本文描述了一种从人类尸检脑组织中富集去垢剂不溶性蛋白聚集体的简化分级分离方案。
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摘要
摘要
本研究描述了一种简化的单步分级分离方案，用于从人类死后脑组织中富集去垢剂不溶性蛋白聚集体。离子型去垢剂N-月桂酰肌氨酸钠（sarkosyl）可有效溶解脑组织中天然折叠的蛋白质，从而实现对多种神经退行性蛋白病（如阿尔茨海默病（AD）、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症及朊病毒病）中去垢剂不溶性蛋白聚集体的富集。将人对照组与AD患者的死后脑组织在sarkosyl存在下进行匀浆处理，并通过超速离心沉淀，以富集包含病理学磷酸化tau蛋白在内的去垢剂不溶性蛋白聚集体，其中磷酸化tau蛋白是AD中神经原纤维缠结的核心组分。Western印迹结果显示，在对照组和AD脑组织中，聚集态磷酸化tau蛋白与去垢剂可溶性蛋白早期内体抗原1（Early Endosome Antigen 1, EEA1）的溶解性存在差异。蛋白质组学分析还显示，与对照组相比，AD脑组织的sarkosyl不溶性组分中富集了β-淀粉样蛋白（Aβ）、tau蛋白、snRNP70（U1-70K）以及载脂蛋白E（APOE），该结果与既往组织分级分离策略一致。因此，这一简便的富集方案适用于多种实验应用，范围涵盖Western印迹、功能性蛋白共聚集检测以及基于质谱的蛋白质组学分析。
引言
神经退行性疾病，例如阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、亨廷顿病（HD）、肌萎缩侧索硬化症（ALS）以及密切相关的小体病，属于蛋白质病变，其特征是大脑中逐渐积累无法被去垢剂溶解的蛋白质聚集体，并伴随认知功能下降。1,2 这一共同的病理特征被认为在这些神经退行性疾病的病因学和病理生理学中起着核心作用。2 这些聚集体通常由聚合的淀粉样纤维组成，纤维由错误折叠蛋白的重复单元构成，具有交叉β片层结构 β-结构1,2,3,4 从生物化学角度看，淀粉样蛋白聚集体对化学或热变性及溶解具有高度抗性，3 这给通过传统生物化学技术进行纯化、分析和研究带来了独特的挑战。2,5,6,7,8,9,10,11 毫不意外，不溶于去垢剂的蛋白质组分已成为研究涉及错误折叠蛋白积聚的神经退行性疾病病理生理学的重点。6,12,13,14
生化分级分离技术常用于从死后脑组织匀浆中富集去垢剂不溶性组分。6,12,13,14 最常用的方法之一是使用强度逐步增强的缓冲液和去垢剂对组织匀浆进行连续提取，随后通过超速离心分离可溶性和不溶性组分。一种常用的连续分级分离方案6,14 包括将冷冻组织样本在无去垢剂的低盐（LS）缓冲液中匀浆，然后对所得的不溶性沉淀依次用含有高盐、非离子型去垢剂、高蔗糖、离子型去垢剂，最后用变性剂（如尿素）的缓冲液进行提取。6,14 这类连续分级分离方案的一个明显缺点是完成整个流程需要耗费大量时间和人力。包括匀浆和超速离心在内，典型的五步分级分离流程可能需要数小时甚至数天才能完成。4,6,7,10,15,16,17,18 此外，由于许多病理性的蛋白聚集体只有在最剧烈的条件下才可溶解19,20，因此所产生的大部分组分价值有限。因此，使用高盐浓度和非离子型去垢剂的较温和分级步骤在很大程度上是冗余的。
既往研究表明，离子型去垢剂N-月桂酰肌氨酸钠（sarkosyl）是简化单步去垢剂分级方案的极佳选择。5,6,12,13,14,21,22,23 作为一种变性去垢剂，sarkosyl的强度足以溶解脑组织中绝大多数天然折叠的蛋白质，但不会溶解由β-淀粉样蛋白（Aβ）6,11、磷酸化tau蛋白（pTau）6、TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）14、α-突触核蛋白12,13、朊病毒蛋白（scrapie）23 或U1小核核糖核蛋白（U1 snRNPs，如U1-70K）5,21,22 组成的错误折叠蛋白聚集体。由于sarkosyl的变性强度低于广泛使用的阴离子去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS），因此能够保留一些对SDS处理敏感、较不稳定的错误折叠蛋白聚集体的寡聚形式。9
