早期核内体的功能依赖于F-actin的聚合。本文介绍一种基于显微镜的 体外 一种在试管中重建早期内体膜上F-肌动蛋白成核与聚合的实验方法，从而使这一复杂的反应过程易于进行生物化学和遗传学操作。
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本文内容
摘要
摘要
许多早期内体功能，特别是货物蛋白分选和膜变形，依赖于在内体膜上成核的短F-actin纤维斑块。我们建立了一种基于显微镜的体外（in vitro）实验方法，可在试管中重建早期内体膜上F-actin的成核与聚合过程，从而使这一系列复杂的反应易于进行遗传学和生物化学操作。通过在蔗糖梯度中漂浮法从表达早期内体蛋白GFP-RAB5的细胞中制备内体组分；胞质组分则从另一批细胞中单独制备。如有需要，内体和胞质组分均可在液氮中冷冻保存。在实验中，将内体组分与胞质组分混合，并在适当条件下（e.g., 离子强度、还原性环境）于37 °C孵育。在预定时间点终止反应，用鬼笔环肽（phalloidin）标记F-actin，随后通过荧光显微镜分析肌动蛋白的成核与聚合过程。本文报道了该实验方法可用于研究参与膜上肌动蛋白成核，或F-actin纤维后续延伸、分支或交联过程的相关因子的作用。
引言
在高等真核细胞中，蛋白质和脂质被内化至早期内体，在其中进行分选。某些 destined 用于再利用的蛋白质和脂质会进入早期内体的管状区域，随后被转运至质膜或反式高尔基体网络（TGN）1,2。相比之下，其他蛋白质和脂质则被选择性地包装到早期内体中呈现多泡结构的区域。这些区域逐渐扩张，最终从早期内体膜上脱离，成熟为游离的内体运输小泡或多泡体（ECV/MVBs），负责将货物转运至晚期内体1,2。
肌动蛋白在与内体分选能力和内体生物发生相关的膜重塑过程中发挥关键作用。通过循环途径向质膜或反式高尔基网络（TGN）进行的蛋白质分选依赖于逆位复合体（retromer complex）及其相关蛋白。该分选机制似乎通过逆位复合体与WASP和Scar同源物（WASH）复合体及分支状肌动蛋白的相互作用，与循环小管的形成相偶联via相互作用实现3,4,5。相比之下，靶向降解的分子（尤其是活化的信号受体）则由运输所需内体分选复合体（ESCRT）分选至内腔囊泡（ILVs....
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方案
1. 溶液与制备
注意：所有缓冲液和溶液均应使用重蒸水（dd H2O）配制。由于蔗糖的水合状态可变，所有蔗糖溶液的最终浓度必须使用折射仪测定。
- 制备不含二价阳离子的磷酸盐缓冲液（PBS-）：137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1.5 mM KH2PO4 和 6.5 mM Na2HPO4。调节 pH 至 7.4。通过高压灭菌（121 °C，15 分钟，1 个循环）灭菌，并在室温下保存。
- 制备 300 mM 咪唑储备液：将 0.204 g 咪唑溶于 10 mL ddH2O 中。在 4 °C 下用 HCl 调节 pH 至 7.4。使用孔径为 0.22 μm 的滤器过滤灭菌，并在 4 °C 下保存。
- 制备匀浆缓冲液（HB；约制备 100 mL）：含 250 mM 蔗糖的 3 mM 咪唑溶液。在 4 °C 下使用 pH 计调节 pH 至 7.4。使用孔径为 0.22 μm 的滤器过滤灭菌，并在 4 °C 下保存。使用前立即向 HB 中添加蛋白酶抑制剂混合物，使其终浓度分别为 10 mM 亮抑蛋白酶肽（leupeptin）、1 mM 胃蛋白酶抑制剂 A（pepstatin A）和 10 ng/mL 抑肽酶（aprotinin）。
- 对于阶梯式漂浮梯度，....
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结果
为了深入了解F-actin斑块在早期内体膜上的形成机制，我们遵循了以下方案中所述的实验步骤 图2简而言之，细胞被转染了GFP-RAB5，随后通过亚细胞分级分离法提取早期内体。将纯化的早期内体与细胞质孵育，以提供肌动蛋白本身以及其他可能参与反应的因子。孵育结束后，通过固定混合物终止反应。取样后将样品置于显微载玻片上。最后，用鬼笔环肽标记F-actin以进行检测图3AF-肌动蛋白在早期内体膜上的成核及其后续的聚合过程发生迅速。事实上，在反应开始后1分钟内即可在内体上观察到F-肌动蛋白。图3A）。这些最初较短的肌动蛋白结构迅速变长、产生分支并相互连接，最终形成交织的肌动蛋白丝网络（图3A），这可能反映了体外条件下肌动蛋白动力学的失衡。当使用纯化的罗丹明标记肌动蛋白并结合细胞胞质溶胶进行实验时，也观察到类似的成核和聚合速率。实验在玻璃底培养皿中.......
