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方法文章

用于芯片开发与HIV抗体谱型分析的N-聚糖化学-酶法合成

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DOI：

10.3791/55855

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2018年2月5日

 ,  ,  , 
1Genomics Research Center, Academia Sinica

本文内容

摘要

一种模块化的合成方法 N已开发出一种将糖链固定于氧化铝涂层玻璃载片（ACG载片）以构建糖芯片的技术，并已验证其在HIV广谱中和抗体谱型分析中的应用。

摘要

我们提出一种高效的方法，用于快速制备多种多样的 N连接的寡糖（估计结构超过20,000种），这些寡糖常见于人类糖蛋白上。为实现所需的结构多样性，该策略首先通过化学-酶法合成三种寡糖基氟化物模块，随后在3-位进行逐步的α-选择性糖基化反应O 和 6-O 共同核心三糖中甘露糖残基的关键β-甘露糖苷键位置。我们进一步连接了 N-glycans 固定到氧化铝涂层玻璃（ACG）载玻片表面，以构建共价混合微阵列，用于分析异源配体与HIV抗体的相互作用。特别是，研究新近分离的HIV-1广谱中和抗体（bNAb）PG9与空间排列紧密的甘露糖混合物的结合行为5GlcNAc2 （男性5以及双唾液酸化的双天线复合型 N-糖链（SCT）在ACG芯片上的研究为HIV疫苗开发中有效免疫原的设计提供了新途径。此外，我们的ACG芯片是研究其他HIV抗体异源配体结合行为的有力工具。

引言

N-糖蛋白上的聚糖共价连接到共识序列 Asn-Xxx-Ser/Thr 中的天冬酰胺（Asn）残基，影响多种生物学过程，如蛋白质构象、抗原性、溶解性和凝集素识别1,2。N-连接寡糖的化学合成由于其高度的结构微异质性和高度分支的结构，构成了重大的合成挑战。精确选择保护基以调节砌块的反应性、实现异头中心的选择性，以及正确使用促进剂/活化剂，是合成复杂寡糖的关键要素。为应对这一复杂性问题，近年来已有大量研究推动了N-聚糖的合成进展3,4。尽管这些方法已相当成熟，开发一种能够高效制备多种N-聚糖（约20,000种）的方法仍是当前面临的主要挑战。

HIV-1 快速的突变率导致其具有广泛的遗传多样性，并能够逃逸中和抗体反应，这是开发安全有效的HIV-1预防性疫苗所面临的主要挑战之一5,6,7。HIV逃避宿主免疫反应的一种有效策略是对包膜糖蛋白gp120进行翻译后糖基化，形成多种来源于宿主糖基化机制的N-连接聚糖8,9。最近一项关于人胚胎肾（HEK）293T细胞中重组单体HIV-1 gp120糖基化的精确分析表明，其存在结构微不均一性，并具有特征性的细胞特异性模式10,11,12。因此，要理解HIV-1广谱中和抗体（bNAbs）对糖链的特异性，就需要获得足够数量且经过充分表征的gp120相关N-聚糖结构用于分析。

聚糖微阵列技术的发现为高通量研究多种碳水化合物结合蛋白、病毒/细菌黏附素、毒素、抗体和凝集素的特异性提供了可能13,14。通过将聚糖系统性地排列在芯片上，以多价展示方式可有效检测难以识别的低亲和力蛋白-聚糖相互作用15,16,17,18。这种基于芯片的聚糖排列方式能够有效模拟细胞-细胞界面。为了进一步提升该技术性能并克服传统阵列格式中信号不均的问题，我们课题组近期开发了一种基于氧化铝涂层玻璃（ACG）载片的聚糖阵列，利用磷酸化末端的聚糖分子显著增强了信号强度、均一性和检测灵敏度19,20。

为了加深对新分离的 HIV-1 广谱中和抗体（bNAbs）糖链表位的当前认知，我们开发了一种高效且模块化的策略，用于制备多种 N-连接糖链21,22，并将其点样至 ACG 芯片上（见图1）。在 ACG 芯片上对 HIV-1 bNAbs 进行特异性分析的研究中，意外发现了强效 bNAb PG9 存在异源糖链结合行为，该抗体分离自 HIV 感染个体23,24,25。

