本研究详细介绍了一种标准的免疫组织化学方法，用于观察晚期16阶段黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）胚胎的运动神经元投射。通过对固定胚胎进行FasII抗体染色并制备成剥离标本，可有效鉴定在神经系统发育过程中调控运动轴突发育导向及靶标识别所需的相关基因。
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摘要
摘要
功能性神经肌肉环路的建立依赖于发育中的运动轴突与靶肌肉之间精确的连接。运动神经元通过其生长锥响应来自周围细胞外环境的大量轴突导向信号，沿特定路径延伸。生长锥对靶标的识别在神经肌肉特异性连接中也起着关键作用。本文介绍了一种标准的免疫组织化学实验方案，用于观察晚期16期黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）胚胎中运动神经元的投射情况。该方案包含几个关键步骤：基因分型步骤，用于筛选所需突变型胚胎；免疫染色步骤，使用黏附分子II（fasciclin II, FasII）抗体对胚胎进行标记；以及解剖步骤，将固定后的胚胎制备成展开式标本。与整体胚胎标本相比，展开式胚胎标本能够更清晰地观察外周区域的运动轴突投射和肌肉分布模式。因此，利用FasII抗体染色的固定胚胎展开标本是一种强有力的工具，可用于鉴定参与运动轴突路径寻找和靶标识别的相关基因，并可广泛应用于功能缺失和功能获得型遗传筛选研究。
引言
在胚胎发育过程中，运动轴突与靶肌肉之间精确而特异的连接对于Drosophila幼虫的正常运动至关重要。每个腹部半节段A2-A7中30根肌纤维的胚胎模式在16期已建立1。腹神经索中产生的36个运动神经元将其轴突延伸至外周，以支配特定的靶肌肉2。通过免疫组织化学方法使用抗体（小鼠单克隆抗体1D4）可观察运动轴突的路径寻找和靶标识别过程3,4。野生型胚胎中运动轴突投射模式的多幅图像可在网络上获取5。1D4抗体标记了所有运动轴突以及胚胎中枢神经系统（CNS）中线每侧的三条纵向轴突束4,6（图1C和图2A）。因此，使用FasII抗体进行免疫组织化学是鉴定参与神经肌肉连接相关基因、揭示运动轴突导向和靶标识别分子机制的有力工具。
在腹部的每个半体节A2-A7中，运动轴突投射并选择性地聚集形成两条主要神经分支：体节神经（SN）和节间神经（ISN）。2,4以及一个较小的神经分支，即横神经（TN）7SN 选择性地去束化，形成两条神经分支，即 SNa 和 SNc，而 ISN 则分裂为三条神经分支，分别称为 ISN、ISNb 和 ISNd。2,4其中，ISN、ISNb 和 SNa 运动轴突投射模式在对晚期16阶段胚胎用 FasII 抗体染色并进行剥离时，可获得最清晰的可视化效果。图1C 和 图2A）。ISN运动神经元将其轴突延伸以支配背侧肌肉1、2、3、4、9、10、11、18、19和202,4 (图2A）。ISNb运动神经元支配腹外侧肌肉6、7、12、13、14、28和302,4 (图2A 以及图2B）。SNa神经分支投射至支配外侧肌肉5、8、21、22、23和242,4 (图 2A由两条运动轴突组成的胫神经（TN）沿节段边界同侧投射，支配第25号肌肉，并在外周与外侧双极树突神经元（LBD）形成突触。7 (图2A）。这些靶向肌肉的神经支配不仅需要在特定选择点对运动轴突进行选择性去束，还需要靶向肌肉识别。此外，在ISN和SNa通路中均发现了某些作为中间靶点的假定中胚层路标细胞，但在ISNb通路中则未发现4这可能表明，ISNb运动轴突的路径寻找可能以一种不同于ISN和SNa运动轴突导向的方式进行调控，同时也提示外周运动轴突导向为研究单一导向信号分子的差异性或保守性功能提供了一个理想的实验模型8.
