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方法文章

体外 早期早期内体上F-肌动蛋白的聚合

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DOI：

10.3791/55829

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2017年8月28日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Geneva, 2Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne

本文内容

摘要

早期核内体的功能依赖于F-actin的聚合。本文介绍一种基于显微镜的 体外 一种在试管中重建早期内体膜上F-肌动蛋白成核与聚合的实验方法，从而使这一复杂的反应过程易于进行生物化学和遗传学操作。

摘要

许多早期内体功能，特别是货物蛋白分选和膜变形，依赖于在内体膜上成核的短F-actin纤维斑块。我们建立了一种基于显微镜的体外（in vitro）实验方法，可在试管中重建早期内体膜上F-actin的成核与聚合过程，从而使这一系列复杂的反应易于进行遗传学和生物化学操作。通过在蔗糖梯度中漂浮法从表达早期内体蛋白GFP-RAB5的细胞中制备内体组分；胞质组分则从另一批细胞中单独制备。如有需要，内体和胞质组分均可在液氮中冷冻保存。在实验中，将内体组分与胞质组分混合，并在适当条件下（e.g., 离子强度、还原性环境）于37 °C孵育。在预定时间点终止反应，用鬼笔环肽（phalloidin）标记F-actin，随后通过荧光显微镜分析肌动蛋白的成核与聚合过程。本文报道了该实验方法可用于研究参与膜上肌动蛋白成核，或F-actin纤维后续延伸、分支或交联过程的相关因子的作用。

引言

在高等真核细胞中，蛋白质和脂质被内化至早期内体，在其中进行分选。某些 destined 用于再利用的蛋白质和脂质会进入早期内体的管状区域，随后被转运至质膜或反式高尔基体网络（TGN）1,2。相比之下，其他蛋白质和脂质则被选择性地包装到早期内体中呈现多泡结构的区域。这些区域逐渐扩张，最终从早期内体膜上脱离，成熟为游离的内体运输小泡或多泡体（ECV/MVBs），负责将货物转运至晚期内体1,2。

肌动蛋白在与内体分选能力和内体生物发生相关的膜重塑过程中发挥关键作用。通过循环途径向质膜或反式高尔基网络（TGN）进行的蛋白质分选依赖于逆位复合体（retromer complex）及其相关蛋白。该分选机制似乎通过逆位复合体与WASP和Scar同源物（WASH）复合体及分支状肌动蛋白的相互作用，与循环小管的形成相偶联via相互作用实现3,4,5。相比之下，靶向降解的分子（尤其是活化的信号受体）则由运输所需内体分选复合体（ESCRT）分选至内腔囊泡（ILVs）中2,6,7。尽管肌动蛋白在ESCRT依赖性分选过程中的可能作用尚不清楚，但F-肌动蛋白在早期内体之后的ECV/MVB生物发生及运输过程中具有重要作用。特别是，我们发现膜联蛋白A2（annexin A2）可结合早期内体中富含胆固醇的区域，并与spire1共同启动F-肌动蛋白的聚合。在内体上观察到的分支状肌动蛋白网络的形成需要肌动蛋白相关蛋白（ARP）2/3复合体的分支活性，以及ERM蛋白moesin和肌动蛋白结合蛋白cortactin的参与8,9。

此处，我们介绍一种基于显微镜的 体外 在试管中重建早期内体膜上F-肌动蛋白成核与聚合的实验方法。该实验体系此前已被用于研究膜联蛋白A2在F-肌动蛋白成核中的作用，以及膜突蛋白和皮层肌动蛋白在内体肌动蛋白网络形成中的功能。8,9。通过这种方法 体外 方案，内体上肌动蛋白聚合过程中发生的一系列复杂反应可被用于生化与分子水平分析该过程的各个连续步骤，包括肌动蛋白成核、线性聚合、分支及交联。

