非破坏性19F时域核磁共振技术测定含氟药物产品中氟含量的应用与方法

摘要

本文介绍了一种简单且非破坏性的技术，利用低场氟-19（¹⁹F）时域（TD）核磁共振（NMR）测定含氟药物制剂中活性药物成分的平均含量。该技术可应用于制药行业中药物的研发与生产过程。

摘要

本文介绍了我们课题组开发的一种利用低场氟-19（¹⁹F）¹⁹F) 时域（TD）核磁共振（NMR）用于测定氟化药物在制剂形式（如片剂或胶囊）中的平均含量。该方法针对氟化药物具有特异性，因其仅检测氟元素含量，可避免不含氟的辅料产生的干扰。采用低场核磁共振测定氟化药物中活性成分含量具有以下优势： ¹⁹F TD-NMR 与高场核磁共振 ¹⁹固态核磁共振（SS NMR）的优点在于方法简单、成本低廉，以及该技术具有非破坏性，所有样品均可完整回收。例如， 粉末、片剂和胶囊），使该技术适用于任何实验室，且成本低廉。

我们已使用市售的三种含氟药物产品——西那卡塞、兰索拉唑和环丙沙星，剂量范围为15至500 mg，对该方法进行了测试。通过低场¹⁹F时域核磁共振（TD-NMR）测得的分析结果，支持了标签所标示的平均药物含量声明。

基于该分析方法的简便性和可重复性，我们预计该方法可在任何实验室（包括制药行业的生产工厂）中作为过程分析技术（PAT）工具加以应用。

引言

在制药行业中，药物活性成分在其剂量单位形式（例如片剂和胶囊）中的含量必须处于标签标示量的范围内，以符合质量控制和性能指导原则。高效液相色谱法（HPLC）是用于测定制剂中药物含量均匀性的常规分析技术。然而，该方法耗时较长且具有破坏性，需要在分析前使用适当的溶剂将药物从其制剂中溶解出来。即使采用自动化操作，每个样品的分析过程仍可能耗时1至3小时，具体时间取决于相应分析方法的开发情况^1,2,3。除HPLC外，近红外光谱法（NIR）也被用于相同目的，并作为过程分析技术（PAT）工具使用，但其数据需进行化学计量学分析，导致实施过程更为耗时且复杂⁴。这两种技术均具有破坏性，分析后制剂药物将被废弃。

在本文中，我们详细描述了本课题组先前发表的一种方法学的逐步操作流程⁵，该方法利用低场¹⁹F核磁共振（NMR）技术测定氟化药物在其剂型（例如，片剂和胶囊）中的平均含量。多年来，经全球监管机构批准上市的含氟药物制剂所占比例已从1970年的2%上升至2013年的25%⁶。因此，我们认为有必要开发一种比现有方法更简便且更具特异性的方法，用于氟化药物制剂中含量的质量控制。

结构中含氟-19（¹⁹F）的药物因其在自然界中丰度为100%，且相对于质子的灵敏度达83%，可被¹⁹F核磁共振（NMR）轻易检测，具有显著优势⁷。而直接采用¹H时域核磁共振（TD-NMR）进行测量则不具实用性，原因是辅料和活性药物成分（API）均含有质子，总质子信号来自药物制剂中所有组分，导致无法通过¹H TD-NMR准确测定药物产品中的API含量。因此，利用¹⁹F TD-NMR测定含氟药物产品的药物含量具有明显优势，由于辅料中不含氟，不会产生干扰信号。为展示我们测定含氟药物产品平均药物含量的方法学，我们选取了三种市售的含氟药物制剂，其剂量范围各不相同。图1展示了所选药物的化学结构，其中两种药物——盐酸西那卡塞⁸和兰索拉唑⁹——结构中含有三氟甲基（CF₃）基团，剂量范围为15至90 mg；第三种药物——一水合盐酸环丙沙星¹⁰——在芳香环上连接有一个氟原子，剂量为500 mg。

