一个 体外 利用生物发光检测法测定乳腺上皮细胞中细胞昼夜节律。该方法采用哺乳动物细胞报告质粒，其在特定启动子调控下表达不稳定型荧光素酶。 PERIOD 2 基因启动子。该方法可适用于其他细胞类型，以评估器官特异性对昼夜节律的影响。
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摘要
摘要
昼夜节律是所有生物体中存在的一种基本生理过程，可调控从基因表达到睡眠行为等多种生物学过程。在脊椎动物中，昼夜节律由分子振荡器控制，该振荡器在视交叉上核（SCN；中枢起搏器）以及构成大多数外周组织的单个细胞中均发挥作用。更重要的是，夜间光照、环境应激源和/或毒性物质引起的昼夜节律紊乱与慢性疾病风险增加及衰老密切相关。识别能够干扰中枢和/或外周生物钟的因子，以及能够预防或减轻昼夜节律紊乱影响的因子，对于预防慢性疾病具有重要意义。尽管可以使用啮齿类动物模型来鉴定诱导或预防/减轻昼夜节律紊乱的暴露因素和化合物，但这类实验需要大量动物。体内研究还需要大量资源和基础设施，并要求研究人员通宵工作。因此，迫切需要建立一种适用于不同类型器官和疾病状态下细胞类型的体外系统，用于筛选环境中的昼夜节律干扰物和增强剂。我们构建了一种载体，该载体在人PERIOD 2基因启动子的调控下驱动真核细胞中不稳定化荧光素酶的转录。将该昼夜节律报告基因构建体稳定转染入人乳腺上皮细胞，并筛选出具有昼夜节律响应性的报告细胞，以建立体外生物发光检测方法。本文提供了一套详细的方案，用于建立并验证该检测方法。此外，我们还提供了概念验证实验的具体细节，证明本体外检测方法能够重现各种化学物质对细胞生物钟的体内效应。结果表明，该检测方法可适用于多种细胞类型，用于筛选环境干扰物以及昼夜节律的化学预防性增强剂。
引言
昼夜节律钟以大约24小时为周期，调控着从基因的昼夜表达到睡眠行为等多种生物学过程。流行病学研究强烈表明，轮班工作者（包括护士和机组人员）的昼夜节律长期紊乱会增加患乳腺癌和前列腺癌的风险1,2,3。啮齿类动物研究进一步证实了这一发现，暴露于持续光照、夜间光照或模拟时差的光照周期会增加肿瘤发生率并加速肿瘤生长4,5。基于人类和啮齿类动物研究的数据，国际癌症研究机构于2010年将轮班工作列为可能的人类致癌物（2A类）6。
此前，我们已证明单次致癌剂量的乳腺肿瘤特异性致癌物 N-亚硝基-N甲基脲（NMU）破坏了主要昼夜节律基因（CGs）的昼夜节律表达例如, Period 2, Per2）以及多个受昼夜节律调控的基因（CCGs），包括在靶向乳腺组织（而非肝脏）中关键的DNA损伤应答与修复（DDRR）基因。此外，重置这两种基因的昼夜节律性表达 Per2 并通过饮食化学预防方案使 DDRR 基因趋于正常 L甲基-硒代半....
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方案
1. 构建由PER2启动子驱动的不稳定化荧光素酶报告载体
- 购买定制的 pLS[hPER2P/rLuc/Puro 载体，该载体包含编码 rLuc 和人类 PER2 启动子片段（hPER2P，941 bp）位于位点之间 Sac 我与 下肢 III 位于多克隆位点区域17.
