用于芯片开发与HIV抗体谱型分析的N-聚糖化学-酶法合成

摘要

一种模块化的合成方法 N已开发出一种将糖链固定于氧化铝涂层玻璃载片（ACG载片）以构建糖芯片的技术，并已验证其在HIV广谱中和抗体谱型分析中的应用。

摘要

我们提出一种高效的方法，用于快速制备多种多样的 N连接的寡糖（估计结构超过20,000种），这些寡糖常见于人类糖蛋白上。为实现所需的结构多样性，该策略首先通过化学-酶法合成三种寡糖基氟化物模块，随后在3-位进行逐步的α-选择性糖基化反应O 和 6-O 共同核心三糖中甘露糖残基的关键β-甘露糖苷键位置。我们进一步连接了 N-glycans 固定到氧化铝涂层玻璃（ACG）载玻片表面，以构建共价混合微阵列，用于分析异源配体与HIV抗体的相互作用。特别是，研究新近分离的HIV-1广谱中和抗体（bNAb）PG9与空间排列紧密的甘露糖混合物的结合行为₅GlcNAc₂ （男性₅以及双唾液酸化的双天线复合型 N-糖链（SCT）在ACG芯片上的研究为HIV疫苗开发中有效免疫原的设计提供了新途径。此外，我们的ACG芯片是研究其他HIV抗体异源配体结合行为的有力工具。

引言

N-糖蛋白上的聚糖共价连接到共识序列 Asn-Xxx-Ser/Thr 中的天冬酰胺（Asn）残基，影响多种生物学过程，如蛋白质构象、抗原性、溶解性和凝集素识别^1,2。N-连接寡糖的化学合成由于其高度的结构微异质性和高度分支的结构，构成了重大的合成挑战。精确选择保护基以调节砌块的反应性、实现异头中心的选择性，以及正确使用促进剂/活化剂，是合成复杂寡糖的关键要素。为应对这一复杂性问题，近年来已有大量研究推动了N-聚糖的合成进展^3,4。尽管这些方法已相当成熟，开发一种能够高效制备多种N-聚糖（约20,000种）的方法仍是当前面临的主要挑战。

HIV-1 快速的突变率导致其具有广泛的遗传多样性，并能够逃逸中和抗体反应，这是开发安全有效的HIV-1预防性疫苗所面临的主要挑战之一^5,6,7。HIV逃避宿主免疫反应的一种有效策略是对包膜糖蛋白gp120进行翻译后糖基化，形成多种来源于宿主糖基化机制的

方案

1. D1/D2 臂模块的制备²²

1. 中间体2的制备
   1. 称量起始材料 1 （如图所示） 图2, p-甲氧基苯基-O-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-α-D-吡喃甘露糖苷（100 mg，0.204 mmol）溶于含二氯化锰（MnCl₂）的25 mM Tris缓冲液（pH 7.5）中，加入15 mL离心管₂，10 mM）以达到5 mM的终浓度甘氨酸。
   2. 加入2当量的尿苷二磷酸半乳糖（uridine diphosphate galactose，UDP-galactose）UDP-Gal).
   3. 加入150单位来自牛乳的β-1,4-半乳糖基转移酶，37℃孵育混合物 ^o15小时，C
   4. 15 h后，取反应混合物点于薄层色谱板上展开，通过薄层色谱（TLC）分析判断原料是否完全消耗 n正丁醇/乙酸/水（H₂O) 按1:1:1的比例混合，并用0.25 M 钼酸铈铵溶液染色，随后加热。然后在90℃加热以终止反应 ^o5 分钟内升至 C。
   5. 以 2,737 x g 的速度离心反应....

结果

一种模块化的化学-酶法策略用于合成多种多样的 N-糖类的展示如下 图1该策略基于以下事实：可通过化学-酶法合成三个重要模块，在起始阶段即构建多样性，随后在3位进行α特异性的甘露糖基化O 和/或 6-O 共同核心三糖中甘露糖残基的位置 N-糖链。考虑到双、三和四触角复合型结构的多样性 N-糖链结构，我们认为，一组寡糖基供体与带有预先安装烷基手柄的核心三糖受体可作为起始材料，用于构建目标结构多样性（图1）。先前已证明糖基氟化物供体在构建复杂聚糖库中的适用性²¹.

