胚胎运动神经元轴突投影模式的可视化果蝇

Summary

这项工作详细描述了一个标准的免疫组织化学方法，可视化晚期16 号果蝇黑色素瘤胚胎的运动神经元投影。用FasII抗体染色的固定胚胎的切片制备提供了一个强大的工具，用于表征神经发育期间运动轴索寻路和靶标识别所需的基因。

Abstract

功能性神经肌肉回路的建立依赖于发育中的运动轴突和目标肌肉之间的精确连接。运动神经元通过响应大量来自周围细胞外环境的轴突指导线索，延长生长锥体以沿着特定途径导航。生长锥目标识别也在神经肌肉特异性中起关键作用。这项工作提出了一个标准的免疫组织化学方案，可视化晚期16 号果蝇黑色素瘤胚胎的运动神经元投影。该方案包括几个关键步骤，包括基因分型程序，以排序所需的突变体胚胎;免疫染色程序，用fasciclin II（FasII）抗体标记胚胎;和解剖程序，从固定胚胎产生鱼片制剂。周边的运动轴突突出物和肌肉图案在圆形胚胎的扁平制剂中比在wh中更好地可视化油籽胚胎。因此，用FasII抗体染色的固定胚胎的切片制备为表征运动轴突寻路和靶标识别所需的基因提供了有力的工具，也可以应用于功能丧失功能遗传屏障。

Introduction

胚胎发育期间运动轴突和目标肌肉之间的精确和选择性联系对于果蝇幼虫的正常运动是必不可少的 。每个腹部疾病A2-A7中的30个肌纤维的胚胎图案是由阶段16 ^1建立的 。在腹侧神经线中产生的36只运动神经元将其轴突延伸到外周以支配特定的目标肌肉² 。通过抗体（小鼠单克隆抗体1D4）3,4免疫组织化学可以观察到运动轴索寻路和靶标识别。在野生型胚胎中的运动轴突投影图案的多个图像可在网络^5上获得 。 1D4抗体标记胚胎中枢神经系统（CNS）中线每侧的所有运动轴突和三个纵向轴突束， ⁶ （ 图1C和图2A ）。因此，FasII抗体的免疫组化提供了一个强大的工具，用于识别神经肌肉连接所需的基因，以证明运动轴突指导和靶标识别的分子机制。

在每个腹部A2-A7中，运动轴突突出并选择性地成形为两个主要神经分支，节段神经（SN）和节段间神经（ISN） ^2,4和一个小神经分支，横向神经（TN ） ⁷ 。 SN选择性地消弧以产生称为SNa和SNc的两个神经分支，而ISN分裂成称为ISN，ISNb和ISNd 2,4的三个神经分支。其中，ISN，ISNb和SNa运动轴突当晚期16期胚胎用FasII抗体染色时，投影图案最精确地可视化，并被切片（ 图1C和图2A ）。 ISN运动神经元延伸其轴突以支配1,2,3,4,9,10,11,18,19和20,2,4（ 图2A ）的背部肌肉。 ISNb运动神经元支配腹侧肌6,7,12,13,14,28和30,24（ 图2A和2B）。 SNa神经分支突出支配5,8,21,22,23和24,2,4（ 图2A ）的侧肌。由两个运动轴突组成的TN沿着节段边界向内侧投射以支配肌肉25，并且在侧向双极树突状神经元（LBD）中突触周边⁷ （ 图2A ）。这些目标肌肉神经支配不仅需要在特定选择点的运动轴突的选择性阻塞，而且还需要靶向肌肉识别。此外，在ISN和SNa途径中都发现了一些作为中间靶点的推定的中胚层路标细胞，但不是沿着ISNb途径⁴ 。这可能表明与ISN和SNa运动轴突指导相比，ISNb运动轴索寻路可以以明显的方式进行调节，并且还表明外周运动轴突指导提供了一个有吸引力的实验模型来研究单个指导提示的差异或保守作用分子⁸ 。