本研究介绍了一种用于可视化果蝇（Drosophila）胚胎运动神经元轴突投射模式的标准方法。所述实验方案包括如何解剖经1D4抗体染色并用3,3′-二氨基联苯胺（DAB）处理的固定胚胎，以制备展开样本。固定胚胎扁平制备物的一个关键优势在于能够更清晰地观察外周区域的轴突投射和肌肉分布模式。此外，本研究还展示了如何对固定胚胎进行基因型鉴定，利用LacZ染色法筛选出所需的目标突变胚胎。
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方案
1. 准备
- 通过向500 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）中加入0.5 g牛血清白蛋白（BSA）和0.5 mL t-辛基苯基聚乙二醇醚（PBT）（参见材料表），搅拌至少30分钟，配制500 mL含t-辛基苯基聚乙二醇醚的磷酸盐缓冲液（PBT）。4 °C保存。请使用较新鲜的溶液，并将溶液储存在洁净的瓶中。
- 通过将2.5 mL 16%储备液的多聚甲醛和1 mL 10× PBS加入6.5 mL去离子水中，配制10 mL 4%多聚甲醛溶液。4 °C保存，一周内使用完毕。
注意：避免皮肤接触多聚甲醛溶液，因其具有高毒性。 - 通过将0.1 g X-Gal底物溶解于1 mL二甲基亚砜（DMSO）中，配制10%（w/v）X-Gal底物溶液。分装为100 µL每份，-20 °C保存。
- 使用10 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.2）、150 mM NaCl、1 mM MgCl2、3 mM K4[FeII(CN)6]、3 mM K3[FeIII(CN)6]和0.3% t-辛基苯基聚乙二醇醚配制X-Gal染色液。4 °C避光保存。
- 将30%储备液的过氧化氢用去离子水按1:10稀释，配制3%过氧化氢溶液。
- 将1片（10 mg）3,3′-二氨基联苯胺（DAB）完全溶解于35 mL新鲜PBT溶液中，配制DAB溶液。用0.2-µm针头滤器过滤，分装为910 µL每份，-20 °C保存。
注意：所有DAB废弃物需用漂白剂处理以彻底降解DAB。 - 制备含苹果汁的果蝇培养基平板。将35 g琼脂和1 L去离子水加入2 L锥形瓶中。另取1 L锥形瓶，加入33 g蔗糖、2 g tegosept和375 mL苹果汁。121 °C高压灭菌30分钟使其完全溶解。待两溶液冷却至约60 °C后，混合并充分搅拌。每60 mm培养皿倒入约11 mL混合溶液。
- 将干酵母与去离子水按1:0.8比例混合打碎，制成酵母糊，4 °C保存。
2. 胚胎收集（第1天）
- 收集年轻的雌性和雄性果蝇（年龄小于5天），并在塑料杯状饲养笼中饲养1-2天，笼内放置一个含少量酵母糊（位于中央）的产卵板（60 mm × 15 mm）。
- 为最佳收集晚期16阶段的胚胎，于约下午5点将果蝇（> 50只）放入瓶状饲养笼中，在25 °C条件下让其产卵3小时。
- 将果蝇转移至新的食物培养瓶中。
- 用盖子封好卵板，倒置后置于湿润培养箱（湿度约70%）中，在25 °C下过夜孵育。
3. 胚胎免疫染色前处理（第2天）
- 上午10:20左右，向卵板周围加入1.8 mL PBT溶液，并在倾斜卵板的同时用棉签轻轻搅动以使胚胎脱离板面。
注意：若棉签上粘附大量胚胎，可用棉签轻轻碾压酵母糊使其溶解。在固定前约40分钟开始收集胚胎（大约上午11:00）。 - 使用1 mL移液器吸头将胚胎从培养皿转移到1.5 mL离心管中。
- 让胚胎沉降，尽可能吸除PBT溶液。用1 mL PBT溶液清洗胚胎两次。每次均尽可能吸除PBT溶液。
- 用1 mL 50%的次氯酸钠溶液填充试管（即， 用去离子水稀释）后，在室温（RT）下于旋转振荡仪上孵育3分钟以去除胚胎的卵膜。