此前，我们描述了一种简化的去垢剂分级分离方案，其结果可与更为繁琐的逐级分级分离方法相媲美。5 通过省略严格性较低的分级步骤，我们建立了一种简便的单步分级分离方案，用于富集死后人脑组织中去垢剂不溶性的蛋白质聚集体。5 本文所述的详细方案适用于多种实验应用，范围涵盖蛋白质印迹、基于质谱的蛋白质组学，以及功能性蛋白质错误折叠和聚集种子检测等。5,6,21
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方案
伦理声明：所有脑组织均来自埃默里大学阿尔茨海默病研究中心（ADRC）脑库。人死后组织均在适当的机构审查委员会（IRB）规程下获取。
1. 匀浆与分级分离
- 组织选择
注意：从埃默里大学阿尔茨海默病研究中心（Emory ADRC）脑库中选取健康对照（Ctl）和经病理确诊的阿尔茨海默病（AD）病例的冷冻尸检额叶皮层组织（n=2）。根据阿尔茨海默病登记联盟（Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease）半定量评分标准对淀粉样斑块分布进行尸检后神经病理学评估24，而神经原纤维缠结病变则依据 Braak 分期系统进行评估16。- 获取健康对照（Ctl）和经病理确诊的 AD 病例的冷冻尸检脑组织。使用干冰容器、镊子和剃刀刀片，在已去皮的 disposable 称量舟中，从每个组织样本中切取约 250 mg 的灰质组织，注意防止组织解冻。记录每份待均质化组织的重量。
- 使用镊子和剃刀，通过肉眼观察确定外层灰质与内层白质的交界处，切取约 250 mg 的灰质组织。避免白质，更重要的是避开大血管、出血区域、软脑膜或蛛网膜。在切割过程中通过快速操作，并频繁将装有脑组织的称量舟放回含干冰的聚苯乙烯容器中，以保持组织处于冷冻状态。
- 使用分析天平记录从每块冷冻组织中切取的灰质的确切重量。计算用于 Dounce 均质化的低盐（LS）缓冲液（见表 1）所需体积（5 mL/g 或 20% w/v）。
- 配制 10 mL 含 1× 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液的低盐（LS）缓冲液，并置于冰上预冷。
- 将已称重的组织及称量舟从干冰中取出，在组织开始解冻时将其切成约 2 × 2 mm 的小块。转移至冰上预冷的 2 mL Dounce 均质化管中。
- 加入 5 mL/g（20% w/v）的冰冻低盐（LS）缓冲液，含 1× 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液。
- 在冰上使用高间隙研杵 A 约 10 次，低间隙研杵 B 约 15 次，对脑组织进行均质化。
- 使用玻璃巴斯德移液管将全部均质液转移至 2 mL 聚丙烯管中。在管上标记“TH”（总均质液）、组织病例编号及均质液体积。 取 0.8 mL 分装至已标记的 1.5 mL 管中。多余的均质液可同样分装并储存于 -80 °C。
- 向每份 0.8 mL 分装的均质液中分别加入 100 µL 的 5 M NaCl 和 10%（w/v）Sarkosyl，使其终浓度分别为 0.5 M 和 1% w/v。通过倒置充分混匀各管，并在冰上孵育 15 分钟。在管上标记 "TH-S"（总均质液-Sarkosyl），表示均质液处于 Sarkosyl 缓冲液中（表 1）。
- 在冰上使用微头探针，以 30% 振幅（最大强度 = 40%）对每管进行三次、每次 5 秒的超声处理。
- 使用双辛可宁酸（BCA）法25测定均质液的蛋白浓度。
注意：以每克组织加入 5 mL LS 缓冲液制备的 TH-S 均质液，其平均蛋白浓度为 15–20 mg/mL。均质液可立即进行分级分离，或储存于 -80 °C 待用。 - 使用含 1× 蛋白酶和磷酸酶抑制剂的冰冻 Sark 缓冲液（表 1），将 TH-S 均质液稀释至 10 mg/mL。
- 将每份 TH-S 均质液中的 5 mg 蛋白（0.5 mL）转移至 500 µL 聚碳酸酯超速离心管中，并用 Sark 缓冲液配平。将管子装入预冷的转子中，在 4 °C 下以 180,000 × g 离心 30 分钟。将 Sarkosyl 可溶性上清液（S1）转移至 1.5 mL 管中，并储存于 -80 °C。