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方案

1. D1/D2 臂模块的制备22

  1. 中间体2的制备
    1. 称量起始材料 1 （如图所示） 图2, p-甲氧基苯基-O-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-α-D-吡喃甘露糖苷（100 mg，0.204 mmol）溶于含二氯化锰（MnCl₂）的25 mM Tris缓冲液（pH 7.5）中，加入15 mL离心管2，10 mM）以达到5 mM的终浓度甘氨酸。
    2. 加入2当量的尿苷二磷酸半乳糖（uridine diphosphate galactose，UDP-galactose）UDP-Gal).
    3. 加入150单位来自牛乳的β-1,4-半乳糖基转移酶，37℃孵育混合物 o15小时，C
    4. 15 h后，取反应混合物点于薄层色谱板上展开，通过薄层色谱（TLC）分析判断原料是否完全消耗 n正丁醇/乙酸/水（H2O) 按1:1:1的比例混合，并用0.25 M 钼酸铈铵溶液染色，随后加热。然后在90℃加热以终止反应 o5 分钟内升至 C。
    5. 以 2,737 x g 的速度离心反应混合物 3 分钟，将上清液加样至聚丙烯酰胺凝胶柱顶部（参见 材料表用去离子蒸馏水洗脱层析柱，并以1 - 2 mL的馏分收集产物。
    6. 通过薄层色谱法监测所收集的组分26，发育过程中 n正丁醇：H2O：以1:1:1比例混合的乙酸溶液，随后用钼酸铈铵溶液染色并加热。冻干27 将含有产物的馏分合并，得到白色粉末状中间体2（115 mg，86%）。通过核磁共振（NMR）对产物进行表征。28 质谱分析29 （参见补充数据文件）。
  2. 中间体3的制备
    1. 称量起始材料 2 （如图所示） 图2, p甲氧基苯基-β-D-半乳糖吡喃糖基-(1→4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖吡喃糖基-(1→2)-α-D-甘露糖吡喃糖苷（80 mg，0.122 mmol）置于15 mL离心管中，溶于含MnCl₂的Tris缓冲液（25 mM，pH 7.5）2 (10 mM) 以制备终浓度为 5 mM 的糖链溶液。
    2. 加入2当量的鸟苷二磷酸-β-L-岩藻糖二钠盐（GDP-Fuc）。
    3. 加入150单位的α-1,3-岩藻糖基转移酶 幽门螺杆菌 （Hp1-3FTΔ26695），并在37 o15 小时，4 ℃
    4. 按照步骤 1.1.4 进行。
    5. 参照步骤 1.1.5。
    6. 按照步骤1.1.6操作以获得中间产物 3 （82 mg，84%），白色粉末。通过核磁共振（NMR）和质谱（MS）对产物进行表征（见补充数据文件）。
  3. 模块4和模块5的制备
    1. 称量化合物 2, p甲氧基苯基-O-β-D-半乳糖吡喃糖基-(1→4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖吡喃糖基-(1→2)-α-D-甘露糖吡喃糖苷（0.230 g，0.360 mmol）或化合物 3, p将甲氧基苯基-β-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-[α-L-岩藻吡喃糖基-(1→3)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄吡喃糖基]-(1→2)-α-D-甘露吡喃糖苷（0.100 g，0.125 mmol）加入25 mL单颈圆底烧瓶中，真空干燥30 min。
    2. 从真空环境中取出烧瓶，通入氮气，加入磁力搅拌子，用橡胶隔垫封口，并连接氮气球。
    3. 注入7 mL干燥的吡啶和3 mL乙酸酐（Ac2O）加入置于冰浴中的烧瓶，温度保持在 0 oC. 使用磁力搅拌器在室温下以600 - 700 rpm转速搅拌反应液12小时。在50℃、0 - 10 mbar真空压力下，使用旋转蒸发仪蒸发溶剂。 oC.
    4. 使用30 mL二氯甲烷（DCM）稀释粗混合物，并用饱和水相碳酸氢钠（NaHCO₃）溶液萃取3)（2 × 20 mL）转移至50 mL分液漏斗中。