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方案

1. 溶液与制备

注意：所有缓冲液和溶液均应使用重蒸水（dd H2O）配制。由于蔗糖的水合状态可变，所有蔗糖溶液的最终浓度必须使用折射仪测定。

  1. 制备不含二价阳离子的磷酸盐缓冲液（PBS-）：137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1.5 mM KH2PO4 和 6.5 mM Na2HPO4。调节 pH 至 7.4。通过高压灭菌（121 °C，15 分钟，1 个循环）灭菌，并在室温下保存。
  2. 制备 300 mM 咪唑储备液：将 0.204 g 咪唑溶于 10 mL ddH2O 中。在 4 °C 下用 HCl 调节 pH 至 7.4。使用孔径为 0.22 μm 的滤器过滤灭菌，并在 4 °C 下保存。
  3. 制备匀浆缓冲液（HB；约制备 100 mL）：含 250 mM 蔗糖的 3 mM 咪唑溶液。在 4 °C 下使用 pH 计调节 pH 至 7.4。使用孔径为 0.22 μm 的滤器过滤灭菌，并在 4 °C 下保存。使用前立即向 HB 中添加蛋白酶抑制剂混合物，使其终浓度分别为 10 mM 亮抑蛋白酶肽（leupeptin）、1 mM 胃蛋白酶抑制剂 A（pepstatin A）和 10 ng/mL 抑肽酶（aprotinin）。
  4. 对于阶梯式漂浮梯度，按以下方法制备 62%、39% 和 35% 的蔗糖溶液（溶剂为 3 mM 咪唑，pH 7.4）。使用折光仪精确测定所有蔗糖溶液的最终浓度。
    1. 制备 100 mL 的 62% 蔗糖溶液（溶剂为 3 mM 咪唑，pH 7.4）。将 80.4 g 蔗糖加入预热至 35 °C 的 ddH2O 中，搅拌溶解。加入 1 mL 的 300 mM 咪唑储备液，再用 ddH2O 定容至 100 mL。在 4 °C 下调节 pH 至 7.4。使用孔径为 0.22 μm 的滤器过滤灭菌，并在 4 °C 下保存。
    2. 制备 100 mL 的 35% 蔗糖溶液（溶剂为 3 mM 咪唑，pH 7.4）。将 40.6 g 蔗糖加入 ddH2O 中，搅拌溶解。加入 1 mL 的 300 mM 咪唑储备液，再用 ddH2O 定容至 100 mL。在 4 °C 下调节 pH 至 7.4。使用孔径为 0.22 μm 的滤器过滤灭菌，并在 4 °C 下保存。
    3. 制备 50 mL 的 39% 蔗糖溶液（溶剂为 3 mM 咪唑，pH 7.4）。将 62% 蔗糖溶液与 35% 蔗糖溶液混合稀释。在 4 °C 下保存。
  5. 将 3 g 多聚甲醛（PFA）加入预热至 60 °C 的 100 mL PBS- 中，边搅拌边逐滴加入 1 M NaOH；用 NaOH 调节最终 pH 至 7.4。使用孔径为 0.22 μm 的滤器过滤灭菌，并在 -20 °C 下保存。
    注意：3% PFA 为有毒试剂。
  6. 制备 1 M KCl 储备液。将 3.73 g KCl 溶于 50 mL ddH2O 中，搅拌溶解。使用孔径为 0.22 μm 的滤器过滤灭菌，并在室温下保存。
  7. 制备 50X 浓缩储备液，其中含 0.625 M Hepes（pH 7.0）和 75 mM MgOAc2，溶剂为 ddH2O。分装后于 -20 °C 保存。
  8. 制备封片剂。将 2.4 g 聚乙烯醇 Mw ~31,000（PVA）与 6 g 甘油混合并搅拌。加入 6 mL ddH2O，室温下静置至少 2 小时。再加入 12 mL 0.2 M Tris-Cl（pH 8.5），加热至约 53 °C，间歇搅拌直至 PVA 完全溶解。
  9. 在室温下以 5,000 × g 离心 20 分钟澄清溶液。收集上清液，加入 2.5%（w/v）的 1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷（DABCO）以防止荧光检测过程中的光漂白。涡旋约 30 秒使其溶解。分装至 1.5 mL 塑料管中，于 -20 °C 保存。

