血管内皮细胞严格调控白细胞的募集过程。白细胞渗出异常可导致人类炎症性疾病的发生。因此，寻找内皮细胞活化的新调控因子，对于开发更有效的炎症性疾病治疗策略至关重要。本文介绍了一种系统性的方法学，用于鉴定能够调节炎症过程中白细胞迁移的新型内皮调控因子。
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本文内容
摘要
摘要
内皮层通过调控多种不同功能，在维持机体稳态中起着至关重要的作用。内皮层对炎症反应的调控对于有效抵御有害刺激以及促进受损区域的修复至关重要。当内皮细胞暴露于炎症环境（例如革兰氏阴性菌细胞膜的外层成分脂多糖（LPS））时，会表达可溶性促炎细胞因子（如Ccl5、Cxcl1和Cxcl10），并触发循环白细胞的活化。此外，内皮细胞表面黏附分子E-selectin、VCAM-1和ICAM-1的表达，可介导活化白细胞与内皮层的相互作用和黏附，并最终促使白细胞迁移至炎症组织。在此情况下，必须对内皮功能进行严密调控，因为白细胞募集过程中过度或不足的活化均可能导致与炎症相关的疾病。由于许多此类疾病目前尚无有效治疗方法，因此亟需探索以血管内皮层为靶点的新型治疗策略。我们提出一系列综合性实验方法，可用于筛选能够调节白细胞功能的新型内皮调控因子。我们采用多种技术（包括实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）、蛋白质印迹（western-blot）、流式细胞术和细胞黏附实验），针对白细胞募集过程中涉及的特定表达靶点（如细胞因子、趋化因子和黏附分子），分析内皮细胞的活化状态。这些方法可用于评估炎症背景下的内皮功能，并适用于高通量筛选实验，以鉴定潜在的新型内皮炎症调控因子，为开发新的治疗策略提供重要依据。
引言
炎症是机体针对病原体的一种有益生物学反应，其主要目的是清除病原体并修复受损组织。在某些情况下，例如慢性感染或自身免疫性疾病中，炎症无法消退，反而出现异常反应，导致白细胞持续浸润，引发持久的免疫反应，从而造成组织损伤、纤维化、功能丧失，最终导致患者残疾，甚至在某些情况下死亡。这些被归类为炎症性疾病的疾病均涉及血管对白细胞渗出的调控1,2。
内皮细胞通过调控白细胞迁移在炎症反应的调节中发挥着基础性作用。当内皮层暴露于LPS等炎症介质时，静息状态的内皮细胞被激活并表达促炎性细胞因子（Cxcl10、Cxcl5、Cxcl1）， 等。）以及促进循环白细胞向感染部位募集的黏附分子（E-选择素、VCAM-1 和 ICAM-1）。被释放的细胞因子激活的白细胞随后通过相应的黏附分子配体与血管内皮层发生滚动和相互作用：PSGL-1 与选择素结合，α4β1 整合素与 VCAM-1 结合，αLβ2 整合素与 ICAM-1 结合。最终，白细胞穿越血管壁，向炎症病灶迁移。3.
内皮细胞在调控炎症反应中的关键作用已在基因改造小鼠中得到证实，这些小鼠仅在内皮细胞上表达脂多糖（LPS）受体——Toll样受体4（TLR4）。这类内皮细胞特异性表达TLR4的小鼠能够对LPS介导的....
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方案
1. 内皮细胞培养
- 组织培养处理板
- 在37 °C条件下，用2.5 mL凝胶溶液（经高压灭菌的0.1%凝胶溶于蒸馏水中）包被100 mm组织培养板，孵育30分钟；可根据所需孔板规格按比例调整体积。吸除凝胶溶液，并将培养板置于组织培养超净台中自然晾干。
- 组织培养条件
- 将MLEC-04细胞置于生化培养箱中培养（37 °C，95%湿度，5% CO2）。使用完全培养基——杜氏改良伊格尔培养基：营养混合物F-12（DMEM/F-12），添加10%胎牛血清（FBS）以及100单位/mL青霉素和100 µg/mL链霉素（P/S）进行细胞培养。
- 采用标准血球计数板法计数细胞，并将MLEC-04细胞以每10 mL完全培养基接种至经凝胶处理的100 mm培养板中，接种密度为2 - 11 × 104 个细胞/cm2。当细胞达到汇合状态时，按1:3比例传代。
注：通常在培养2至3天后达到汇合。 - 传代时，先用10 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤培养板，随后加入2 mL胰蛋白酶-EDTA溶液（0.25%胰蛋白酶，5 mM EDTA），于37 °C孵育3分钟。
- 加入10 mL完全培养基以终止胰蛋白酶-EDTA反应，并收集悬....