    5. 用二氯甲烷（3 × 15 mL）再次萃取水相，合并有机相并用硫酸钠干燥。通过过滤除去硫酸钠，并用二氯甲烷（5 mL）洗涤。在400 mbar真空压力下，使用旋转蒸发仪于40 °C蒸发溶剂 oC.
    6. 将粗混合物溶液上样至硅胶柱顶部的2 mL二氯甲烷中。
    7. 用甲苯-丙酮混合溶剂梯度洗脱色谱柱，丙酮比例从0%至20%，收集5至10 mL的馏分。
    8. 通过薄层色谱（步骤1.1.4和1.1.6）监测所收集的馏分，使用甲苯/丙酮（7/3）展开，以钼酸铵铈溶液染色后在加热板上加热显色。
    9. 使用旋转蒸发仪将含有产物的馏分蒸干，分别以72%和85%的产率得到目标产物，为白色泡沫状固体。
    10. 将产物溶解于7 mL乙腈：甲苯：H2在25 mL圆底烧瓶中以4:2:1的比例混合O。
    11. 在冷却至0℃的同时加入硝酸铈铵（2当量） o在冰浴中冷却，于室温下以约500 - 800 rpm搅拌反应3小时。
    12. 薄层色谱显示原料完全消耗后（薄层色谱展开剂为甲苯/丙酮（7/3），通过254 nm紫外吸光度检测或以钼酸铵铈溶液染色后加热显色），用乙酸乙酯（30 mL）稀释反应混合物，并用水萃取2O（15 × 2 mL）。
    13. 用5 mL饱和氯化钠（NaCl）溶液萃取合并的有机相。
    14. 使用旋转蒸发仪在40℃、240 mbar真空压力下蒸除溶剂 oC.
    15. 将粗产物溶液上样至硅胶柱顶部的2 mL二氯甲烷中。用甲苯与丙酮的混合溶剂（甲苯中含0 - 20%丙酮）洗脱，收集5 - 10 mL的馏分。采用甲苯/丙酮（7/3）体系展开，通过薄层色谱（TLC）监测各馏分。
    16. 使用旋转蒸发仪在77 mbar真空度和40 °C条件下蒸发含产物的馏分 oC 以获得呈白色泡沫状的目标产物。
    17. 将相应的醇溶解于25 mL单颈圆底烧瓶中的10 mL二氯甲烷（DCM）中，并冷却至-30 ℃ oC.
    18. 加入二乙基氨基三氟化硫（DAST，2 当量）。在 -30 ℃ 下搅拌反应混合物 o2 小时，C
    19. 薄层色谱显示起始原料消耗完全后（薄层色谱展开剂：甲苯/丙酮（4:1），通过254 nm紫外吸光检测或以钼酸铵铈溶液染色后加热显色），用二氯甲烷（30 mL）稀释反应混合物，再用饱和碳酸氢钠溶液洗涤3 （15 × 2 mL）
    20. 用5 mL饱和NaCl溶液萃取合并的有机相，加入无水硫酸镁干燥，用二氯甲烷（5 mL）洗涤后过滤，将滤液收集至100 mL单颈圆底烧瓶中。
    21. 使用旋转蒸发仪在40°C、400 mbar真空压力下蒸发溶剂 oC.
    22. 将2 mL二氯甲烷中的粗产物溶液加载至硅胶柱上。用甲苯与丙酮的混合溶剂（0- 20% 丙酮-甲苯溶液）并收集 5 - 10 mL 的馏分。
    23. 通过薄层色谱（TLC）监测所收集的馏分，以甲苯/丙酮（7/3）作为展开剂。
    24. 使用旋转蒸发仪将含有产物的馏分进行浓缩，以获得目标产物 4, [2,3,4,6-四乙酰基-β-D-半乳吡喃糖基]-(1→4)-[3,6-二乙酰基-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄吡喃糖基]-(1→2)-3,4,6-三乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基氟化物（经两步反应，产率54%）以及 5, [2,3,4,6-四乙酰基-β-D-半乳吡喃糖基]-(1→4)-[2,3,4-三乙酰基-α-L-岩吡喃糖基-(1→3)-3,6-二乙酰基-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡吡喃糖基]-(1→2)-3,4,6-三乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基氟化物（两步总收率67%），为白色固体。
    25. 通过核磁共振（NMR）和质谱（mass spectroscopy）对产物进行表征（参见补充数据文件）。