这项工作提出了一种标准方法，可视化果蝇中胚胎运动神经元的轴突投影模式。所描述的方案包括如何解剖用1D4a染色的固定胚胎在3,3'-二氨基联苯胺（DAB）中加工用于切片制剂。固定胚胎的扁平制剂的一个关键优点是周边轴突突起和肌肉模式的更好的可视化。此外，这项工作还显示了如何使用LacZ染色法将固定的胚胎基因型分类为所需的突变体胚胎。

Protocol

准备

1. 通过加入0.5g牛血清白蛋白（BSA）和0.5mL叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇（参见材料表），向具有叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇（PBT）溶液的500ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）中制备500mL的1X PBS并搅拌至少30分钟。储存于4°C。使用时比较新鲜，并将溶液储存在干净的瓶子里。
2. 通过向6.5mL去离子水中加入2.5mL 16％的多聚甲醛溶液和1mL的10x PBS，制成10mL的4％多聚甲醛。储存于4°C并在一周内使用。
   小心:避免皮肤接触多聚甲醛溶液，因为它具有高毒性。
3. 通过每1mL DMSO溶解0.1g X-Gal底物制备X-Gal底物（10％w / v X-Gal在二甲基亚砜（DMSO）中）。在-20°C储存在100μL等分试样中。
4. 使用10mM磷酸盐缓冲液（pH7.2），150mM NaCl，1mM MgCl 2，3μm制备X-Gal染色溶液MK ₄ [FeII（CN） ₆ ]，3mM K ₃ [FeIII（CN） ₆ ]和0.3％叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇。在黑暗中储存于4°C。
5. 用去离子水稀释30％的过氧化氢1:10制成3％过氧化氢溶液。
6. 通过将1片（10mg）DAB完全溶解在35mL新鲜PBT溶液中来制备3,3'-二氨基联苯胺（DAB）溶液。通过0.2μm注射过滤器过滤，并在-20°C下保存在910μL等分试样中。
   小心:将所有DAB废物处理在漂白剂中以摧毁民建联。
7. 用苹果汁制作蛋盘。向2L烧瓶中加入35g琼脂和1L去离子水。向1升烧瓶中加入33g蔗糖，2g tegosept和375mL苹果汁。通过高压灭菌30分钟使其熔化。允许两种溶液冷却至约60℃。通过搅拌结合并混合这些溶液。每60毫升培养皿倒入约11毫升的组合溶液。
8. 通过混合面包酵母制作酵母糊st进入去离子水（1:0.8比例）并储存在4℃。

胚胎收集（第1天）

1. 收集年轻的雌雄和雄蝇（5日以下），并保持1-2天，将它们保持在一个塑料烧杯笼中，里面装有少量的酵母糊（60毫米x 15毫米）。
2. 为了最佳收集晚期16期胚胎，在5点左右的时间内建立一个带有苍蝇（> 50）的瓶笼，让它们在25℃下孵育3小时。
3. 将苍蝇转移到新鲜的食物瓶中。
4. 用盖子关闭蛋盘，并在25℃下在潮湿的培养箱（约70％湿度）中将其倒置过夜。