本文展示了我们开发的一种方法⁵，利用低场台式时域核磁共振仪（¹H 频率为 23.4 MHz，¹⁹F 频率为 22.0 MHz）对含氟药物产品的平均药物含量进行定量分析。我们还比较了两种可用于报告结果的软件包（RI Calibration 软件和 Mnova 软件）。

方案

警告：使用任何化学品前，请查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。药物类物质通常具有毒性，应佩戴适当的个人防护装备（PPE；例如，手套、护目镜、实验服、长裤和封闭式鞋履），在称量粉末状材料时需特别小心。建议将天平置于通风良好的通风橱内，以尽量减少固体粉末向天平周围区域扩散。

注意：软件操作说明专门针对 RINMR、RI 校准和 Mnova。对于其他 TD-NMR 厂商的仪器和软件包，操作说明会有所不同。

1. ¹⁹F TD-NMR 测量前的样品制备

1. 将用于校准的样品（粉末状药物原料或活性药物成分（API））称重后放入合适的核磁共振（NMR）管中（外径分别为2.5、3、5、10、18和25 mm的NMR管），直至达到标记线位置（即NMR探头线圈的高度），或约30 mm的高度。请注意，该高度可能因探头而异。
   注意：盐酸西那卡塞是用于校准以测定市售西那卡塞片剂中药物含量的一种活性药物成分（API）示例。所需称样量取决于粉末的密度。以盐酸西那卡塞为例，当分别填充至25、18、10、5、3和2.5 mm NMR管的线圈高度时，所需API质量分别约为7.2 g、3.5 g、1.0 g、0.3 g、0.1 g和0.07 g。
2. 将制剂类药品样品（片剂或胶囊）称重后放入合适的NMR管中，填充至标记线位置（即NMR探头线圈的高度），或约30 mm的高度，具体如上所述。
   注意：当片剂/胶囊尺寸较大或有足够量的制剂样品时，可选用25 mm或18 mm NMR管。对于较小的片剂/胶囊，或制剂样品量有限但信噪比仍足以满足测量要求的情况，建议使用10 mm NMR管。片剂可直接测量，也可根据需要进行研磨。如讨论部分所述，两种处理方式在测量结果上未观察到明显差异。
   1. 制备市售西那卡塞片剂样品时，在25 mm NMR管中称取约十五片90 mg的片剂（总重约9.2 g），在25 mm NMR管中称取五十片30 mg的片剂（总重约9.6 g），在18 mm NMR管中称取二十二片30 mg的片剂（总重约4.2 g），以及在25 mm NMR管中称取二十三片60 mg的片剂（总重约8.8 g）。

2. 核磁共振仪器测量前的准备

1. 调节核磁共振仪器 ¹⁹F
   1. 在核磁共振（NMR）仪器中永磁体的温度下进行所有测量。此处使用 40 °C；26 mm 样品管无温度控制功能 ¹⁹F NMR 探针。所有测量均在 22.0 MHz 频率下进行 ¹⁹F 使用23-MHz（用于 ¹H) 核磁共振（NMR）仪器
   2. 将聚四氟乙烯标准样品放入25或26毫米核磁共振管中，并将其插入磁体内的探头中。平衡约5至10分钟，然后调节仪器至 ¹⁹F. 在 RINMR 软件的“Commands”菜单下选择“Auto O1”。重复测量至少 3 次，并取最后一次的 O 值₁ 参数（频率偏移）
2. 校准 ¹⁹F 90度脉冲
   1. 使用仪器内置的标准自动化校准程序，以标准聚四氟乙烯样品对氟-19的90度脉冲进行校准。在RINMR软件的“Commands”菜单下选择“Auto P90”。
      注意：通常情况下，90度脉冲无需频繁测定，除非仪器性能异常或探头已闲置一段时间。使用26毫米聚四氟乙烯样品测得的90度脉冲值 ¹⁹此处使用的F NMR探针为7.05 µs。