2. 糖链10的制备

  1. 中间体7的制备
    1. 称取三氟甲磺酸银（AgOTf）（0.039 g，0.155 mmol）、二氯双（环戊二烯基）铪（IV）（Cp2HfCl2将(0.041 g，0.108 mmol)加入25 mL单颈圆底烧瓶中，在Schlenk线真空下干燥30分钟，撤去真空，通入氮气。
    2. 将新干燥的4 Å分子筛（0.2 g）转移至含有AgOTf和Cp的烧瓶中2HfCl2，加入磁力搅拌子，立即用隔垫封口，并连接氮气球。
    3. 用干燥的玻璃注射器将3 mL干燥甲苯转移至烧瓶中。室温下搅拌反应混合物1小时，然后冷却至0 oC.
    4. 注射供体溶液 4 (图2，0.043 g，0.046 mmol）和受体 65-叠氮戊基-O-2-O-乙酰基-4,6-O-亚苄基-β-D-甘露吡喃糖基-(1→4)-O-(3,6-二-O-苄基-2-脱氧-2-(2,2,2-三氯乙氧基)羰基氨基-β-D-葡萄吡喃糖基)-(1→4)-O-3,6-二-O-苄基-2-脱氧-2-(2,2,2-三氯乙氧基)羰基氨基-β-D-葡萄吡喃糖苷图3，0.045 g，0.031 mmol）溶于3 mL甲苯，使用10 mL注射器通过隔膜注入反应瓶中，保持温度为0 ℃ oC. 在室温下搅拌反应混合物 3 h。
    5. 薄层色谱（TLC）显示原料消耗完全（TLC展开剂：二氯甲烷/丙酮（8.5/1.5），通过254 nm紫外吸光度检测，或使用钼酸铵铈溶液染色后加热显色）后，加入10当量的三乙胺淬灭反应。
    6. 将分子筛通过硅藻土柱过滤至50 mL圆底烧瓶中，并用10 mL乙酸乙酯进一步洗涤。用饱和碳酸氢钠水溶液萃取合并的有机相3 （2 × 20 mL）置于50 mL分液漏斗中。用乙酸乙酯（3 × 15 mL）萃取水相。
    7. 用饱和氯化钠溶液（5 mL）萃取合并的有机相，用无水硫酸镁干燥，过滤以除去硫酸镁，用乙酸乙酯（3 × 15 mL）洗涤，将滤液收集至100 mL圆底烧瓶中。
    8. 使用旋转蒸发仪在40 ℃、240 mbar真空压力下蒸发溶剂 oC.
    9. 将粗产物的二氯甲烷溶液上样至硅胶柱。用二氯甲烷与丙酮的混合溶剂（二氯甲烷中含0–10%丙酮）洗脱，收集5–10 mL的馏分。
    10. 通过薄层色谱（TLC）监测所收集的馏分，展开剂为二氯甲烷/丙酮（8.5/1.5）。使用旋转蒸发仪蒸发含有产物的馏分，得到中间体。 7, 5-叠氮戊基-O-{[2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-半乳吡喃糖基]-(1→4)-[3,6-二-O-乙酰基-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡吡喃糖基]-(1→2)-[3,4,6-三-O-乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基]}-(1→3)-[2-O-乙酰基-4,6-O-亚苄基-β-D-甘露吡喃糖基-(1→4)-O-(3,6-二-O-苄基-2-脱氧-2-(2,2,2-三氯乙氧基)羰基氨基-β-D-葡吡喃糖基)-(1→4)-O-3,6-二-O-苄基-2-脱氧-2-(2,2,2-三氯乙氧基)羰基氨基-β-D-葡吡喃糖苷 (0.052 g, 70%)，为白色泡沫状物。
    11. 通过核磁共振（NMR）和质谱（mass spectroscopy）对产物进行表征（参见补充数据文件）。
  2. 中间体8的制备
    1. 称量六糖 7 (图3，0.040 g，0.016 mmol）置于25 mL单颈圆底烧瓶中，真空干燥1小时，撤去真空，通入氮气，加入磁力搅拌子，用橡胶隔膜密封。
    2. 将3 mL乙腈:甲醇（MeOH）（2:1比例）转移至烧瓶中。
    3. 添加 p将对甲苯磺酸一水合物（0.001 g，0.008 mmol）加入反应瓶中，以800 rpm的转速搅拌反应5小时。
    4. 当薄层色谱（TLC）显示起始原料已消耗完全（TLC 展开剂为二氯甲烷/丙酮（8.5/1.5），通过 254 nm 紫外吸收或以钼酸铈铵溶液显色后加热观察）时，加入 10 当量的三乙胺淬灭反应。
    5. 使用旋转蒸发仪在40℃、337 mbar真空压力下蒸发溶剂 oC.
    6. 将粗混合物用约2 mL二氯甲烷（DCM）溶解，加样至硅胶柱上层。
    7. 用二氯甲烷（DCM）和丙酮的混合溶剂梯度洗脱（0 - 10 %丙酮/DCM），收集5 - 10 mL的馏分。采用TLC监测各馏分，展开剂为DCM/丙酮（8.5/1.5）。在400 mbar真空度和40 °C条件下，使用旋转蒸发仪除去溶剂。 oC.
    8. 在减压条件下干燥残余物，得到中间体 8, 5-叠氮戊基-O-(2-O-乙酰基-3,4,6-三-O-苄基-β-D-甘露吡喃糖基)-(1→4)-O-(3,6-二-O-苄基-2-脱氧-2-酞酰亚胺基-β-D-葡萄吡喃糖基)-(1→4)-O-(3,6-二-O-苄基-2-脱氧-2-酞酰亚胺基-β-D-葡萄吡喃糖基)-(1→3)-2-O-乙酰基-4,6-O-亚苄基-β-D-甘露吡喃糖苷图3，0.022 g，产率57%），为白色固体。通过核磁共振（NMR）和质谱（MS）对产物进行表征（见补充数据文件）。