2. 细胞培养

  1. 在补充有10%胎牛血清、10%非必需氨基酸、10% L-谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基中培养HeLa细胞。在37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中维持培养。 °C，在5% CO₂环境中2 培养箱
  2. 在实验前24小时，用GFP-RAB5转染细胞10，按照制造商说明使用商用转染试剂。
  3. 必要时，从缺失目的蛋白的细胞中制备早期内体组分和细胞质溶胶即， 使用RNAi或CRISPR/Cas9技术敲低目标蛋白，和/或过表达该蛋白的野生型或突变型形式。

3. 早期内体组分的制备

注意：本方案描述了含有内体及其他轻质膜的亚细胞组分的简易制备方法。如有需要，也可使用纯化的内体组分11. 准备2个培养皿（外径10 cm；57 cm²）2) 作为起始材料，2 个培养皿中汇合的 HeLa 细胞总数约为 2.5 x 107 细胞。必要时，也可从缺失目的蛋白的细胞中制备内体即， 使用RNAi或CRISPR/Cas9技术敲低目标蛋白和/或过表达目标蛋白的野生型或突变体形式，同时始终表达GFP-RAB5。

注意：组分分离方案的所有步骤均需在冰上进行。

  1. 将培养皿置于装有冰块的湿金属板上，立即用 5 mL 冰冷的 PBS- 洗涤细胞两次。
  2. 移除最后一次洗涤中的所有 PBS-，每皿加入 3 mL 冰冷的 PBS-。操作过程中细胞不可干燥：必要时，可将冰桶置于摇床上，以确保液体充分覆盖细胞。
  3. 使用柔软的橡胶刮刀在 PBS 中将细胞从培养皿上机械刮下即， 自制细胞刮刀）。首先沿培养皿边缘快速环形刮取细胞，然后在培养皿中央区域向下刮取。轻柔刮取以获得 "片" 用塑料巴斯德吸管（管口较宽）轻柔地将贴壁细胞转移至预冷的15 mL锥形聚丙烯管中，置于冰上。
  4. 离心5分钟，175 x g 和 4 °C.
  5. 轻轻吸除上清液（SN），向沉淀中加入 1 - 3 mL HB。使用带有宽口的塑料巴斯德移液管，轻柔地吹打一次，使细胞重新悬浮。
  6. 离心 7 - 10 分钟，1,355 x g g 和 4 °C. 轻轻移除上清液。
  7. 进行细胞匀浆。
    注意：操作条件应温和，以确保细胞的质膜破裂，而内体保持完整。
    1. 向每个细胞沉淀中加入已知体积的含蛋白酶抑制剂的 HB 缓冲液（约 100 μ每细胞沉淀毫升）。使用 1,000-µL 微量移液器，轻轻吹打使细胞重悬。切勿引入气泡。
    2. 使用已用 HB 预冲洗且无空气或气泡的 22G 针头，准备一支 1 mL 结核菌素注射器。
    3. 用注射器相对缓慢地吸取细胞悬液（以避免产生气泡），将针头斜面紧贴试管壁，快速推出细胞悬液，以剪切贴壁细胞的质膜。
    4. 取少量匀浆液（约3 µ升）并稀释至50 µ在载玻片上加入 L 的 HB，混匀后加盖盖玻片。使用配备 20X 或 40X 物镜的相差显微镜观察匀浆液。
      注意：在最佳条件下，大多数细胞已被破碎，但细胞核（呈深灰色圆形结构）则保持完整（图1).
    5. 重复步骤 3.7.3 和 3.7.4，直至大多数细胞破裂；通常需要通过针头上下推动 3 - 6 次。保留少量等分试样（10 - 30 µ用于蛋白质测定的匀浆液（L）。
  8. 离心匀浆7分钟，1,355 x g 和 4 °C.
    注意：离心后，沉淀（定义为核沉淀；NP）含有细胞核，上清液（定义为去核上清液；PNS）含有胞质溶胶以及匀浆后释放并处于游离悬浮状态的细胞器。
  9. 小心收集 PNS。保留少量等分试样（10 - 30 µL）用于PNS和NP的蛋白质测定，并弃去NP。
  10. 通过将 PNS 与 62% 蔗糖溶液按 PNS:62% 蔗糖 1:1.1 的比例混合，将 PNS 调整至 40.6% 蔗糖浓度。轻轻但充分混匀，避免产生气泡。使用折射仪检测蔗糖浓度。
  11. 将PNS置于超速离心管底部的40.6%蔗糖溶液中，小心地加入2.5 mL 35%蔗糖溶液进行覆盖，然后用HB溶液加满离心管。
    注意：蔗糖溶液应逐层叠加，确保界面清晰可见。
  12. 超速离心蔗糖梯度1小时，转速为  ̴165,000 x g 和 4 °C.
  13. 小心移除梯度顶部的白色脂质层。接着，使用 200-μL型微量移液器，尖端剪开。
    注意：内体组分可直接用于后续实验 体外 肌动蛋白聚合实验，或可在冰上分装后，用液氮速冻并保存于-80℃ °C.
  14. 测定PNS和早期内体组分的蛋白浓度。
    注意：该浓度应至少为 100 µg/mL。约 2.5 × 107 需要培养于2个培养皿中的细胞以获得至少100的PNS µg/mL（见上述注释）。