注意：（可选洗涤步骤）向含有去污剂不溶性组分（P1）的超速离心管中加入 200 µL Sark 缓冲液，并使用 200 µL 移液枪头将沉淀（P1）从管底刮下。 - 将倒置的管在微量离心机上短暂脉冲离心 2–3 秒（≤2,500 x g），使沉淀（P1）和缓冲液转移至下方的 1.5 mL 管中。通过反复吹打，用 Sark 缓冲液重悬不溶性沉淀（P1），确保沉淀完全分散。
- 配平后，在 4 °C 下以 180,000 × g 再次离心 30 分钟。
- 弃去可选的洗涤上清液（S2），将 Sarkosyl 不溶性沉淀（P2）在含 1× PIC（蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液）的 50–75 µL 尿素缓冲液（表 1）中于室温孵育 30 分钟，以溶解沉淀。
注意：使用前将尿素缓冲液升温至室温，以避免 SDS 沉淀。对于对去污剂敏感的应用，可从尿素缓冲液中省略 SDS，并在用尿素缓冲液重悬前，考虑用低盐缓冲液洗涤不溶性沉淀（P2）。 - 将重悬的沉淀（P2）转移至 0.5 mL 管中，使用微头探针在 20% 振幅（最大强度 = 40%）下进行短暂（1 秒）超声处理，以完全溶解沉淀。
- 使用 BCA 法测定 Sarkosyl 可溶性（S1）和不溶性（P2）组分的蛋白浓度。可立即使用这些组分，或储存于 -80 °C 待用。
2. 免疫印迹
- 蛋白质印迹法
注意：Western印迹实验按照先前报道的方法进行，略有修改。5,10- 制备40 µg的总匀浆（TH-S）、sarkosyl可溶性（S1）和sarkosyl不溶性（P2）组分样品，溶于含5 mM TCEP（pH 7）的1X Laemmli SDS-PAGE上样缓冲液中。95 °C孵育5分钟。
- 将样品上样至预制的10孔4-12% Bis-Tris SDS-PAGE凝胶。首先以80 V电泳1厘米（约10分钟），然后以120 V继续电泳（约60分钟），直至示踪染料迁移至凝胶底部。
- 使用新的剃须刀片和凝胶刀切开预制胶盒。用新的剃须刀片小心切除梳齿以及凝胶的最底部。
- 将不溶性沉淀（P1）用 200 µl 含 1x PIC 的 sarkosyl 缓冲液重悬，通过移液器反复吹打混匀。
- 使用印迹仪通过干转法将蛋白转移至0.2 µm硝酸纤维素膜（见材料表）。
- 用不含 Tween 20 的封闭缓冲液（BB）封闭膜 30 分钟，随后用含 0.05% Tween 20 的封闭缓冲液（BB/T）封闭 30 分钟。封闭后，用 TBS/T（0.1% Tween 20）冲洗膜 5 分钟，以去除多余的封闭缓冲液。
- 在BB/T缓冲液（含0.05% Tween 20）中配制初级抗体pT231、Tau-2（全tau）、AT8和EEA1的1:1,000稀释液。
- 4 °C 条件下，用一抗溶液孵育膜过夜，并进行圆周振荡。用 TBS/T 溶液冲洗膜，每次 15 分钟，共 3 次。
- 在黑暗条件下，于室温下将膜与1:20,000稀释的荧光标记近红外二抗溶液（溶于BB/T缓冲液）在摇床上孵育60分钟。随后用TBS/T缓冲液漂洗膜3次，每次10分钟，再用TBS缓冲液漂洗2次，每次5分钟。
- 使用红外成像系统在适当的激发波长下扫描膜例如 700 nm（红色通道）用于红外染料680标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗，800 nm（绿色通道）用于红外染料790标记的驴抗兔IgG（H+L）二抗。
- 使用成像软件按照制造商说明书定量信号强度并进行密度测定，确保自动背景设置为对整个背景取平均值。
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结果
采用简化的单步肌氨酸钠（sarkosyl）分级分离法，从对照组和阿尔茨海默病（AD）尸检脑组织中富集去垢剂不溶性蛋白聚集体（图1）。将TH-S、S1、S2和P2各组分中的蛋白质通过SDS-PAGE分离后，先用考马斯亮蓝固定液缓冲液固定15分钟，再用考马斯亮蓝G-250染色液轻柔染色。由于S2组分中蛋白含量极低，无法检测（见1.1.14），因此重悬步骤为可选操作。 Western印迹分析（图2A 和 B）明确显示，在AD脑组织中，病理性高分子量磷酸化tau蛋白聚集体为肌氨酸钠不溶性，仅有极少量pTau保留在肌氨酸钠可溶性组分中。5,6,7,