3. 标准纯API样品的T₁或纵向弛豫时间的测量

1. 为获得更好的信噪比，将制备好的API样品放入磁体中已安装的F-19探头内的25 mm NMR管中，并静置至少10分钟以达到平衡。
2. 测量 T₁ 弛豫时间，根据仪器说明书的指导，使用RINMR软件中的反转恢复标准实验，对每种API样品进行测定。
   注意：推荐的实验参数为：使用0.1 µs驻留时间采集16次扫描；8个数据点；90度脉冲（如上所述）；F-19 26 mm探头的死时间为10 µs。延迟时间数组范围从100 µs到8 s（例如， 100 µs、500 µs、10 ms、100 ms、300 ms、700 ms、1 s、2 s、5 s 和 8 s，用于具有 CF 的药物₃ 以及从 100 µs 到 20 s 的延迟（例如， 建议对芳香环上连接有一个氟基团的药物，采用以下时间点：100 µs、500 µs、1 ms、100 ms、500 ms、1 s、5 s、10 s、15 s 和 20 s。
   1. 在 RINMR 软件中，通过在“Sequence”下选择“Load”并点击“Open”，加载“invrec.exe”脉冲序列。通过点击“A”或在“Parameters”菜单下选择“Acquisition”，检查基本参数是否具有正确的数值。
   2. 在“工具”菜单下选择“脚本”，将弹出一个窗口。选择“T1.ris”标签页，然后点击绿色箭头，将弹出另一个窗口。选择包含适当延迟时间的延迟列表文件，或在点击“打开”后创建列表。当延迟列表设置满意后，点击“确定”。
      注意：一个窗口将提示创建一个文件，用于保存所有将要采集的光谱，以便进行计算 T₁ 值。文件夹和文件的位置及名称由用户自行决定。
   3. 单击“Save”，仪器将开始采集数据，并自动将所选文件夹中的延迟数据保存为文件。
      注意：RIMNR 软件将创建 T₁ 舒张曲线并计算 T₁ 每种情况的弛豫时间。将弹出一个窗口，其中包含 T₁ 弛豫曲线及时间常数或 T₁ 值. 此处，盐酸西那卡塞的 T1 值为 2.4 s。

4. 使用纯活性药物成分测量校准样品

1. 测量API样品以建立校准曲线
   1. 将一种校准样品放入针对特定API的磁体中。小管样品至少平衡5分钟，大管样品至少平衡10分钟。
   2. 根据仪器手册中的说明，使用适当的参数采集自由感应衰减（FID）或SOLID（90x-90y FID）实验数据。在RINMR软件中，通过在“Sequence”下选择“Load”并点击“Open”，加载“solid.exe”（或“fid.exe”）脉冲序列。
      注：对于具有短T₂（横向弛豫时间）且弛豫较快的固体材料，推荐使用SOLID实验。推荐的实验参数如下：采集128次扫描，采样时间为0.1 µs，数据点数为1,024，90度脉冲（本例中为7.05 µs，使用聚四氟乙烯校准），¹⁹F 26-mm探头的死时间为10 µs。对于含CF₃基团的药物，循环延迟设为7.5 s；对于芳香环上连接氟原子的药物（因其具有较长的T₁弛豫时间），循环延迟设为20 s，本研究中所展示案例均基于其T₁测量结果设定。
   3. 每种API所制备的所有样品在磁体温度下平衡5–10分钟后进行测量，以生成各API样品的校准曲线。将数据保存至一个文件夹中，并为每次实验运行赋予唯一的名称。
   4. 根据各管中样品的含量以及最大管中API样品的纯度，计算各样品的质量百分比。