  3. 中间体9的制备
    1. 中间体的制备 9 (图3使用供体完成 5 （0.015 g，13.2 µmol）和受体 8 (图3，0.020 g，8.80 µmol。
    2. AgOTf（0.011 g，44.1 µmol）和 Cp2HfCl2 (0.012 g, 30.8 µmol) 用作促进剂。
    3. 执行步骤 2.1.1 至 2.1.10 以获得中间产物 9, 5-叠氮戊基-O-{[2,3,4,6-O-四乙酰基-β-D-半乳吡喃糖基]-(1→4)-[3,6-O-二乙酰基-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡吡喃糖基]-(1→2)-[3,4,6-O-三乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基]}-(1→3)-{2,3,4,6-O-四乙酰基-β-D-半乳吡喃糖基]-(1→4)-[2,3,4-O-三乙酰基-α-L-S160fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-二乙酰基-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡吡喃糖基]-(1→2)-3,4,6-O-三乙酰基-α-D-甘露吡喃糖基}-(1→6)-[2-O-乙酰基-β-D-甘露吡喃糖基-(1→4)-O-(3,6-二-O-苄基-2-脱氧-2-(2,2,2-三氯乙氧基)羰基氨基-β-D-葡吡喃糖基)-(1-O-苄基-2-脱氧-2-(2,2,2-三氯乙氧基)羰基氨基-β-D-葡吡喃糖基)-D-葡吡喃糖 (0.010 g, 34%)，为白色泡沫状物。
  4. 中间体的全局脱保护
    1. 称量化合物 9 将（0.010 g，2.9 µmol）加入25 mL单颈圆底烧瓶中，放入磁力搅拌子，用橡胶隔膜密封，并连接氮气球。
    2. 转移 2 mL 的 1,4-二噁烷:H2O (4:1) 加入烧瓶中。将氢氧化锂（LiOH）（0.005 g，50% 质量分数）加入烧瓶中。在 90 - 100 ℃ 下搅拌反应混合物 o4℃孵育12小时，然后在室温下冷却。
    3. 使用旋转蒸发仪蒸除溶剂，将烧瓶在真空条件下干燥1小时，充入氮气，从真空歧管上取下，并用橡胶隔垫密封。
    4. 使用10 mL注射器通过隔膜向烧瓶中注入4 mL干燥吡啶和2 mL乙酸酐，反应在0 ℃下进行 oC. 在室温下搅拌反应混合物12小时。
    5. 使用旋转蒸发仪在50℃、0-10 mbar真空压力下蒸发溶剂 oC.
    6. 将粗混合物用30 mL二氯甲烷（DCM）溶解，并用饱和碳酸氢钠水溶液萃取该溶液。3 （2 × 20 mL）置于50 mL分液漏斗中。
    7. 用二氯甲烷（3 × 15 mL）再次萃取水相。使用旋转蒸发仪蒸发溶剂。
    8. 将产物的二氯甲烷溶液（约2 mL）上样至C18硅胶柱上，用水-甲醇混合溶剂（甲醇比例从0%至100%）梯度洗脱，收集5–10 mL的馏分。
    9. 收集产物组分，并在减压条件下蒸发，得到呈白色泡沫状的目标产物。
    10. 将产物溶于25 mL圆底烧瓶中的5 mL干燥甲醇中，并用橡胶隔膜封口。
    11. 转移0.1 mL甲醇钠（NaOMe）甲醇溶液并冷却至0 ℃ o在冰浴中冷却，并搅拌混合物12小时。
    12. 使用旋转蒸发仪除去溶剂，并在高真空下干燥产物。
    13. 将粗产物溶解于5 mL甲醇：H2O：乙酸（6:3:1）。
    14. 加入氢氧化钯（Pd(OH)2)（质量分数50%），在氢气球氛围下搅拌反应15小时。
    15. 通过硅藻土柱过滤反应液，先用2 mL甲醇洗涤，再用2 mL去离子水洗涤。
    16. 使用旋转蒸发仪蒸发溶剂。
    17. 将粗混合物用约1 mL水溶解，然后加样至聚丙烯酰胺凝胶床顶部（参见 材料表用水洗脱产物，收集1 - 2 mL的馏分。
    18. 通过薄层色谱（TLC）监测所收集的馏分，并用指定展开剂展开 n正丁醇：H2乙酸（1:1:1）
    19. 收集产物组分并冻干，得到目标产物 10, 5-氨基戊基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-α-D-吡喃甘露糖基]-(1→3),-[β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-(α-L-吡喃岩藻糖基-(1→3)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→2)-α-D-吡喃甘露糖基]-(1→6)-β-D-吡喃甘露糖基-(1→4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷（0.002 g，36%），为白色粉末。
    20. 通过核磁共振（NMR）和质谱（mass spectroscopy）对产物进行表征（参见补充数据文件）。