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结果
通过RT-qPCR评估LPS诱导的内皮细胞活化
将血清饥饿处理的 MLEC-04 细胞用 100 ng/mL LPS 刺激 6 小时，通过 RT-qPCR 检测内皮细胞基因表达，并将活化标志物的表达水平与静息状态进行比较。如图 1A所示，经 LPS 孵育的 MLEC-04 细胞诱导了在炎症反应过程中参与白细胞募集的特定黏附分子（E-选择素、VCAM-1 和 ICAM-1）的 mRNA 表达。PECAM-1 被用作内参对照，因其在此实验条件下表达无变化。图 1B展示了通过促炎细胞因子 Ccl5、Cxcl10 和 Cxcl1 的 mRNA 表达升高所反映的 LPS 诱导的内皮细胞活化。这些分子参与循环白细胞的活化过程，包括其向内皮层迁移以及随后向炎症部位的外渗。细胞因子 IL4 在此实验条件下作为内参对照使用。
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讨论
该内皮细胞实验方案描述了一种逐步技术，为探索参与调控炎症反应的新型机制奠定了基础。这些方法基于对脂多糖（LPS）刺激下内皮细胞活性的研究，评估炎症反应中白细胞募集的关键步骤，具体包括：内皮细胞释放细胞因子、内皮细胞黏附分子的表达以及白细胞与血管层的黏附。在确立内皮细胞相关参数后，该系统可用于筛选参与调控内皮细胞功能及炎症进程的新型化合物。这些具有调控作用的药物可能在制药领域具有重要应用前景。本系列实验方案的主要目标是建立一个基础框架，通过调整相应的血管活性参数，将此类研究拓展至不同类型的内皮细胞及不同的刺激条件。
通过该筛选选出的药物将成为设计针对炎症性疾病的新型治疗策略的有趣候选药物。一方面，促进内皮细胞反应并有助于白细胞募集的化合物将对免疫缺陷疾病具有良好的应用前景16,17；另一方面，内皮细胞抑制剂则有望成为治疗慢性炎症性疾病的优良疗法10。
由活化的内皮细.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由西班牙经济与竞争力部（MINECO）和卡洛斯三世健康研究所（ISCIII）资助（资助号 IERPY 1149/16，授予 A.L.；MPY 1410/09，授予 S. Hortelano）；以及由 MINECO 通过卫生研究基金（FIS）资助（资助号 PI11.0036 和 PI14.0055，授予 S. Hortelano）。S. Herranz 获得了 ISCIII 的 IERPY 1149/16 项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 明胶 | Sigma | G9391 | |
| DMEM-F12 | Lonza | BE12-719F | |
| 胎牛血清 | Sigma | A4503 | |
| 青霉素-链霉素 | Lonza | DE17-602E | |
| 胰蛋白酶 | Lonza | BE17-160E | |
| EDTA | Sigma | ED2SS | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| Trizol | Sigma | T9424 | RNA提取缓冲液 |
| 异丙醇 | Sigma | 33539 | |
| 无水乙醇 | Panreac | 1,310,861,612 | |
| 无RN酶纯H2O | Qiagen | 1017979 | 无RN酶 |
| 琼脂糖 | Pronadisa | 8020 | |
| 琼脂糖凝胶染色剂 | Invitrogen | s33102 | |
| SuperScript III 第一链合成试剂 | Invitrogen | 18080051 | RT-PCR试剂 |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385610 | qPCR荧光染料 |
| MicroAmp Fast Optical 96孔板 | Applied Biosystems | 4346906 | qPCR用板 |
| U型底96孔板 | Falcon | 353072 | |
| 流式管 | Falcon | 352054 | |
| TX100 | Panreac | 212314 | 非离子型表面活性剂 |
| Tris-HCl | Panreac | 1,319,401,211 | |
| 氯化钠 | Merck | 1,064,041,000 | |
| 焦磷酸钠 | Sigma | 221368 | |
| 氟化钠 | Sigma | S7920 | |
| 正钒酸钠 | sigma | 13721-39-6 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | sigma | P8340 | |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Pierce | 23225 | 双辛可宁酸法蛋白定量试剂 |