- 剪切人 PER2 启动子片段（hPER2P，941 bp）从载体中扩增出来。
- 加入2.5 µL限制性内切酶缓冲液，10 µL（180 ng）pLS[hPER2P/rLuc/Puro] 载体，以及 1 µ每微升各限制性内切酶，Sac I（10 单位/微升）µL）和 Hind III（10 单位/µL），加入无 DNA/RNA/核苷酸的微量离心管中。加入超纯水（10.5 µL）最多 25 µ用移液器轻轻吹打混匀。
- 在37℃下孵育 °在加热块中于 C 孵育 90 分钟。
- 运行全部体积（25 µ使用含0.0001%溴化乙锭（EtBr）的0.7%琼脂糖凝胶对限制性内切酶反应产物进行电泳，以分离hPER2P与载体。
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结果
昼夜节律生物发光报告载体：由人 PER2 启动子驱动的不稳定型荧光素酶变体表达
用于构建昼夜节律报告载体 pGL[hPer2P/Luc2P/Neo] 的 DNA 序列包含一段来源于人类 PER2 启动子的 941 bp 片段，首先对该序列中已知调控昼夜节律基因表达的调控元件进行了分析。生物信息学分析显示，在该启动子片段内存在三个不同的 Bmal1 结合位点（E-box）（CAT/CGTG）、两个昼夜节律转录增强位点（CCAATG）、两个 GC 盒以及一个转录起始位点（图 1）。因此，预期该报告载体能够反映昼夜节律基因的表达。
同步剂的优化
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讨论
在哺乳动物细胞中，生物钟的周期性由相互关联的转录/翻译反馈环路调控。Bmal1 与 Clock 或 Npas2 形成的异源二聚体通过结合核心时钟基因（CGs）以及众多时钟控制基因（CCGs）启动子区域的 E-box 元件来调控昼夜节律性转录，这些核心时钟基因包括 Per2 和 Cry4。随着 Per:Cry 异源二聚体在细胞内的积累，它们会经历翻译后修饰并被转运至细胞核，从而抑制 Clock:Bmal1 的转录活性。这一负反馈环路使核心时钟基因能够自我调控其转录，并建立 CGs 与 CCGs 的节律性表达模式23。尽管大多数哺乳动物细胞都具有内在的生物钟，但单个细胞中的生物钟可受到内在条件（例如，氧化还原电位）和外界环境刺激的同步调控24。体内（in vivo）的昼夜节律基因表达可由褪黑素同步，褪黑素是由松果体接收来自中枢起搏器（视交叉上核，SCN）的信号后分泌的一种激素。SCN 整合来自光照的信息，这些信息由视网膜中表达黑.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了2012年毒理学学会（SOT）-高露洁棕榄替代研究基金（M. Fang）和韩国动物与植物检疫署国际合作研究基金（M. Fang）以及美国国家环境健康科学研究所（NIEHS）基金P30ES005022（H. Zarbl）的支持。我们感谢德克萨斯大学休斯顿健康科学中心麦戈文医学院郑 Chen 博士的有益讨论，感谢Shao-An Juan先生在实验方面的协助，以及Nakata Kimi女士在文稿校对方面的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| pLS[hPER2P/rLuc/Puro] 载体 | SwitchGear Genomics | S700000 | 定制载体 |
| pGL4.18[Luc2P/Neo] 载体 | Promega | 9PIE673 | 不稳定型荧光素酶表达载体 |
| T4 DNA连接酶 | Invitrogen | 15224041 | 用于亚克隆 |
| TOPO TA 克隆试剂盒 | Invitrogen | K4500-02 | 使用 One Shot TOP10 化学感受态 E. coli |
| Sac I | New England BioLabs | R0156S | 限制性内切酶 |
| Hind III-HF | New England BioLabs | R3104S | 限制性内切酶 |
| CutSmart 缓冲液 | New England BioLabs | B7204S | 限制性内切酶缓冲液 |
| DNA凝胶回收试剂盒 | Qiagen | 28704 | 从琼脂糖凝胶中纯化DNA片段 |
| PCR 纯化试剂盒 | Qiagen | 28104 | DNA 纯化 |
| LB Miller改良法 | TEKNOVA | L8600 | 用于转化后的 E. Coli 培养物 |