4. 细胞质组分的制备

注意：准备 2 个培养皿（直径 10 cm；57 cm²），每个培养皿中加入 10 mL 预热至 37 °C 的成像缓冲液。2) 作为起始材料。必要时，胞质溶胶也可从目的蛋白被耗竭的细胞中制备（即， 使用RNAi或CRISPR/Cas9技术敲低或敲除目标蛋白，和/或过表达该蛋白的野生型或突变型。至于内体分馏步骤，所有操作均应在冰上进行。

  1. 重复步骤 3.1 - 3.8。
  2. 将PNS放入离心管中，在超速离心机中以45分钟离心 ̴250,000 × g 和 4 °C.
  3. 小心移除顶部的白色层，并收集上清液（细胞质组分），注意不要扰动微粒体沉淀。保留一部分细胞质组分用于蛋白质定量。
    注意：细胞质可直接用于该实验 体外 肌动蛋白聚合实验，或可在冰上分装后，用液氮速冻并保存于-80℃ °C.
  4. 测定细胞质的蛋白质浓度。
    注：浓度应至少为 3 mg/mL。

5. 内体依赖性肌动蛋白聚合的检测方法 体外

注意：内体依赖性肌动蛋白聚合可通过两种替代方法进行。第一种方法是将材料在试管中混合，固定后转移至盖玻片上进行分析。本文所述为第二种方法，该方法可直接在成像腔室中进行实验，固定和分析过程无需机械扰动（图2C）。在第二种方法中，反应混合物无需从试管转移至盖玻片，从而避免了转移过程中对F-肌动蛋白网络造成物理干扰的风险。此外，该方法适用于F-肌动蛋白聚合的延时分析。需要注意的是，两种方法在F-肌动蛋白聚合的分析结果上未观察到差异。
注意：整个实验方案中均应使用切口吸头。