| β-巯基乙醇 | merck | 805,740 | |
| PVDF转印膜，0.45 µm | Thermo Scientific | 88518 | |
| Tween-20 | Panreac | 1,623,121,611 | 聚山梨酯20 |
| PBS | Lonza | BE17-515Q | |
| ECL | Millipore | WBKLS0500 | |
| 纤连蛋白 | Sigma | F1141 | |
| 层粘连蛋白 | Sigma | L2020 | |
| I型胶原蛋白 | Sigma | c8919 | |
| 乙酸 | Panreac | 1,310,081,611 | |
| 台盼蓝 | Sigma | T8154 | |
| 多聚甲醛 | Sigma | P6148 | |
| 甲醇 | Panreac | 1,310,911,612 | |
| 结晶紫 | Sigma | HT90132 | |
| 柠檬酸钠 | Sigma | C7254 | |
| 96%乙醇 | Panreac | 1,410,851,212 | |
| CFSE | Sigma | 21888 | |
| RPMI | Lonza | BE12-115F | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Infinite M200 | Tecan | M200 | 多功能微孔板读板仪 |
| Gel Doc 2000 | Bio-Rad | 2000 | 凝胶成像系统 |
| StepOnePlus | Applied Biosystems | StepOnePlus | qPCR系统 |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | Analyzer 10 | 流式细胞仪设备 |
| ChemiDoc MP | Bio-Rad | MP | 化学发光检测系统 |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 抗体 | |||
| PECAM-1 | BD Biosciences | 553370 | 使用浓度为 10 µg/mL |
| ICAM-2 | Biolegend | 1054602 | 使用浓度为 10 µg/mL |
| E-选择素 | BD Biosciences | 553749 | 使用浓度为 10 µg/mL |
| VCAM-1 | BD Biosciences | 553330 | 使用浓度为 10 µg/mL |
| ICAM-1 | Becton Dickinson | 553250 | 使用浓度为 10 µg/mL |
| 抗大鼠IgG-FITC | Jackson Immuno Research | 112-095-006 | 使用浓度为 10 µg/mL |
| 抗 Armenian hamster-FITC | Jackson Immuno Research | 127-095-160 | 使用浓度为 10 µg/mL |
| 大鼠IgG同型对照 | Invitrogen | 10700 | 使用浓度为 10 µg/mL |
| Armenian hamster IgG同型对照 | Invitrogen | PA5-33220 | 使用浓度为 10 µg/mL |
| P-IκΒ-α | Cell Signaling | 2859 | 使用浓度为 10 µg/mL |
| β-肌动蛋白 | Sigma | A5441 | 使用浓度为 10 µg/mL |
| P-ERK | Cell Signaling | 9101 | 使用浓度为 10 µg/mL |
| 抗小鼠HRP | GE Healthcare | LNXA931/AE | 使用稀释比例为 1:10,000 |
| 抗兔HRP | GE Healthcare | LNA934V/AG | 使用稀释比例为 1:10,000 |
| 抗大鼠HRP | Santa Cruz | Sc-3823 | 使用稀释比例为 1:10,000 |
参考文献
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn's disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Skeoch, S., Bruce, I. N. Atherosclerosis in rheumatoid arthritis: is it all about inflammation? Nat Rev Rheumatol. 11 (7), 390-400 (2015).
- Gerhardt, T., Ley, K.
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重印与许可