5. 药品片剂样品的测定

1. 将已制备好的制剂药品样品（片剂或胶囊）放入磁体中，依次进行测量。对于小尺寸核磁共振管中的样品，平衡5分钟；对于大尺寸核磁共振管中的样品，平衡10分钟。
2. 采用相同的核磁共振实验（即，SOLID）的条件与各特定API的校准样品相同。

6. 使用纯活性药物成分样品生成校准曲线，并将片剂药物产品的样品数据加入校准曲线

1. 在这些情况下，从SOLID实验中选择5到300个点的区域以创建校准曲线。数据可通过以下三种不同方式进行分析。
2. 打开RI校准软件。通过点击剪辑符号，调用所有SOLID数据，以打开来自特定API的FID或SOLID文件。对于所有测量的样品，在“Conc”列下输入重量百分比，在“Mass”列下输入重量。使用平均法选择适当区域（5–300个点）以构建校准曲线（打开“Display NMR data”图标以选择用于计算的点范围）。保存校准曲线。
   注意：“Cal”列将提供所测样品中药物的百分比。
3. 在RI校准软件中，使用相同的选定区域（5–300个点），采用拟合法构建校准曲线。保存校准曲线。操作步骤与4.2.2步骤相同。
4. 打开软件（例如，Mnova）。将来自特定API的所有SOLID数据拖入，并输入标准样品的重量百分比；可通过点击“Help”菜单下的“Content”查看手动操作说明。在“Advanced”菜单中，选择“Time Domain”，然后选择“Quantitation”；此时将弹出一个窗口。点击蓝色加号以选择积分区域。使用幅值模式对适当区域（5–300个点）进行积分，以构建校准曲线。
5. 保存校准曲线。在表格中，仅将标准品的药物百分比输入“Concentration (x)”列，将所有样品的重量输入“Mass (m)”列；校准样品应显示为红色（已勾选）。确保“Signal Function”设置为“y=s/m”（以实现信号/质量的归一化）。
6. 为确保重现性和重复性，应在不同日期对每个样品测量3次，并在两个软件包中分别构建校准曲线。保存校准曲线文件。

7. 使用校准曲线计算制剂中药物中氟化API的重量

1. 计算配方药物产品中含氟API药物在每片/每粒胶囊中的重量百分比及平均剂量
   1. 使用RI校准软件生成的校准曲线文件及平均值法。读取所测片剂（或胶囊）的核磁共振（NMR）数据，并输入其重量，通过校准曲线确定配方片剂或胶囊中含氟API的重量百分比。
      注意：“Cal”列将提供所测样品（校准样品、市售片剂或未知样品）中药物的百分比。请注意，对于RI校准软件，校准样品与片剂或胶囊的O1参数必须相同。
   2. 使用RI校准软件中采用拟合法生成的校准曲线文件。读取所测片剂（或胶囊）的NMR数据，并输入其重量，通过校准曲线确定配方片剂或胶囊中含氟API的重量百分比。操作步骤与5.2.1步相同。请注意，对于RI校准软件，校准样品与片剂或胶囊的O₁参数必须一致。
   3. 使用Mnova文件，拖入已采集的配方API的NMR数据（或在同一天测量所有样品）。按照4.2.4步的说明操作。输入重量，通过校准曲线确定配方片剂或胶囊中含氟API的重量百分比。
      注意：在表格中，校准样品以红色（已勾选）显示，未知样品或市售片剂/胶囊以蓝色（未勾选）显示。“浓度 (x)”列将根据红色校准样品的数值，以蓝色显示市售片剂或未知样品的计算值。请注意，该软件在计算重量百分比时无需使用相同的O1参数。
   4. 根据以下公式计算每片或每粒胶囊中含氟药物的含量（取平均值）（D = 以mg为单位的API剂量，W_NMR = 由校准曲线获得的API重量百分比，w = 来自所测片剂或胶囊的配方药物总重量，N = 用于测量的配方片剂数量或胶囊数量），并与基于校准曲线由软件计算的数值进行比较：
      