  1. 在试管中
    1. 将冰上预冷的纯化GFP-RAB5早期内体（步骤3）与细胞质组分（步骤4）按1:10（蛋白浓度比）在冰上预冷的1.5 mL锥形试管中轻轻混匀。
      注意：一个典型的实验使用约 40 - 50 µL.
    2. 将冰浴的反应混合物调整至终浓度为 125 mM KCl（使用 1 M KCl 储备液）、12.5 mM Hepes 和 1.5 mM MgOAc2 （使用50倍浓度的储存液）。然后加入蛋白酶抑制剂，使其终浓度分别为10 mM亮抑蛋白酶肽（leupeptin）、1 mM胃蛋白酶抑制剂A（pepstatin A）和10 ng/mL抑肽酶（aprotinin）。轻柔混匀所有组分。
    3. 将含有反应混合物的试管置于37 °C °C，不摇动，孵育所需时间。
      注意：通常，可在约3分钟内检测到早期内体上的肌动蛋白聚合，30分钟内形成广泛的网络结构。
    4. 在所需时间（即， 3分钟或30分钟后，将试管置于冰上以终止反应，并加入预冷的3% PFA溶液，体积比为1/10（体积:体积）。
    5. 加入 0.3:10（体积:体积）的 200 单位/毫升（约 6.6 μM）与红色-橙色染料偶联的鬼笔环肽用于染色聚合的肌动蛋白。
    6. 放置 12 μ12 微升混合液 μPVA 封片剂的 L 值置于显微玻璃载片上。放置 18 × 18 mm2 盖玻片
    7. 使用共聚焦显微镜分析样品。
  2. 在成像腔室中
    1. 为制备显微成像腔室，使用等离子清洗仪分别对直径18 mm的圆形盖玻片和带有20 mm玻璃底（厚度0.16–0.19 mm）的直径35 mm圆形培养皿清洗1分钟。
    2. 将清洁后的表面与1% β用 -casein 孵育 20 分钟，以最大限度减少蛋白质与玻璃的结合。用 3 mM 咪唑洗涤两次。
    3. 将步骤5.1.1和5.1.2中的内体与细胞质组分加入预冷的1.5 mL离心管中，并用0.1补足反应体系 μg/μL 罗丹明-肌动蛋白。
    4. 使用39%蔗糖溶液将混合物的最终折射率调整至1.375（26.5%蔗糖）。
      注意：通常加入相同体积，但需根据折射仪测定的所收集组分的蔗糖浓度进行经验性重新调整，因为蔗糖浓度在不同实验间可能略有变化。
    5. 将混合物置于经预处理的35 mm培养皿（步骤5.2.1）中，并用经预处理的18 mm盖玻片（步骤5.2.1）覆盖。
    6. 将反应 chamber 置于 37 °C °C，不振荡。
    7. 使用荧光共聚焦显微镜分析样品。

6. 肌动蛋白网络的图像采集与分析

  1. 图像采集
    1. 在倒置扫描共聚焦显微镜上采集图像。
      注意：图像采集参数已针对配备63倍1.25数值孔径油镜的倒置扫描共聚焦显微镜进行了优化。调整激光功率（通常约为50%），以获得良好的信噪比。
  2. 肌动蛋白网络的定量分析
    1. 分析荧光显微图像。使用开源软件CellProfiler（v2.1.1）12测量每个早期内体上的肌动蛋白含量（也可使用其他软件）。
      1. 首先，利用GFP-RAB5信号将内体识别为主要对象；然后，以肌动蛋白信号（红色-橙色染料标记的鬼笔环肽）的扩展区域作为次要对象，量化与各个内体相关联的F-actin。
      2. 将每个对象关联物质的数量取平均值，并相对于对照条件进行归一化处理。

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结果

为了深入了解F-actin斑块在早期内体膜上的形成机制，我们遵循了以下方案中所述的实验步骤 图2简而言之，细胞被转染了GFP-RAB5，随后通过亚细胞分级分离法提取早期内体。将纯化的早期内体与细胞质孵育，以提供肌动蛋白本身以及其他可能参与反应的因子。孵育结束后，通过固定混合物终止反应。取样后将样品置于显微载玻片上。最后，用鬼笔环肽标记F-actin以进行检测图3AF-肌动蛋白在早期内体膜上的成核及其后续的聚合过程发生迅速。事实上，在反应开始后1分钟内即可在内体上观察到F-肌动蛋白。图3A）。这些最初较短的肌动蛋白结构迅速变长、产生分支并相互连接，最终形成交织的肌动蛋白丝网络（图3A），这可能反映了体外条件下肌动蛋白动力学的失衡。当使用纯化的罗丹明标记肌动蛋白并结合细胞胞质溶胶进行实验时，也观察到类似的成核和聚合速率。实验在玻璃底培养皿中...

