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新生小鼠缺氧缺血性脑损伤模型中的神经行为学评估

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DOI：

10.3791/55838

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2017年11月24日

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1Department and Research Institute of Rehabilitation Medicine, Yonsei University College of Medicine, 2Brain Korea 21 PLUS Project for Medical Science, Yonsei University, 3Department of Rehabilitation Medicine, Yonsei University Wonju College of Medicine, 4Rehabilitation Institute of Neuromuscular Disease, Yonsei University College of Medicine, 5Graduate Program of NanoScience and Technology, Yonsei University

本文内容

摘要

我们对出生后7至10天的CD-1小鼠幼鼠进行单侧颈动脉阻断，以建立新生儿缺氧缺血（HI）模型，并研究HI脑损伤的影响。我们将这些小鼠的神经行为功能与未手术的正常小鼠进行了比较研究。

摘要

我们对 CD-1 小鼠进行单侧颈动脉闭塞以建立新生鼠缺氧缺血（HI）模型，并通过比较这些小鼠与未手术对照组小鼠的神经行为功能，研究新生鼠 HI 脑损伤的影响。即， 正常）小鼠。研究期间，采用Rice-Vannucci方法诱导出生后7至10天（P7-10）小鼠发生新生儿缺氧缺血性脑损伤。通过单侧颈总动脉结扎并暴露于低氧环境（8% O₂）对幼鼠实施缺氧缺血（HI）手术。2 和 92% N2 90分钟）。术后一周，通过半透明的颅骨肉眼观察受损脑组织，并根据是否存在损伤（"无皮质损伤" 组）或存在（"皮质损伤" 皮质损伤（例如右侧大脑半球损伤）的分组。在第6周进行以下神经行为学测试，以评估认知和运动功能：被动回避任务（PAT）、梯子行走实验和抓力测试。这些行为学测试有助于确定新生儿缺氧缺血性脑损伤的影响，并已被用于其他神经退行性疾病的小鼠模型研究。本研究中，新生儿缺氧缺血性脑损伤小鼠表现出与右侧大脑半球损伤相对应的运动功能缺陷。行为学测试结果与人类新生儿缺氧缺血性脑损伤患者（如脑瘫或新生儿卒中患者）所观察到的功能缺陷具有相关性。本研究建立了一种新生儿缺氧缺血性脑损伤小鼠模型，与未手术小鼠相比，该模型表现出不同程度的运动功能障碍和认知损害。本研究为缺氧缺血性小鼠模型提供了基础信息。磁共振成像（MRI）图像展示了不同表型，并根据运动和认知测试结果按脑损伤严重程度进行分类。

引言

新生儿缺氧缺血性脑损伤发生在婴幼儿早期（大约每1,000名儿童中有2例）1,2,3,4,5。关于新生儿缺氧缺血性脑损伤的研究具有重要意义，采用已建立的新生儿缺氧缺血性脑损伤小鼠模型有助于开展针对该病的体内临床前研究。

传统的缺血缺氧（HI）模型通常用于成年大鼠6。对于新生动物模型，通常在出生后第7天（P7）的大鼠中采用Rice-Vannucci方法7,8。然而，尽管大鼠和小鼠同属啮齿类动物，两者仍存在一定的差异9,10。因此，我们基于既往研究，在P7-10的CD-1乳鼠中采用了改良的Rice-Vannucci方法；这些研究表明，P7-10阶段小鼠脑内存在未成熟的少突胶质细胞，这一时期对应于人类足月新生儿（P0）的脑发育阶段11,12。新生小鼠缺血缺氧模型是通过对P7-10乳鼠进行单侧颈总动脉结扎，并将其暴露于含8%氧气的低氧环境中而建立的。

接受手术处理的小鼠右侧半球后外侧区域表现出不同程度的脑部损伤。为识别认知与运动功能缺陷，采用基于被动回避实验、梯子行走实验和抓力实验的神经行为学评估方法。未手术组与手术组之间的差异（即， 正常小鼠和HI小鼠被进行了分析。本研究提供了关于HI小鼠模型的基础信息。MRI图像展示了不同表型，根据运动和认知测试结果对脑损伤严重程度进行分类。