为了验证本策略的有效性，选择了一个双天线异构体结构（10，图3

讨论

一类包括 PG9、PG16 以及 PGT128、PGT141–145 的 HIV-1 广谱中和抗体被报道具有高效中和 70%–80% 流行性 HIV-1 分离株的能力。这些广谱中和抗体的表位在 HIV-1 M 组所有变异株中高度保守，因此可能为设计有效的 HIV 疫苗免疫原以诱导中和抗体提供指导。^23,24,25作为我们持续研究HIV-1广谱中和抗体糖链表位的一部分，我们报道了通过化学与酶法合成一系列高甘露糖型、杂合型和复杂型寡糖，以构建糖芯片阵列^21,22然而，常用的聚糖芯片在 N羟基琥珀酰亚胺包被（NHS）玻片无法检测低亲和力的碳水化合物-蛋白质相互作用，可能是由于活性基团水解导致聚糖分布不均所致 N-羟基琥珀酰亚胺功能基团。为克服传统芯片阵列格式的局限性，我们开发了一种基于氧化铝涂层玻璃（ACG.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酸	Sigma Aldrich	64197
乙腈	Sigma Aldrich	75058
乙酸酐	Sigma Aldrich	108247
无水硫酸镁	Sigma Aldrich	7487889
三氟化硼乙醚络合物	Sigma Aldrich	109637
牛血清白蛋白	Sigma Aldrich	9048468
Bio-Gel P2 聚丙烯酰胺	Bio-Rad	1504118
二氯双(环戊二烯基)铪(IV)	Sigma Aldrich	12116664
β-1,4-半乳糖基转移酶（来自牛乳）	Sigma Aldrich	48279
采用机器人针 SMP3（Stealth Micro Spotting Pins）的 BioDot 笛卡尔点样技术	Arrayit
钼酸铈铵	TCI	C1794
硝酸铈铵	Sigma Aldrich	16774213
洁净载玻片	Schott
5′-单磷酸胞苷-N-乙酰神经氨酸	Sigma Aldrich	3063716
氘代氯仿	Sigma Aldrich	865496
驴抗人IgG（Alexa Fluor647标记）	Jackson Immuno Research, USA	709605098
二氯甲烷	Sigma Aldrich	75092
二乙基氨基硫三氟化物	Sigma Aldrich	38078090
二甲基甲酰胺	Sigma Aldrich	68122
乙酸乙酯	Sigma Aldrich	141786
乙二醇	Acros Organic	107211
FAST frame 载玻片孵育室	Sigma Aldrich
5'-二磷酸鸟苷-b-L-岩藻糖二钠盐	Sigma Aldrich	15839700
Lab tracer 2.0 软件			方案第4节
GenePix Pro 4300A 读板仪（微阵列图像分析）	moleculardevices		www.moleculardevices.com
GraphPad Prism 软件（图像处理）	GraphPad Software, Inc		http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/
氢氧化锂	Sigma Aldrich	1310652
氯化锰	Sigma Aldrich	7773015
甲醇	Sigma Aldrich	67561
正丁醇	Sigma Aldrich	71363
草酸	Acros Organic	144627
氢氧化钯	Sigma Aldrich	12135227
磷酸盐缓冲液	Thermo Fisher Scientific	10010023
吡啶	Sigma Aldrich	110861
对甲苯磺酸一水合物	Sigma Aldrich	773476
三氟甲磺酸银	Sigma Aldrich	2923286
碳酸氢钠	Sigma Aldrich	144558
氯化钠	Sigma Aldrich	7647145
碳酸氢钠	Sigma Aldrich	144558
甲醇钠	Sigma Aldrich	124414
硫酸钠	Sigma Aldrich	7757826
甲苯	Sigma Aldrich	108883
Tris 缓冲液	Amresco	N/A	超纯级
Tween-20	Amresco	9005645
尿苷二磷酸半乳糖（UDP-半乳糖）	Sigma Aldrich	137868521