝光时间调节至 0.03 秒，以对细胞进行聚焦。
12. 细胞聚焦后，切换至荧光模式，使用 488 nm 激发光。将曝光时间调整为 0.07 秒。选择一个视野，其中包含足够数量、状态良好且荧光信号充足的细胞用于成像。
13. 选定视野后，分别在荧光和明场模式下拍摄图像。
14. 在细胞内圈定一个感兴趣区域（ROI），或圈选整个细胞，以记录所选区域的荧光强度。

6. 成像药物诱导的 Ca²⁺ 瞬变及原位 K_d 校准

1. 将帧率设置为每5秒一帧，开始进行强度测量。
2. 让基线强度稳定20-30帧（100-150秒）。如有需要，可在该步骤中降低每秒帧数，以防止光漂白。
3. 根据约450 µL的最终腔室体积，从20 mM的储备液中计算出配制200 µM终浓度所需的4-cmc用量。根据需要对储备液进行稀释。
4. 小心从腔室中取出60 µL林格氏液，置于微量离心管中。将计算量的4-cmc用此溶液稀释后，再加回腔室，以诱发成像细胞的预期反应。
5. 将计算量的4-cmc加入微量离心管中，并用移液器吹打混匀。
6. 在视野上方轻轻加入该溶液，同时在强度测量中添加事件标记。
7. 给予足够时间使药物与受体结合并引发信号下降，随后用含1.8 mM Ca²⁺和10 mM葡萄糖的3-6 mL林格氏液冲洗，同时添加事件标记。由于腔室体积为450 µL且连接真空系统，加入3-6 mL缓冲液可确保含药物的原溶液被完全洗去，并被新加入的溶液替代。
8. 对100 µM ATP和15 µM CPA重复步骤6.1-6.7，每次实验使用新的转染细胞载玻片。
9. 测量完成后，在Simple PCI程序的强度测量窗口中结束数据采集。
10. 拍摄细胞的荧光和明场图像。
11. 打开该实验的数据文件。如有需要，可重新圈定细胞或感兴趣区域，以重新计算强度值。
12. 为测定C2C12成肌细胞中in situ的K_d值，请按照第4.2节和第5节所述方案操作，并在腔室中加入1 mL含0 mM Ca²⁺的林格氏液。
    1. 用含0.002-0.005%皂苷的细胞内缓冲液对细胞进行15-30秒的透化处理，以清除细胞质中可能存在的CatchER⁺。用含10 µM离子霉素的3-6 mL KCl缓冲液（含1 mL EGTA）洗涤细胞。待荧光强度下降至平台期。
    2. 用含10 µM离子霉素的3-6 mL KCl缓冲液冲洗，并让荧光强度稳定，然后依次加入步骤2.7中所述的各Ca²⁺溶液。每次加样后均需等待荧光强度达到平台期。
13. 为校准传感器以定量基础[Ca²⁺]，请执行步骤6.12。使用步骤2.7中的EGTA和100 mM Ca²⁺缓冲液，获取最小和最大荧光强度。

7. 数据处理

1. 下载强度测量数据的电子表格文件。
2. 将每个细胞的数据归一化至基线强度（F/F₀）₀）。在任意绘图程序中，将归一化数据对时间作图。
3. 计算%变化时，用1减去归一化的峰值，再乘以100。若对多个细胞进行了成像，需计算平均值和标准差。
4. 为计算信噪比（SNR），在图像处理软件（如 ImageJ）中打开实验保存的图像文件，然后测量信号（转染细胞）和噪声（背景）。使用公式 SNR = 信号/噪声 计算信噪比。
5. 为了计算 原位 K_d 从采集的荧光成像数据中，对每次添加 Ca 后的平台期强度数据进行平均。²⁺ 浓度和 EGTA（0 mM Ca）²⁺）。使用 θ = (F – F_分钟)/(F_最大值- F_分钟），其中 θ 为相对强度，F 为任意点的荧光值，F_分钟 为最小荧光强度，且 F_最大值 是最大荧光强度，用于观察随着Ca²⁺的加入探针荧光强度的变化²⁺ 与最小强度相比，将相对强度数据对[Ca²⁺] 在任何绘图和曲线拟合程序中。使用 1:1 结合方程 θ = [M_T]/(K_d + [M_T]) 可转换至任意作图与曲线拟合程序，用于计算 K_d. M_T 是金属的总浓度。
6. 为了根据6.13节中所述校准方法定量基础钙水平，在加入1 mM EGTA后，对包含平台期的强度数据取平均值（F_分钟）和 100 mM Ca²⁺ （F_最大）。使用校准方程 [Ca²⁺] = K_d（[F – F_分钟)/(F_最大 – F)] 来计算基础钙水平。