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方案

所有动物均饲养于标准笼具（27 × 22.5 × 14 cm）中3) 在获得实验动物管理和使用评估与认证协会（AAALAC）认证的设施中饲养，并自由供应食物和饮水 随意 在12小时光照/12小时黑暗交替循环条件下饲养。作者遵循动物保护法规，实验程序经延世大学医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC编号：2010-0252；2013-0220）批准。

1. 新生儿缺氧缺血性脑损伤的小鼠模型

  1. 使用异氟烷麻醉幼鼠。
    1. 将幼鼠（少于5只）放入麻醉盒中，并盖上盖子。
    2. 打开麻醉系统，持续约15分钟；使用台式麻醉机调节气体和异氟烷。将氧气流量计调节至1.5 L/min，异氟烷蒸发器调节至3-5%，用于诱导麻醉。
    3. 15分钟后，将异氟烷蒸发器调节至1-2%，用于维持麻醉状态。
  2. 将完全麻醉的幼鼠置于解剖显微镜下（腹部朝向研究人员），并用胶带固定。
  3. 使用灭菌剪刀在颈部做约0.7 mm的切口。
  4. 使用灭菌镊子小心去除脂肪组织，暴露单侧右侧颈动脉。
  5. 用5-0可吸收缝线结扎单侧右侧颈动脉。
  6. 用5-0缝线缝合颈部切口。
  7. 术后将每只幼鼠放入37 °C的温控低氧舱中恢复1小时。不要关闭舱盖。
  8. 手术1小时后，当幼鼠完全清醒时，关闭低氧舱盖，并降低气体浓度以建立低氧环境（8% O2 和 92% N2）。
  9. 低氧处理90分钟后，将幼鼠放回笼中。
  10. 脑缺血损伤一周后，重复步骤1。
    1. 麻醉后，使用灭菌剪刀和镊子在头皮上做切口，以观察右半球后外侧区域的脑损伤情况。
      注：该处理在幼鼠中诱导低氧。所有小鼠脑损伤的存在与否及程度可通过半透明颅骨肉眼观察评估。根据变色区域（即脑损伤）的大小或体积，将幼鼠分组。若无可见皮质损伤，则归入“无皮质损伤”组；若存在可见皮质损伤（即右半球出现病灶），则归入“皮质损伤”组。由于分组在手术后一周进行，因此在处死时若脑样本形态学特征更明确，可对分组进行调整1,2,3,4。

啮齿类动物手术；脑部与MRI图像；氧气监测；神经科学实验；分析结果。
图1：小鼠新生儿缺氧缺血性脑损伤模型。
(A) 一只出生七天的小鼠接受了手术，其右侧单侧颈总动脉被结扎。(B) 将幼鼠置于含8% O2 和92% N2 的低氧舱中，持续90分钟。(C, D, E) 具有新生儿缺氧缺血性脑损伤的小鼠脑组织表现出不同程度的损伤，并根据损伤程度进行分类。在第14周获取脑组织，观察病灶。(C) 被归类为“无皮质损伤”的脑组织图像；(D) 和 (E) 均被归类为“皮质损伤”组。(F, G, H) 分别为 (C)、(D) 和 (E) 小鼠的代表性MRI图像。(F) 海马区的损伤以黄色箭头标示，(G) 和 (H) 中右半球的病灶也以黄色箭头标示。比例尺 = 1 mm 请点击此处查看该图的放大版本。