注意：此步骤不会杀死去壳胚胎。 - 让去壳的胚胎沉降，尽可能吸除50%次氯酸钠溶液，并用1 mL PBT溶液冲洗胚胎3次。
- 加入0.5 mL庚烷，随后在室温下于上午11:00左右向管中加入0.5 mL 4%多聚甲醛溶液。
- 在室温下于旋转混合仪中孵育胚胎15分钟。
- 移除4%多聚甲醛溶液（下层）。
- 加入0.5 mL 100%甲醇，通过剧烈振荡离心管30秒使胚胎去壳膜。
- 除去庚烷（即， 上层
- 加入0.5 mL 100%甲醇，剧烈振荡试管10 s。
- 轻敲离心管使胚胎沉降，尽可能吸除甲醇。用1 mL 100%甲醇冲洗胚胎，振荡时间少于10秒。
注意：甲醇的长期暴露会破坏β-半乳糖苷酶活性。 - 除去甲醇，并用1 mL PBT溶液将去卵黄膜的胚胎冲洗3次。
4. 使用 LacZ 染色对胚胎进行基因分型（第 2 天）
- 向管中加入1 mL PBT溶液，将管置于37 °C加热块或水浴中孵育15 min。
- 孵育期间，将X-Gal染色液（每管1 mL）置于65 °C水浴中加热至浑浊，随后转移至37 °C水浴中孵育。
- 吸去PBT溶液，向管中加入1 mL X-Gal染色液和20 µL X-Gal底物。
- 在37 °C下轻轻振荡孵育试管，直至出现蓝色沉淀。
注意：2 的孵育时间nd 和 3rd 蓝色平衡器的一般作用时间范围为2-4小时。 - 移除X-Gal染色液，用1 mL室温PBT溶液将胚胎冲洗3次。
- 使用针探针或镊子，手动筛选所需基因型的胚胎（即， 未染色的白色胚胎，使用体视显微镜（1.6X-2.5X物镜）观察。
注意：由于某些蓝色平衡染色体，例如 CyO，actin-LacZ 和 TM3，肌动蛋白-LacZ，携带一个转基因构建体，该构建体在控制下表达细菌β-半乳糖苷酶（LacZ） 肌动蛋白 启动子，以普遍方式染成蓝色的胚胎含有一份或两份蓝色平衡染色体。因此，未染色的白色胚胎对于目标致死等位基因为纯合子。
5. 使用抗Fasciclin II抗体对胚胎进行免疫染色（第2-3天）
- 收集并转移所需基因型的胚胎（即， 使用1 mL移液枪头将未染色的白色胚胎转移至0.5 mL微量离心管中。
注意：在此步骤中，可根据表皮的分节模式以及头部和尾部的结构等形态学标准，对胚胎进行大致的分期。9在胚胎发育过程中，卵孵化后10至16小时期间，在头陷阶段，胚胎最前端的节段会发生显著缩小。9. - 用 0.4 mL PBT 溶液洗涤胚胎一次，加入 0.3 mL 封闭液（含 5% 正常山羊血清和 5% DMSO 的 PBT 溶液）。
- 在室温下将胚胎置于振荡器中封闭15分钟。
- 加入75 µL抗Fasciclin II抗体，于室温下在旋转摇床上孵育过夜。
- 用 0.4 mL PBT 溶液洗涤胚胎，每次至少 20 分钟，共洗涤 4 次。
- 加入含山羊抗小鼠-HRP抗体（2 µg/mL）的封闭液（5%正常山羊血清PBT溶液）0.3 mL，于室温下在旋转摇床上孵育过夜。
- 用0.4 mL PBT溶液清洗胚胎，每次至少20分钟，共清洗6次。
- 加入0.3 mL DAB溶液至试管中。
警告：佩戴手套，并将所有 DAB 废物/试管/枪头放入漂白剂中。 - 加入2 µL 3%过氧化氢，在室温下避光孵育并轻轻振荡，直至产生所需量的沉淀。
注意：1D4免疫组织化学的孵育时间通常为0.5–1小时。 - 用 0.4 mL PBT 溶液洗涤胚胎 4 次。
注意：用移液器吸除 DAB 溶液及前两次洗涤液，并将其弃置于含漂白剂的废液容器中。 - 加入0.2 mL封片用70%甘油/PBS溶液至离心管中，于室温或4 °C保存。
注意：将试管避光保存。通过将胚胎置于90%甘油/PBS溶液中，可获得更清晰的样本。10然而，在90%甘油/PBS溶液中透明化的胚胎比在70%甘油/PBS溶液中透明化的胚胎更难解剖10.