3. 带有磷酸基团尾链的糖链制备19,22

  1. 称取相应的糖链（2 - 5 µmol）于5 mL圆底烧瓶中，加入磁力搅拌子，用橡胶隔垫密封。
  2. 加入400 µL新干燥的二甲基甲酰胺。
  3. 向糖链溶液中加入[2-(2-(2-(双(苄氧基)膦酰)乙氧基乙氧基)乙基 (2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯]（10 - 25 µmol，实验室自制）。在800 rpm条件下搅拌反应混合物5小时。
  4. 在40 oC、5 - 10 mbar真空压力下，使用旋转蒸发仪蒸发溶剂。
  5. 将反应混合物溶于0.5 mL水中，加样至聚丙烯酰胺凝胶柱顶部（见材料表）。用水洗脱产物，收集1-2 mL的馏分。
  6. 通过TLC26监测收集的馏分。将反应混合物点样于TLC板上，加入0.25 M钼酸铈铵染色液，随后在加热板上加热。合并含产物的馏分，并冻干得到白色粉末状目标产物。
  7. 将产物溶于2 mL水中，加入Pd(OH)2（重量百分比50%）。在氢气球提供的氢气氛围下，以800 rpm搅拌反应15小时。
  8. 通过经灼烧处理的滤床过滤反应液，依次用2 mL甲醇和2 mL蒸馏去离子水洗涤。在40 oC、300 mbar真空压力下，使用旋转蒸发仪蒸发溶剂。
  9. 将粗产物混合物用约1 mL水溶解，并加样至聚丙烯酰胺凝胶柱顶部（见材料表）。
  10. 用水洗脱产物，收集1 - 2 mL的馏分。通过TLC26监测各馏分。将含产物的馏分冻干（先用液氮冷冻，然后在真空条件下置于冻干机中）得到白色粉末状目标产物。使用D2O作为溶剂，通过核磁共振（NMR）和质谱（mass spectroscopy）对产物进行表征（参见补充数据文件）。