结果

本部分将展示使用先前所述方法及优化后的靶向内质网/肌浆网的GECI CatchER⁺，通过不同受体介导途径监测内质网/肌浆网Ca²⁺变化所获得的结果。

图1展示了使用200 µM 4-cmc刺激兰尼碱受体（RyR）后内质网（ER）的钙释放过程。4-cmc是RyR的激动剂。加入该药物后，通过CatchER⁺荧光强度的降低可检测到内质网钙离子浓度的下降。如图所示，本方案通过CatchER⁺实现对受体介导的Ca²⁺瞬变的可视化与定量检测，从而提供有关内质网Ca²⁺动态变化的信息。

如图2所示...

讨论

对活体单细胞中荧光探针（如 CatchER⁺）进行成像，是一种有效分析每个细胞在受体激动剂或拮抗剂刺激下内质网/肌浆网（ER/SR）Ca²⁺ 信号转导复杂过程的技术。该技术还可用于多波长同步成像，例如同时使用 Fura-2，或共表达 CatchER⁺ 与 Rhod-2，分别监测内质网和胞质钙离子浓度的变化。本实验方案中有多个关键步骤：细胞转染对成像细胞的存活率具有显著影响。转染效率过低会导致基因编码钙指示剂（GECI）表达不足，从而无法有效监测钙响应。另一方面，CatchER⁺ 的过表达不会对内质网/肌浆网（ER/SR）中的 Ca²⁺ 产生缓冲效应，而这是传统合成钙染料所面临的问题。Ca²⁺ 探针的缓冲效应受细胞器内 [Ca²⁺] 浓度、探针的解离常数（K_d）以及检测所需探针浓度的影响。胞质 [Ca²⁺] 通常处于低纳摩尔范围，而所需探针浓度与此相近，因此染料浓度及其对胞质钙离子的缓冲能力一直是细胞成像中的主要关注点。相比之下，我们此前在多种...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4-氯-3-甲基苯酚（4-CmC）	Sigma-Aldrich	C55402
515DCXR 二向色镜	Chroma Technology Corp.	NC338059
腺苷5′三磷酸二钠盐水合物	Sigma-Aldrich	A26209
二水合氯化钙	EMD Millipore	102382
康宁组织培养处理培养皿（100 mm）	Sigma-Aldrich	CLS430167
康宁公司组织培养处理培养皿（60 mm）	Sigma-Aldrich	CLS430166
环匹阿酸（CPA）	EMD Millipore	239805
D(+)-葡萄糖	ACROS Organics	41095-0010
道康宁 111 号阀门润滑剂 && 密封剂	Warner Instruments	64-0275
杜尔贝科’改良型伊格尔培养基’s 小量（DMEM）	Sigma-Aldrich	D7777
乙二醇双(氧乙基亚硝基) 四乙酸（EGTA）	ACROS Organics	409911000
胎牛血清（FBS）	ThermoFisher	26140087
Fisherbrand 盖玻片 22x40 mm	Fisher Scientific	12-544B
Hanks’ 平衡盐溶液（HBSS）	Sigma-Aldrich	H4891
HEPES，游离酸，分子生物学级	EMD Millipore	391340
无自发荧光浸油	Leica	11513859
离子霉素，游离酸	Fisher Scientific	50-230-5804
徕卡 DM6100B 倒置显微镜配备冷却式 EM-CCD 相机	滨松	C9100-13
Lipofectamine 2000 转染试剂	ThermoFisher	11668019
Lipofectamine 3000 转染试剂	ThermoFisher	L3000015
低剖面开放式钻石浴成像室	Warner Instruments	RC-26GLP
六水合氯化镁	Fisher Scientific	M33-500
Opti-MEM	ThermoFisher	51985034
氯化钾	EMD Millipore	PX1405
磷酸氢二钾	EMD Millipore	PX1570
磷酸二氢钾	EMD Millipore	PX1565
皂苷	Sigma-Aldrich	47036
SimplePCI 图像分析软件	滨松	N/A
碳酸氢钠	Fisher Scientific	S233-3
氯化钠	Fisher Scientific	S271-500
Sterivex-GV 0.22 µm 滤光片	EMD Millipore	SVGVB1010
Till 多色 V 氙灯	Till Photonics	N/A
胰蛋白酶（2.5%），无酚红（10倍浓缩液）	ThermoFisher	15090046