3.免疫染色胚胎的制备（第2天）

1. 在上午10点20分左右将蛋白质加入1.8毫升PBT溶液中，并用棉签将其从板上松开，同时倾斜。
   注意:用cott轻轻地捣碎酵母糊在拭子上，溶解它，以防发现大量的胚胎。开始收集胚胎〜固定前约40分钟（约11:00 AM）。
2. 将胚胎从蛋板转移到1.5 mL微量管中，使用1 mL移液管吸头。
3. 允许胚胎沉淀并尽可能吸出PBT溶液。用1 mL PBT溶液冲洗胚胎两次。尽可能吸出PBT溶液。
4. 向管中注入1 mL 50％的漂白剂（ 即稀释在去离子水中），并通过在室温下（RT）将它们培养在营养器上3分钟来使胚胎脱钙。
   注意:这一步不会杀死被破坏的胚胎。
5. 让脱钙的胚胎沉淀，尽可能吸出50％的漂白剂，并用1 mL的PBT溶液冲洗胚胎3次。
6. 加入0.5mL庚烷，随后在约11:00 AM的室温下向管中加入0.5mL的4％多聚甲醛溶液。
7. 孵化在一个养分器上的胚胎在室温下15分钟。
8. 取出4％多聚甲醛溶液（底层）。
9. 加入0.5 mL 100％甲醇，通过剧烈摇动管30秒，使胚胎变细。
10. 除去庚烷（ 即顶层）。
11. 加入0.5 mL 100％甲醇，剧烈摇动管10秒。
12. 通过点击管子尽可能地吸出甲醇使胚胎沉降。用1 mL 100％甲醇冲洗胚胎，摇动不到10秒。
    注意:长期暴露于甲醇会破坏β-Gal活性。
13. 取出甲醇并用1 mL PBT溶液冲洗脱皮胚胎3次。

4.使用LacZ染色对胚胎进行基因分型（第2天）

1. 将1mL PBT溶液加入到管中，并将管在37℃的热块或水浴中孵育15分钟。
2. 孵育期间，放置X-Gal染色溶液（1 mL / tu在65℃在水浴中，直至变得多云。在37°C水浴中孵育。
3. 吸出PBT溶液，并向管中加入1 mL X-Gal染色溶液和20μLX-Gal底物。
4. 在37℃下孵育管，使其具有营养作用，直到蓝色沉淀物明显。
   注意:第2和第3个蓝色平衡器的孵育时间一般在2-4小时之内。
5. 取出X-Gal染色溶液，用1 mL RT PBT溶液冲洗胚胎3次。
6. 使用针头或镊子，用光解剖显微镜（1.6X-2.5X目标）手工分选所需基因型的胚胎（ 即未染色的白色胚胎）。
   注意:由于一些蓝色平衡剂，如CyO，肌动蛋白-LacZ和TM3，肌动蛋白 -LacZ，携带在肌动蛋白启动子控制下表达细菌β-Gal（LacZ）的转基因构建体，以无处不在的方式染成蓝色的胚胎含有蓝色平衡染色体的一或两个拷贝。因此，未染色的白色胚胎对于所需的致死等位基因是纯合的。

5.用抗Fasciclin II抗体对胚胎进行免疫染色（第2-3天）

1. 使用1 mL移液管吸头收集并转移所需基因型胚胎（ 即未染色的白色胚胎）至0.5 mL微量管。
   注意:在这个步骤中，胚胎可以根据形态学标准大致分期，包括角质层的分割模式和头尾的结构⁹ 。在头部退化期间，蛋放置后10至16小时，胚胎经历了最前段^9的显着减少。
2. 用0.4mL PBT溶液洗涤胚胎一次，并加入0.3mL封闭溶液（5％正常山羊血清和5％DMSO在PBT溶液中）。
3. 在室温下将营养物阻断15分钟。
4. 加入75μL抗Fasciclin II抗体，并在室温下孵育具有章动作用的管。
5. 用0.4mL PBT溶液洗涤胚胎4次，每次洗涤至少20分钟。
6. 加入含有山羊抗小鼠HRP抗体（2μg/ mL）的0.3mL封闭溶液（PBT溶液中的5％正常山羊血清），并将管子在室温下孵育过夜。
7. 用0.4mL PBT溶液洗涤胚胎6次，每次洗涤至少20分钟。
8. 向管中加入0.3mL DAB溶液。
   小心:戴上手套，将所有DAB废物/管/尖端放入漂白剂中。
9. 加入2μL3％过氧化氢，并在RT中将管子在黑暗中孵化，直到产生所需量的沉淀物。
   注意:1D4免疫组化的培养时间一般在0.5-1小时。
10. 用0.4mL PBT溶液洗涤胚胎4次。
    小心:取出DAB溶液，然后用移液管和二极管清洗前两次洗涤液把它们漂白掉。
11. 向管中加入0.2 mL安装的70％甘油/ PBS溶液，并在室温或4°C储存。
    注意:保持管远离光线。通过将胚胎置于90％甘油/ PBS溶液¹⁰中可获得更清楚的制剂。然而，比在70％甘油/ PBS溶液^10中清除的那些更容易解剖在90％甘油/ PBS溶液中清除的胚胎。