| LB 琼脂平板 | TEKNOVA | L1902 | 用于白/蓝筛选 |
| QIAprep 脱色微量制备试剂盒 | Qiagen | 27104 | 质粒DNA提取 |
| EndoFree 质粒大提试剂盒 | Qiagen | 12362 | 质粒DNA提取 |
| FuGene HD | Promega | E2311 | 转染试剂 |
| Opti-MEM 低血清培养基 | Invitrogen | 31985-062 | 用于转染 |
| MCF10A 细胞系 | 美国典型培养物保藏中心 | CRL-10317 | 乳腺上皮细胞 |
| MEGM BulletKit | Lonza | CC-3150 | 乳腺上皮细胞生长培养基 |
| MEBM | Lonza | CC-3151 | 乳腺上皮基础培养基 |
| MEGM SingleQuot 试剂盒 | Lonza | CC-4136 | 补充剂 &与生长因子 |
| 试剂盒 | Lonza | CC-5034 | 传代培养试剂 |
| D-PBS（10倍浓度） | Sigma | D1408 | 洗涤培养皿中的细胞 |
| 超纯蒸馏水 | Invitrogen | 10977 | 稀释10倍浓度的D-PBS |
| 组织培养皿（35 mm） | BD/Falcon | 353001 | 适用于LumiCycle的细胞培养皿 |
| 硅脂 | Fisher | NC9044707 | 用于密封含有记录培养基的培养皿 |
| 圆形盖玻片 | 哈佛生物科学 | 64-1500 (CS-40R) | 用于密封含有记录培养基的培养皿 |
| 霍乱毒素 | Sigma | C8052 | 生长培养基补充剂 |
| G418硫酸盐（Geniticin） | Invitrogen | 10131035 | 用于筛选稳定转染细胞的抗生素 |
| 氨苄青霉素 | Sigma | A9393 | 用于菌落筛选 |
| Forskolin | Sigma | F6886 | 同步代理 |
| 褪黑素 | Sigma | M5250 | 同步代理 |
| 地塞米松 | Sigma | D4902 | 同步代理 |
| 马血清 | Sigma | H1138 | 同步代理 |
| D-荧光素钠盐 | Invitrogen | L2912 | 荧光素酶底物 |
| IC261 | Sigma | 10658 | 昼夜节律干扰物的阳性对照 |
| 甲基亚硝基脲（NMU） | Sigma | N1517 | 乳腺特异性致癌物 |
| 甲基硒代半胱氨酸（MSC） | Sigma | M6680 | 有机硒（化学预防剂） |
| EX527 | Sigma | E7034 | SIRT1特异性抑制剂 |
| Cambinol | Sigma | C0494 | SIRT1 &和 SIRT2 抑制剂 |
| NanoDrop 分光光度计 | 赛默飞世尔科技 | NanoDrop 8000 | 定量核苷酸 |
| GeneAmp PCR System 9700 | 应用生物系统公司 | N805-0200 | 用于分子生物学实验 |
| CO2 培养箱 | NAPCO | 8000 系列 DH | 在37℃、5% CO2条件下进行细胞培养 °C |
| 带制冷功能的台式离心机 | Eppendorf | 5430R | 用于分子生物学实验 |
| 带摆桶转子的离心机 | Eppendorf | 5810 R | 用于细胞培养 |
| 倒置显微镜 | 尼康 | 80124 | 相差可选 |
| 组织培养罩 | Labconco | II 级 A2 | BSL-2 认证 |
| LumiCycle 32 | Actimetrics | 暂无可用内容 | 发光检测器 |
参考文献
- Akerstedt, T., et al. Night work and breast cancer in women: a Swedish cohort study. BMJ Open. 5 (4), e008127(2015).
- Parent, M. E., El-Zein, M., Rousseau, M. C., Pintos, J., Siemiatycki, J. Night work and the risk of cancer among men. Am J Epidemiol. 176 (9), 751-759 (2012)....
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