4. 糖阵列

  1. 铝涂层玻璃载片（ACG载片）的制备19,20,22
    注意：铝涂层玻璃载片的制备工作在中国台湾新竹科学园区的仪器科技研究中心及国家应用研究实验室薄膜技术部完成。
    1. 将涂层载片包装后真空密封，以防止NAO形成，并保持密封状态直至进行表面阳极氧化电化学反应。
  2. 铝涂层玻璃载片的表面阳极氧化19,20,22
    1. 将温控培养箱设定在4 °C。配制0.3 M草酸水溶液并置于冰浴中。取500 mL烧杯，加入磁力搅拌子。
    2. 将0.3 M草酸溶液转移至500 mL烧杯中，然后将一根10 cm长的铂棒作为阴极插入溶液中。在整个阳极氧化过程中持续搅拌（300 rpm）。
    3. 启动实验室示踪软件，点击"设置"按钮，然后选择"函数选择扫描电压”。将起始和终止电压设为25.8 V，点数设为100，限流设为1，扫描延迟设为1,200 ms，然后点击"确定"。
    4. 将铝涂层玻璃面朝向阴极夹紧。点击"运行测试"按钮。观察电流读数（约8–10 mA）。
    5. 表面阳极氧化完成后，用双蒸水彻底清洗载片，用氮气吹干，然后储存于相对湿度30%的环境中以备后续使用。
  3. ACG糖芯片微阵列的制备22
    1. 分别以乙二醇为溶剂，单独配制100 µL浓度为10 mM的各单价糖类（I–XI）溶液。
    2. 用打印缓冲液（80%乙二醇和20%去离子水）稀释上述糖溶液，使其终浓度为100 µM。
    3. 为进行异源配体研究，取5 µL各I–XI糖溶液，并向每份中加入5 µL Man5GlcNAc2 （1:1比例）。
    4. 使用机器人点样针（见材料表），将先前制备的糖溶液以每点0.6 nL的量点样至ACG载片上31。
    5. 将点样后的载片存放在湿度可控的干燥箱中，待结合实验时使用。
  4. 绘制HIV-1广谱中和抗体PG9的糖类表位图谱22
    1. 配制含BSA的PBST缓冲液（3% w/v），体积为1 mL。
    2. 在含BSA的PBST缓冲液（3% w/v）中配制70 µL浓度为50 µg/mL的PG9抗体溶液。
    3. 在避光条件下，于含BSA的PBST缓冲液（3% w/v）中配制120 µL浓度为50 µg/mL的二抗荧光标记抗体（驴抗人IgG，Alexa Fluor 647标记）。
    4. 将一抗（PG9）与二抗荧光标记抗体按1:1比例混合（各60 µL）。将预混抗体在4 °C孵育30分钟。
    5. 将ACG载片装入分为16孔的载片孵育腔中。向糖芯片区域加入100 µL预混抗体，于4 °C孵育16小时。
    6. 用移液器吸出预混抗体，移除载片孵育腔。
    7. 先用PBST缓冲液（PBS含0.05% Tween-20）清洗载片，再用去离子水冲洗，随后在2,000 × g条件下离心干燥。
    8. 打开微阵列图像分析软件（见材料表），将载片以点阵面朝下的方式插入扫描仪。
    9. 点击"设置"菜单，将图像分辨率为设为每像素5 µm，波长设为635 nm，PMT450和功率均设为100%。
    10. 点击"扫描"按钮，开始对载片成像。
    11. 点击"文件"图标，将扫描图像保存为tif格式。
    12. 根据软件用户指南进行图像分析32。
    13. 计算荧光总强度，并使用图像处理软件33（见材料表）进行可视化展示。
      注意：此处所有数据点的平均百分比误差以误差棒表示。

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结果

一种模块化的化学-酶法策略用于合成多种多样的 N-糖类的展示如下 图1该策略基于以下事实：可通过化学-酶法合成三个重要模块，在起始阶段即构建多样性，随后在3位进行α特异性的甘露糖基化O 和/或 6-O 共同核心三糖中甘露糖残基的位置 N-糖链。考虑到双、三和四触角复合型结构的多样性 N-糖链结构，我们认为，一组寡糖基供体与带有预先安装烷基手柄的核心三糖受体可作为起始材料，用于构建目标结构多样性（图1）。先前已证明糖基氟化物供体在构建复杂聚糖库中的适用性21.