结果

我们采用低场¹⁹F时域核磁共振（TD-NMR）技术对三种市售药物产品（西那卡塞、兰索拉唑和环丙沙星）进行了测试，以测定含氟药物产品的平均药物含量。图1展示了所测试药物的分子结构，并标出了氟原子的位置。

我们测试了多个批次和剂型（即， 30、60 和 90 mg 剂量的西那卡塞片，一种剂量规格（15 mg）的品牌与仿制批次的兰索拉唑胶囊，以及一种剂量规格（500 mg）和一批次的环丙沙星片。西那卡塞的核磁共振（NMR）信号衰减图2），以这三种药物的校准曲线为例（图3 - 5）通过RI校准软件的平均值法和拟合法以及Mnova的幅值模式获得。这些曲线的数据还被绘制成图，以检查三次重复测量之间的可重复性（

讨论

随着越来越多含氟药物进入市场，我们开发了一种基于低场¹⁹F时域核磁共振（TD-NMR）的特异且简便的方法，用于测定含氟药物产品的平均药物含量⁵。我们对该方法在三种市售药物产品上进行了测试：含盐酸西那卡塞的片剂、含兰索拉唑的胶囊以及含一水盐酸环丙沙星的片剂。该方法的优势在于辅料中不含氟，因而具有高度特异性，同时操作简便。对于西那卡塞和兰索拉唑的制剂，我们在完整的剂型（无论是胶囊还是片剂）上测试了其测量能力。而对于环丙沙星制剂，我们则分别测试了完整和压碎的片剂，以评估样品前处理的影响。方法开发的一部分工作集中于比较两种软件包：RI Calibration（TD-NMR数据定量分析的常用软件）和一种近期可商用的Mnova软件版本（可处理TD-NMR数据；Mnova是高场NMR数据处理中常用的软件之一）。我们评估了这两种软件在结果报告能力及其与标准商业办公软件兼容性方面的表现⁵。

盐酸西那卡塞⁸（

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MQC-23	Oxford Instruments	52-AM4044	1H 的频率为 23.4 MHz，19F 的频率为 22.0 MHz
26 mm 探头（19F）	Oxford Instruments	52-AM4061	19F 核磁共振探头
盐酸西那卡塞	Amgen	批号 005002 M	纯度 99.8%
市售西那卡塞片剂	Amgen	批号 0010021308	30 mg 片剂
市售西那卡塞片剂	Amgen	批号 D1026396	30 mg 片剂
市售西那卡塞片剂	Amgen	批号 D118714	30 mg 片剂
市售西那卡塞片剂	Amgen	批号 D061829	60 mg 片剂
市售西那卡塞片剂	Amgen	批号 00100213	90 mg 片剂
市售西那卡塞片剂	Amgen	批号 D064074	90 mg 片剂
市售西那卡塞片剂	Amgen	批号 1026356	90 mg 片剂
兰索拉唑	Fluka	批号 LRAA1897	纯度 99.7%
品牌名兰索拉唑	Novartis	批号 DV1891	15 mg 胶囊
通用名兰索拉唑	SUPERVALUE INC	批号 2GE2027	15 mg 胶囊
环丙沙星游离碱	Fluka	批号 BCBM7969V	纯度 99.9%
一水合盐酸环丙沙星	Fluka	批号 P500044	以盐酸盐计纯度为 94%
通用名环丙沙星	Pack Pharmaceuticals	批号 PUB3033	500 mg 片剂
25 mm 核磁管	New Era Enterprises	NE-25TD-200-FB
18 mm 核磁管	New Era Enterprises	NE-18TD-200-FB
10 mm 核磁管	New Era Enterprises	NE-10TD-200-FB
5 mm 核磁管	New Era Enterprises	NE-HL5-7
3 mm 核磁管	New Era Enterprises	NE-H3-7
2.5 mm 核磁管	New Era Enterprises	NE-H5/2.5