6. 胚胎的分期、解剖、封片与成像（第4天）
- 用于分期，将用70%甘油/PBS平衡过的胚胎转移至载玻片上。
- 收集晚期16期胚胎，其腹节7（A7）、A8和A9的ISN神经汇聚并相互接触，和/或中肠已分为三条带状结构。
注意：用1D4抗体染色的胚胎可根据ISN和ISNb运动轴突的投射模式进行分期。晚期16期胚胎的A7、A8和A9 ISN神经在离开中枢神经系统（CNS）后汇聚并相互接触，随后分开并向背侧肌肉远端延伸（图1A中的箭头所示）。然而，在中期16期胚胎中，A7 ISN神经与A8/A9神经平行延伸（图1B中方括号所示）。此外，两侧体节中A6 ISNb神经的投射轴（垂直于腹外侧肌肉）大致与中枢神经系统纵行轴突束后端对齐（图1C中箭头及直线所示）。这些形态学标准在不同基因型之间略有差异。 alternatively，也可根据肠道形态对胚胎进行分期9,11。在17期之前，中肠呈心形，而到17期时中肠被分为三条带状结构12。 - 解剖胚胎。
- 使用1 mL注射器将每个胚胎从甘油液滴中移出，并将胚胎腹面朝上放置。在体长1/4处切断前端，在无运动轴突分布的最末端区域切断后端。
- 使用针状探针将切端后的胚胎从甘油液滴中移出，滚动使其背面向上，并水平放置于视野中。
注意：当胚胎从甘油液滴中移出时，附着在胚胎上的少量甘油会使其具有黏性。 - 使用一根极细的钨针沿背中线切开胚胎13。先在胚胎后端做一个小切口，然后沿背中线向前连续切开；反向切割亦可。
- 使用针状探针将背中线切开的胚胎移入甘油液滴中，背面向上放置，并通过向腹外侧（对角线方向）展开两侧体壁来分离肠道与体壁（使用2.5X物镜）。
注意：确保背中线完全切开，使左右体壁彻底分离。 - 小心地将背中线切开的胚胎从甘油液滴中移出，然后使用细针状探针将两侧体壁平铺在载玻片上（使用2.5X物镜）。
- 使用极细的钨针通过侧向推动的方式从解剖后的胚胎中去除内脏器官（使用5X物镜）。
注意：另一种类似解剖步骤的更详细描述可在网站上找到5。
- 用于封片，向清洁的解剖后胚胎中加入2–3 µL 70%甘油/PBS溶液，并使用细针状探针将其转移至新的载玻片上，该载玻片中央已铺有8 µL 70%甘油/PBS溶液（使用2.5X物镜）。
- 盖上盖玻片（18 mm × 18 mm）。使用普通指甲油（透明或有色均可）密封盖玻片边缘。
- 根据制造商说明，在微分干涉差（DIC）光学显微镜下使用高分辨率（20X、40X和63X油镜物镜）采集图像。
注意：使用63X油镜物镜可获得更清晰的图像和更准确的表型特征，尤其是对ISNb运动轴突的观察。
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结果
神经发育过程中运动轴突与靶肌肉之间的精确连接依赖于在特定选择点处的轴突-轴突选择性排斥作用以及靶标识别4。在Drosophila中，运动轴突之间的选择性排斥部分由1类和2类神经纤毛蛋白（Semaphorins, Semas）共同调控，其中包括Sema-1a、Sema-2a和Sema-2b8,14,15,16,17,18。因此，Sema-1a功能缺失常导致ISNb轴突在特定选择点处无法正常去束化，从而表现出异常增粗的形态（图2C中的箭头所示）...