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讨论
肌动蛋白在内体膜动态过程中发挥关键作用4,14。我们此前报道过，肌动蛋白的成核与聚合发生在早期内体上，形成小的F-actin斑块或网络。这些F-actin网络对于沿降解途径从早期内体向更下游的膜运输至关重要。干扰该成核和聚合过程的任何步骤，都会阻碍内体成熟，从而阻断向晚期内体和溶酶体的下游运输9,11,15。特别是，我们利用上述实验方法分析了早期内体上F-actin聚合的各个连续步骤，并在分子水平上对这一过程进行了表征。
在这些实验中，早期核内体用 GFP-RAB5 标记 体内，通过亚细胞分级分离纯化后，在含有细胞质的试管中孵育，以促进F-actin的聚合 体外在预定时间终止反应，将反应混合物转移至显微载玻片，利用鬼笔环肽标记F-actin，通过.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
经费由瑞士国家科学基金会、瑞士协同研究计划（Sinergia）、波兰-瑞士研究计划（PSPB-094/2010）、化学生物学国家研究中心（NCCR）、由瑞士国家科学基金会评估的瑞士SystemsX.ch计划中的LipidX项目（资助对象：J. G.）提供支持。O. M. 获得了欧洲分子生物学组织（EMBO）长期博士后奖学金（ALTF-516-2012）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71380 | |
| KCl | Acros Organics | 196770010 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1042 | |
| Na2HPO4 | Acros Organics | 424370025 | |
| Hepes | AppliChem | A3724 | |
| 乙酸镁四水合物 | Fluka | 63047 | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | AppliChem | A2948 | |
| 咪唑 | Sigma-Aldrich | 10125 | |
| NaOH | Fluka | 71690 | |
| 蔗糖 | Merck Millipore | 107687 | |
| 亮抑蛋白酶肽 | Roche | 11017101001 | |
| 胃蛋白酶抑制剂 | Roche | 10253286001 | |
| 抑肽酶 | Roche | 10236624001 | |
| 多聚甲醛 | Polysciences. Inc | 380 | |
| Alexa Fluor 555 鬼笔环肽 | Molecular Probes | A34055 | |
| 罗丹明标记肌动蛋白 | Cytoskeleton. Inc | APHR-A | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | 聚乙烯醇，分子量 ~31 000 |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D-2522 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1086 | |
| β-酪蛋白 | Sigma-Aldrich | C6905 | |
| 0.22 μm 滤膜 | Millex | SL6V033RS | |
| 10 cm 圆形细胞培养皿 | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| 塑料巴斯德吸管 | Assistent | 569/3 40569003 | |
| 15-mL 聚丙烯离心管 | TPP | 91015 | |
| 22G 黑色皮下注射针头，30 mm | BD Microlance | 300900 | |
| 无针头无菌鲁尔滑动式 1 mL 注射器 | BD Plastipak | 300013 | |
| 显微玻璃载片 | Assistent | 2406 | |
| 18 × 18 mm 玻璃盖玻片 | Assistent | 1000/1818 | |
| SW60 离心管 | Beckman coulter | 344062 | |
| TLS-55 离心管 | Beckman coulter | 343778 | |
| 200-μL 黄色吸头 | Starlab | S1111-0706 | |
| 1,000-μL 蓝色刻度吸头 | Starlab | S1111-6801 | |
| 1.5-mL 离心管 | Axygen | MCT-175-C 311-04-051 | |
| 直径 18 mm 圆形盖玻片 | Assistent | 1001/18 | |
| 直径 35 mm 带 20 mm 玻璃底（0.16 - 0.19 mm）的培养皿 | In vitro Scientific | D35-20-1.5-N | |
| 折射仪 | Carl Zeiss | 79729 | |
| 等离子清洗仪 | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Sorvall WX80 超速离心机 | Thermo Fisher Scientific | 46900 | |
| 台式超速离心机 | Beckman coulter | TL-100 | |
| SW60 转子 | Beckman coulter | 335649 | |
| TLS-55 转子 | Beckman coulter | 346936 | |
| 共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | LSM-780 | |
| Fugene HD 转染试剂 | Promega | E2311 | |
| 蛋白测定试剂 A | Bio-Rad | 500-0113 | |
| 蛋白测定试剂 B | Bio-Rad | 500-0114 | |
| 蛋白测定试剂 S | Bio-Rad | 500-0115 | |
| 细胞刮刀 | 自制 | 约 2 cm 的硅橡胶片，切成极锐角度，固定于金属条上或用镊子夹持 | |
| 折射仪 | Carl Zeiss | ||
| 最低必需培养基（MEM） | Sigma-Aldrich | M0643 | |
| FCS | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| MEM 非必需氨基酸（NEAA） | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | |
| L-谷氨酰胺 | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| pH 计 691 | Metrohm | ||
| ImageJ 软件 | 美国国立卫生研究院（NIH），马里兰州贝塞斯达 |
参考文献
- Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30 (17), 3481-3500 (2011).
- Scott, C. C., Vacca, F., Gruenberg, J. Endosome Maturation, Transport and Functions. Semin. Cell Dev Biol. 31, 2-10 (2014).
- Puthenveedu, M. A., et al.
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重印与许可