为了验证本策略的有效性，选择了一个双天线异构体结构（10，图3

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讨论

一类包括 PG9、PG16 以及 PGT128、PGT141–145 的 HIV-1 广谱中和抗体被报道具有高效中和 70%–80% 流行性 HIV-1 分离株的能力。这些广谱中和抗体的表位在 HIV-1 M 组所有变异株中高度保守，因此可能为设计有效的 HIV 疫苗免疫原以诱导中和抗体提供指导。23,24,25作为我们持续研究HIV-1广谱中和抗体糖链表位的一部分，我们报道了通过化学与酶法合成一系列高甘露糖型、杂合型和复杂型寡糖，以构建糖芯片阵列21,22然而，常用的聚糖芯片在 N羟基琥珀酰亚胺包被（NHS）玻片无法检测低亲和力的碳水化合物-蛋白质相互作用，可能是由于活性基团水解导致聚糖分布不均所致 N-羟基琥珀酰亚胺功能基团。为克服传统芯片阵列格式的局限性，我们开发了一种基于氧化铝涂层玻璃（ACG...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢中国台湾新竹科学园区仪器科技研究中心（ITRC）薄膜技术部及国家实验研究院的大力支持。本研究工作得到台湾科技主管部门（项目编号：MOST 105-0210-01-13-01）和中国台湾“中央研究院”的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙酸Sigma Aldrich64197
乙腈Sigma Aldrich75058
乙酸酐Sigma Aldrich108247
无水硫酸镁Sigma Aldrich7487889
三氟化硼乙醚络合物Sigma Aldrich109637
牛血清白蛋白Sigma Aldrich9048468
Bio-Gel P2 聚丙烯酰胺Bio-Rad1504118
二氯双(环戊二烯基)铪(IV)Sigma Aldrich12116664
β-1,4-半乳糖基转移酶（来自牛乳）Sigma Aldrich48279
采用机器人针 SMP3（Stealth Micro Spotting Pins）的 BioDot 笛卡尔点样技术Arrayit
钼酸铈铵TCIC1794
硝酸铈铵Sigma Aldrich16774213
洁净载玻片 Schott 
5′-单磷酸胞苷-N-乙酰神经氨酸Sigma Aldrich3063716
氘代氯仿Sigma Aldrich865496
驴抗人IgG（Alexa Fluor647标记）Jackson Immuno Research, USA709605098
二氯甲烷Sigma Aldrich75092
二乙基氨基硫三氟化物Sigma Aldrich38078090
二甲基甲酰胺Sigma Aldrich68122
乙酸乙酯Sigma Aldrich141786
乙二醇Acros Organic107211
FAST frame 载玻片孵育室Sigma Aldrich
5'-二磷酸鸟苷-b-L-岩藻糖二钠盐 Sigma Aldrich15839700
Lab tracer 2.0 软件 方案第4节
GenePix Pro 4300A 读板仪（微阵列图像分析）moleculardeviceswww.moleculardevices.com
GraphPad Prism 软件（图像处理）GraphPad Software, Inchttp://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/
氢氧化锂Sigma Aldrich1310652
氯化锰Sigma Aldrich7773015
甲醇Sigma Aldrich67561
正丁醇Sigma Aldrich71363
草酸Acros Organic144627
氢氧化钯Sigma Aldrich12135227
磷酸盐缓冲液Thermo Fisher Scientific 10010023
吡啶Sigma Aldrich110861
对甲苯磺酸一水合物Sigma Aldrich773476
三氟甲磺酸银Sigma Aldrich2923286
碳酸氢钠Sigma Aldrich144558
氯化钠Sigma Aldrich7647145
碳酸氢钠Sigma Aldrich144558
甲醇钠 Sigma Aldrich124414
硫酸钠Sigma Aldrich7757826
甲苯 Sigma Aldrich108883
Tris 缓冲液 AmrescoN/A超纯级
Tween-20Amresco9005645
尿苷二磷酸半乳糖（UDP-半乳糖）Sigma Aldrich137868521

参考文献

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  28. JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
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  30. Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1 (5), 773-783 (2016).
  31. Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
  32. GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners User’s Guide & Tutorial. , Axon Instruments/ Molecular Devices Corp. Sunnyvale, CA. (2017).
  33. GraphPad Prism version 6.01 for Windows. GraphPad Software. , La Jolla California USA. Available from: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/ (2017).

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