6.分期，分解，安装和成像胚胎（第4天）

1. 为了分期，将用70％甘油/ PBS平衡的胚胎转移到载玻片上。
2. 收集具有收敛于彼此接触或/并且具有细分为三个带的中肠的腹部节段7（A7），A8和A9 ISN神经的晚期16期胚胎。
   注意:1D4抗体染色的胚胎可以基于ISN和ISNb运动轴突的投影图案进行分期。退出CNS，A7，A8和A9 ISN之后晚期-16胚胎的rves会聚到彼此接触，随后发散到远离背部肌肉（ 图1A中的箭头）。然而，在中期16期胚胎中，A7 ISN神经与A8 / A9神经（ 图1B中的方括号）平行延伸。此外，两个半身中的A6 ISNb神经（垂直于腹侧肌）的投影轴与CNS纵向轴突束的后端（箭头和图1C中的一条线）大致对齐。这些形态学标准在不同的基因型之间有所不同。或者，胚胎可以基于肠道形态9,11进行分期。在阶段17之前，中肠具有心形形状，而中肠在阶段17 ¹²细分为三个带。
3. 解剖胚胎。
   1. 使用1米L注射器，将每个胚胎移出甘油滴，并将胚胎腹面朝上。在身体长度的1/4处切除前部，并且没有运动轴突的最后部区域。
   2. 使用针头探针，将终端胚胎移出甘油滴，滚动以将其背面朝上定位，并将其水平放置在野外。
      注意:当胚胎移出甘油滴时，与胚胎相关的一点甘油使其粘稠。
   3. 使用单个非常精细的钨针¹³沿背侧中线切割胚胎。在胚胎后端做一个小切口，然后继续将背部中线向前切割;相反方向的切割也很好。
   4. 使用针头探针，将中线切割的胚胎移入甘油滴，将其背面放置，并通过在腹侧（对角线）方向上展开每个体壁（2），将肠道从体壁分离.5X目标）。
      注意:确保背部中线完全切割，导致左右两侧体壁之间完全分开。
   5. 仔细将中线切割的胚胎从甘油滴中移出，然后使用细针探针（2.5X物镜）将身体壁上的两个皮瓣放在玻璃片上。
   6. 使用非常精细的钨针，通过将其推向侧面（5X物镜）从分离的胚胎中去除内部器官。
      注意:另一个类似的解剖程序的更详细的描述可以在网站上找到。
4. 为了安装，加入2-3μL70％甘油/ PBS溶液清洁，解剖的胚胎，并使用细针探针将其转移到新的载玻片上，将8μL70％甘油/ PBS溶液涂抹在其上中心（2.5X目标）。
5. 穿上盖玻片（18毫米x 18毫米）。用常规指甲油（也可以）密封盖玻片的边缘清晰或有色是好的）。
6. 根据制造商的说明，在差分干涉对比（DIC）光学显微镜下以高分辨率（20X，40X和63X浸油物镜）拍摄图像。
   注意:更好的可视化和表型特征，特别是对于ISNb运动轴突，可以通过使用63X油浸物镜来生产。

Results

神经发育期间运动轴突和目标肌肉之间的精确连接取决于在特定选择点的选择性轴突 - 轴突排斥和目标识别。在果蝇中 ，运动轴突之间的选择性排斥部分由第1类和第2类信号素（Semas）（包括Sema-1a，Sema-2a和Sema-2b）8,14,15,16,17,18的组合作用。因此， Sema-1a功能的丧失常常导致ISNb轴突在特定选择点处失效，导致其表现出异常浓厚的形态（ 图2C中的箭头）。在野生型胚胎中，至少有7只运动神经元延伸并使其轴突形成一个I形成的轴突SNb神经分支（ 图2A ）。当ISNb神经分支到达位于肌肉6和7之间的选择点时，两个轴突选择性地从主ISNb束起始并随后使肌肉6和7支配（ 图2B ）。在位于肌肉6,13和30之间的下一个选择点，另外三个运动轴突选择性地缩小以支配肌肉13,14和30（ 图2B<...