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讨论
与使用荧光标记胚胎进行激光扫描共聚焦显微镜观察相比，通过DAB染色胚胎的去肌壁制备法可更快且更准确地评估运动轴突导向缺陷的细节。因此，固定后经1D4染色胚胎的去肌壁制备法最适用于导向信号分子的功能表征。包括netrin、Slit、神经纤毛蛋白（semaphorin，Sema）和ephrin在内的四类主要导向信号分子及其相应的受体，在从线虫、果蝇到脊椎动物的进化过程中其功能具有高度保守性20。在作为Slit配体受体的roundabout（Robo）家族分子中，果蝇（Drosophila）Robo最早被发现介导中枢神经系统中的排斥性导向功能6,21。Sema是一类庞大的导向分子家族，可结合含有plexin的受体复合物22。Sema的轴突导向功能最初在蝗虫中枢神经系统中被发现14。随后，I类跨膜型神经纤毛蛋白Sema-1a在果蝇（Drosophila...
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披露
作者声明其不存在竞争性经济利益。
致谢
我感谢Alex L. Kolodkin，因为我在他的实验室学习了这种去筋膜的制备方法。我还感谢Young Gi Hong提供的技术协助。 本研究由NRF-2013R1A1A4A01011329（S.J.）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 吐温 X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | t-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇 |
| 16% 多聚甲醛溶液 | Ted Pella | 18505 | |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| 氯化钾 | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| 磷酸氢二钠 | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| 磷酸二氢钠 | Sigma-Aldrich | 71500 | |
| X-Gal 底物 | US Biological | X1000 | X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷半乳吡喃糖苷） |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| 氯化镁 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| 六氰合铁(II)酸钾三水合物 | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| 六氰合铁(III)酸钾 | Sigma-Aldrich | 244023 | |
| 过氧化氢 | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| 3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐 | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| 琼脂 | US Biological | A0930 | |
| 蔗糖 | Fisher Scientific | S5-3 | |
| 对羟基苯甲酸甲酯（Tegosept） | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| 培养皿（60 mm） | Corning | 430166 | |
| Tricon 烧杯 | Simport | B700-100 | 用于制作塑料烧杯笼以收集胚胎 |
| 酵母 | Societe Industrielle Lesaffre | Saf Instant Yeast Red | |
| 棉签（木柄单头棉签，PK100） | VWR | 14220-263 | |
| 微量离心管（1.5 ml） | Sarstedt | #72.690 | |
| 漂白剂 | The Clorox Company | Clorox | |
| 正庚烷 | Sigma-Aldrich | 246654 | |
| 甲醇 | J.T. Baker | UN1230 | |
| 正常山羊血清 | Life Technologies | 16210-064 | |
| 抗 Fasciculin II 抗体 | 发育研究杂交瘤库 | 1D4 anti-Fasciclin II | |
| 山羊抗小鼠 HRP 抗体 | Jackson Immunoresearch | 115-006-068 | AffiniPure F(ab')2 片段山羊抗小鼠 IgG+IgM（H+L） （最小交叉反应：人、牛、马血清蛋白） |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| 载玻片 | Duran Group | 235501403 | |
| 盖玻片 | Duran Group | 235503104 | 18 × 18 mm |
| 1 ml 注射器 | Becton Dickinson Medical(s) | 301321 | |
| 钨针 | Ted Pella | #27-11 | 钨丝，ø0.13 mm / 6.1 m（ø.005"/20 ft.） |
| 振荡器（迷你摇床） | Korean Science | KO.VS-96TWS | 也可使用 BD Clay Adams 品牌振荡器（BD 421125） |
参考文献
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