2. 新生儿行为学测试

注意：此处的行为学测试在 6 周龄时进行。

  1. 被动回避实验。
    注意：为基于学习和对厌恶刺激的回避来评估记忆功能，应进行两室穿梭被动回避实验13,14,15,16。
    1. 将小鼠放入PAT装置的有机玻璃穿梭箱（41.5 × 21 × 35 cm3）的明亮区。
    2. 30秒后打开闸门，记录小鼠进入暗室所需的时间（最长300秒）。
    3. 当小鼠四肢完全进入暗室后，关闭闸门。
    4. 给予足底电刺激（0.5 mA）持续2秒，然后将小鼠放回笼中。
    5. 在电刺激24小时后，将小鼠重新放回明亮区。
    6. 小鼠完全置于明亮区10秒后打开闸门，记录小鼠进入暗室的潜伏时间（最长300秒）。
  2. 梯子行走实验。
    注意：梯子横杆行走实验通过结合熟练行走的定性和定量分析，可有效区分运动功能的细微障碍17,18。
    1. 打开摄像机。
    2. 将小鼠放置在梯子的起始板上，并立即开始录像。
    3. 录像时应聚焦于小鼠的四肢。
    4. 当小鼠触碰到梯子末端的最后一个板时停止录像。重复往返行走四次。
    5. 分析录像记录，并手动统计每只前肢的打滑次数，方法如下：
      1. 在计算机上以慢速（0.1倍速）播放录像，手动计数步数。
  3. 抓力测试。
    注意：抓力测试使用抓力计进行，该仪器包含推拉式应变仪。
    1. 将抓力计固定在丙烯酸板上。
    2. 将小鼠置于丙烯酸板上并握住其尾巴。
      1. 移动握持尾巴的手，使小鼠能够接触并抓住仪器的金属丝。
    3. 进行多次测试，直到小鼠抓住直径为2 mm的三角形金属丝；仪器将自动以克为单位记录最大拉力。
      注意：分析时采用三次测试的最大拉力平均值19,20,21。

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结果

所有数据均以均值 ± 均值标准误（SEM）表示。两组间变量的比较采用 SPSS 统计软件进行独立样本或配对 t 检验。当 p 值 <0.05 时，认为差异具有统计学显著性。

具有新生儿缺氧缺血性（HI）脑损伤的脑组织表现出不同程度的损伤严重性，并据此进行分类（图1C-E）。脑组织于第14周获取，并对病灶进行可视化观察。图1C 显示被归类为“无皮质损伤”的脑组织，图1D 显示被归类为轻度损伤的脑组织，而 图1E 显示严重受损的脑组织。其中（D）轻度损伤和（E）重度损伤均被归入“皮质损伤”组。HI手术后，对13周...

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讨论

在本研究中，我们于新生P7-10天CD-1小鼠中诱导了缺血缺氧性脑损伤，并确定了与之相关的认知和运动功能缺陷。在该操作过程中，单侧右颈动脉的阻断至关重要。在此步骤中，动脉可能受损或撕裂，大多数发生动脉撕裂的幼鼠会死亡。相反，如果研究人员结扎了其他静脉而非单侧右颈动脉，则幼鼠脑部仅出现轻微损伤，且无法观察到显著的表型24。

本研究中，由于小鼠个体差异及病灶体积不同，将脑组织分为若干组（图1C-H）。部分脑损伤较轻的小鼠仅海马区受损，而皮质区域未受影响（图1F）13。相反，部分脑损伤严重的小鼠右侧大脑半球大部分缺失，且皮质区域严重受损（图1G和H）。因此，研究人员应在手术后一周确定病灶的大小19,25。由于脑组织通过MRI扫描进行评估，病灶体积和大小的判定更为可靠。因此，我们...

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致谢

本研究由韩国国家研究基金会（NRF-2014R1A2A1A11052042；2015M3A9B4067068）、韩国科学技术部以及韩国健康技术研究与发展项目资助。&D 项目（HI16C1012），韩国保健福祉部 &韩国保健福祉部以及延世大学医学院“东和”教师研究援助项目（6-2016-0126）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
缺氧舱Jeung Do Bio & Plant CoExperimental Builder
PAT装置Jeung Do Bio & Plant CoExperimental Builder
梯状横杆行走装置Jeung Do Bio & Plant CoExperimental Builder
SDI抓力强度系统San Diego Instruments Inc.
抓力计Ugo Basile47200
Harvard Apparatus Fluovac麻醉系统 Harvard Apparatus
麻醉箱丙烯酸箱
I-Fran液体（异氟烷）Hana Pharm. Co., Ltd.全身麻醉药（异氟烷 100ml）
CD-1小鼠Orient Co., Ltd.
蓝色尼龙单丝不可吸收缝合线 5-0 50cmAilee Co., Ltd.NB 521
IBM SPSS StatisticsIBMVer. 23

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