Discussion

运动轴突指导缺陷的细节通过DAB染色的胚胎的切片制备比通过荧光标记的激光扫描共焦显微镜更快，更准确。因此，固定和1D4染色的胚胎的切片制备最适合于指导提示分子的功能表征。指导线索包括网络，狭缝，信号素（Semas）和水母以及他们的同源受体在蠕虫，苍蝇和脊椎动物中具有进化上保守的作用。在作为狭缝受体的迂回（Robo）家族分子中， 果蝇 Robo在CNS 6,21中首先被确定为调解排斥引导功能。 Semas是一系列与plexin相关的受体复合物结合的指导分子。 Semas的轴突引导功能在蝗虫CNS ¹⁴中首次发现。随后，1号跨膜信号素Sema-1a在果蝇中被广泛表征 。 Sema-1a不仅作为plexin A的配体，而且作为未知配体的受体起着重要的作用，在胚胎神经发育期间的特定选择点，在轴突神经轴突排斥15,16,17,18（ 图2C ）。

当前协议可能会出现一些常见的故障排除步骤。首先，在步骤3.9-3.13中，如果在甲醇固定化过程中使用太多...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A7906
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	t-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇
16% 多聚甲醛溶液	Ted Pella	18505
氯化钠	Sigma-Aldrich	S5886
氯化钾	Sigma-Aldrich	P5405
磷酸氢二钠	Sigma-Aldrich	30435
磷酸氢钠 二元磷酸钠	Sigma-Aldrich	71500
X-Gal 底物	美国生物	X1000	X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷）
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	D4540
氯化镁	Sigma-Aldrich	M8266
六氰基铁酸钾（II）三水合	物 Sigma-Aldrich	P9387
六氰基铁酸钾（III）	Sigma-Aldrich	244023
过氧化氢	Sigma-Aldrich	216763
3,3'-二氨基联苯胺 四盐酸盐	Sigma-Aldrich	D5905
琼脂	US Biological	A0930
蔗糖	Fisher Scientific	S5-3
Tegosept （Methy 4-Hydroxybenzoate）	Sigma-Aldrich	H5501
培养皿 （60 mm）	康宁	430166
Tricon 烧杯	进口	B700-100	用于制作用于胚胎采集的塑料烧杯笼。
酵母	公司 Lesaffre	Saf 速溶酵母红
棉签（木制单尖棉 PK100）	VWR	14220-263
Eppendorf 管 （1.5 ml）	Sarstedt	#72.690
漂白剂	高乐氏公司	高乐氏
庚烷	Sigma-Aldrich	246654
甲醇	J.T. Baker	UN1230
正常山羊血清	Life Technologies	16210-064
抗束状蛋白 II 抗体	发育研究 杂交瘤细胞库	1D4 抗束状蛋白 II
山羊抗小鼠 HRP 抗体	Jackson 免疫研究	115-006-068	AffiniPure F（ab'）2 片段 山羊抗小鼠 IgG+IgM （H+L） （min X 胡， Bov， Hrs Sr Prot
甘油	Sigma-Aldrich	G9012
载玻片	Duran 组	235501403
盖玻片	Duran 组	235503104	18 x 18 毫米
1 ml 注射器	Becton Dickinson Medical（s）	301321
钨针	Ted Pella	#27-11	钨丝，ø0.13 毫米/6.1 米 （ø.005 英寸/20 英尺）
Nutator （Mini twister）	韩国科学	KO。VS-96TWS	或者，BD Clay Adams 品牌章动器 （BD 421125）