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讨论
本文介绍并讨论一种简化的单步去垢剂分级方案，该方案适用于多种实验应用，包括基于质谱的蛋白质组学分析、功能性蛋白质错误折叠检测以及蛋白质印迹（Western blotting）等。5,6,7,10 该方法在研究神经退行性蛋白病（如阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症、亨廷顿病、朊病毒病以及各类tau蛋白病）时可能最为有效。与原始的五步连续分级方法相比，该单步操作可在一天内完成，并能获得极为相似的结果。5,6,7,9,14,
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢埃默里大学神经病学系的 Jim Lah 博士和 Allan Levey 博士提供的有益评论和建议。本研究部分由加速医学合作伙伴计划资助（U01AG046161-02）、埃默里阿尔茨海默病研究中心（P50AG025688）以及美国国家衰老研究所资助（R01AG053960-01）支持，资助对象为 N.T.S。本研究还部分得到了埃默里神经科学 NINDS 核心设施资助项目（P30NS055077）中神经病理学核心的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物，无EDTA（100倍浓缩液） | 赛默飞世尔科技 | 78441 | 蛋白酶 &磷酸酶抑制剂混合物 |
| 超声破碎仪系统（超声波处理仪） | Fisher Scientific | FB505110 | 微尖超声破碎仪 |
| Optimax TLX 超速离心机 | 贝克曼库尔特 | 361545 | 冷冻超速离心机 |
| TLA120.1 转子 | 贝克曼库尔特 | 362224 | 超速离心机转子 |
| 500 μl（8 × 34 mm）聚碳酸酯管，厚壁 | 贝克曼库尔特 | 343776 | 用于TLA120.1转子的超速离心管 |
| 4X SDS上样缓冲液 | 自制 | N/A | SDS-PAGE |
| 中性 pH 的 TCEP 溶液 | 赛默飞世尔科技 | 77720 | 还原剂 |
| (TBS) 封闭缓冲液 | 赛默飞世尔科技 | 37542 | 封闭缓冲液 |
| TBS 封闭缓冲液 + 0.05% Tween 20 | 赛默飞世尔科技 | 37543 | 封闭缓冲液和抗体稀释液 |
| 4-12% Bolt Bis-Tris Plus 凝胶，10 孔 | 赛默飞世尔科技 | NW04120BOX | 预制SDS-PAGE凝胶 |
| MES SDS电泳缓冲液（20X） | 赛默飞世尔科技 | B0002 | SDS-PAGE电泳缓冲液 |
| N-月桂酰肌氨酸钠盐（Sarkosyl） | Sigma Aldrich | L5777-50G | 去垢剂 |
| 抗Tau-2（泛tau）抗体 | Chemicon | MAB375 | 抗体 |
| 抗磷酸化苏氨酸231 Tau抗体 | Millipore | MAB5450 | 抗体 |
| 抗磷酸化丝氨酸202和苏氨酸205 Tau蛋白抗体（AT8） | 赛默飞世尔科技 | MN1020 | 抗体 |
| 抗早期内体抗原1（EEA1）抗体 | abcam | ab2900 | 抗体 |
| Alexa Fluor 680 山羊抗小鼠 IgG（H+L）二抗 | 赛默飞世尔科技 | A21058 | 抗体 |
| Alexa Fluor 790 驴抗兔 IgG（H+L）二抗 | 赛默飞世尔科技 | A11374 | 抗体 |
| iBlot2 干式转膜系统 | 赛默飞世尔科技 | IB21001 | 凝胶转移 |
| iBlot2 转膜垫片，硝酸纤维素，小型 | 赛默飞世尔科技 | IB23002 | 凝胶转移 |
参考文献
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