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讨论

肌动蛋白在内体膜动态过程中发挥关键作用4,14。我们此前报道过，肌动蛋白的成核与聚合发生在早期内体上，形成小的F-actin斑块或网络。这些F-actin网络对于沿降解途径从早期内体向更下游的膜运输至关重要。干扰该成核和聚合过程的任何步骤，都会阻碍内体成熟，从而阻断向晚期内体和溶酶体的下游运输9,11,15。特别是，我们利用上述实验方法分析了早期内体上F-actin聚合的各个连续步骤，并在分子水平上对这一过程进行了表征。

在这些实验中，早期核内体用 GFP-RAB5 标记 体内，通过亚细胞分级分离纯化后，在含有细胞质的试管中孵育，以促进F-actin的聚合 体外在预定时间终止反应，将反应混合物转移至显微载玻片，利用鬼笔环肽标记F-actin，通过...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

经费由瑞士国家科学基金会、瑞士协同研究计划（Sinergia）、波兰-瑞士研究计划（PSPB-094/2010）、化学生物学国家研究中心（NCCR）、由瑞士国家科学基金会评估的瑞士SystemsX.ch计划中的LipidX项目（资助对象：J. G.）提供支持。O. M. 获得了欧洲分子生物学组织（EMBO）长期博士后奖学金（ALTF-516-2012）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
NaClSigma-Aldrich71380
KClAcros Organics196770010
KH2PO4AppliChemA1042
Na2HPO4Acros Organics424370025
HepesAppliChemA3724
乙酸镁四水合物Fluka63047
二硫苏糖醇（DTT）AppliChemA2948
咪唑Sigma-Aldrich10125
NaOHFluka71690
蔗糖Merck Millipore107687
亮抑蛋白酶肽Roche11017101001
胃蛋白酶抑制剂Roche10253286001
抑肽酶Roche10236624001
多聚甲醛Polysciences. Inc380
Alexa Fluor 555 鬼笔环肽Molecular ProbesA34055
罗丹明标记肌动蛋白Cytoskeleton. IncAPHR-A
Mowiol 4-88Sigma-Aldrich81381聚乙烯醇，分子量 ~31 000
DABCOSigma-AldrichD-2522
Tris-HClAppliChemA1086
β-酪蛋白Sigma-AldrichC6905
0.22 μm 滤膜MillexSL6V033RS
10 cm 圆形细胞培养皿Thermo Fisher Scientific150350
塑料巴斯德吸管Assistent569/3 40569003
15-mL 聚丙烯离心管TPP91015
22G 黑色皮下注射针头，30 mmBD Microlance300900
无针头无菌鲁尔滑动式 1 mL 注射器BD Plastipak300013
显微玻璃载片Assistent2406
18 × 18 mm 玻璃盖玻片Assistent1000/1818
SW60 离心管Beckman coulter344062
TLS-55 离心管Beckman coulter343778
200-μL 黄色吸头StarlabS1111-0706
1,000-μL 蓝色刻度吸头StarlabS1111-6801
1.5-mL 离心管AxygenMCT-175-C 311-04-051
直径 18 mm 圆形盖玻片Assistent1001/18
直径 35 mm 带 20 mm 玻璃底（0.16 - 0.19 mm）的培养皿In vitro ScientificD35-20-1.5-N
折射仪Carl Zeiss79729
等离子清洗仪Harrick PlasmaPDC-32G
Sorvall WX80 超速离心机Thermo Fisher Scientific46900
台式超速离心机Beckman coulterTL-100
SW60 转子Beckman coulter335649
TLS-55 转子Beckman coulter346936
共聚焦显微镜Carl ZeissLSM-780
Fugene HD 转染试剂PromegaE2311
蛋白测定试剂 ABio-Rad500-0113
蛋白测定试剂 BBio-Rad500-0114
蛋白测定试剂 SBio-Rad500-0115
细胞刮刀自制约 2 cm 的硅橡胶片，切成极锐角度，固定于金属条上或用镊子夹持
折射仪Carl Zeiss
最低必需培养基（MEM）Sigma-AldrichM0643
FCSThermo Fisher Scientific10270-106
MEM 非必需氨基酸（NEAA）Thermo Fisher Scientific11140-035
L-谷氨酰胺Thermo Fisher Scientific25030-024
青霉素-链霉素Thermo Fisher Scientific15140-122
pH 计 691Metrohm
ImageJ 软件美国国立卫生研究院（NIH），马里兰州贝塞斯达

参考文献

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