本文描述了一种利用高分辨率谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）对小鼠视网膜进行活体成像的实验方案。重点针对视乳头周围区域的视网膜神经节细胞（RGC），介绍了多种扫描与定量分析方法。
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本文描述了一种利用高分辨率谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）对小鼠视网膜进行活体成像的实验方案。重点针对视乳头周围区域的视网膜神经节细胞（RGC），介绍了多种扫描与定量分析方法。
视网膜结构改变是眼科疾病的常见表现。光学相干断层扫描（OCT）可实现对其的识别。 体内—快速、重复且高分辨率地成像。本方案将描述小鼠视网膜的光学相干断层扫描（OCT）成像，作为一种研究视神经病变（OPN）的有力工具。OCT系统是一种基于干涉测量技术的非侵入性方法，可作为常规 死后 组织学检测。该方法可快速准确地评估视网膜厚度，从而实现对视网膜变薄或增厚等变化的动态监测。本文以 Opa1 为例，介绍成像过程及分析方法。delTTAG 小鼠品系。建议采用三种扫描方式，并提供两种定量分析方法：标准卡尺法和自制卡尺法。后者在进行放射状扫描时更适用于视乳头周围视网膜，因其精度更高，更适合分析较薄的结构。本文所述所有方法均针对视网膜神经节细胞（RGC）设计，但可轻松适配于其他细胞群体。总之，光学相干断层扫描（OCT）在小鼠模型表型分析中具有高效性，并有望用于治疗干预效果的可靠评估。
光学相干断层扫描（OCT）是一种诊断工具，可实现对视网膜结构1（包括视神经乳头（ONH））的检查。多年来，它已成为评估人类2,3以及啮齿类动物4,5疾病进展的可靠指标。该技术利用干涉测量法生成视网膜各层的横截面图像，轴向分辨率达2-µm。最内层为视网膜神经纤维层（RNFL），其中含有视网膜神经节细胞（RGC）的轴突；其外侧为神经节细胞层（GCL），主要包含RGC胞体。接下来是内丛状层（IPL），RGC的树突在此与双极细胞、水平细胞和无长突细胞的轴突相连接。这些细胞连同水平细胞共同构成内核层（INL），其突起进一步与光感受器细胞的轴突在外丛状层（OPL）中连接。随后是外核层（ONL），包含光感受器细胞的胞体，该层与光感受器层之间由外限制膜（OLM）分隔，后者也称为内节/外节（IS/OS）层。最后，在小鼠视网膜中可观察到的最外层结构为视网膜色素上皮层（RPE）和脉络膜（C）。在小鼠中，RNFL通常过于菲薄而难以单独测量；因此，分析RNFL/GCL复合层更为可取4,5。另一种选择是神经节细胞复合层（GC complex layer），该层除包....
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实验方案已获得法国国家健康与医学研究院（Inserm；法国蒙彼利埃）的批准，符合欧洲相关指令，并遵守ARVO关于在眼科研究中使用动物的声明。本研究在朗格多克-鲁西永动物实验伦理委员会（CEEALR；编号CEEA-LR-12123）的许可下进行。
1. 仪器设置与成像前准备
注意：此处使用谱域（SD）眼科成像系统对小鼠视网膜进行光学相干断层扫描（OCT）（图1A）。SD-OCT设备由基座和带有啮齿类动物校准平台（RAS）的动物成像支架（AIM）组成（图1B）。基座包含计算机、OCT引擎、SD-OCT探头以及专用于小鼠的镜头。探头安装在AIM上，AIM包含Z轴平移装置。RAS通过配备X轴和Y轴平移台的载物台、可旋转和摆动的样品盒，以及可拆卸的咬合杆和鼻带，实现小鼠的精确定位。制造商提供的软件可用于OCT图像的采集与分析，但后者也可使用开源图像处理程序完成。
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SD-OCT 技术能够实现与组织学相媲美的视网膜成像和厚度分析，且速度更快、细节更丰富图3）。如在野生型C57Bl/6小鼠中所呈现的，尽管SD-OCT扫描的质量（图3A，右侧）不如视网膜横截面图像的成像效果好图 3A，左侧），可显示更多层（例如， OLM）。此外，该方法包括小鼠准备在内仅需约40分钟，而组织学分析则需数天至数周。最后，该方法无需进行苏木精、伊红和番红等处理与染色步骤，避免了可能的组织损伤及由此导致的错误数据采集。OCT可清晰测量的视网膜层次包括RNFL/GCL、IPL、INL、OPL、ONL、IS/OS、RPE和C（图3B），因此可对整个视网膜进行复杂而深入的研究。视网膜结构的变化能够反映疾病的发展过程。对于视神经通路疾病（OPNs），这主要涉及视网膜神经节细胞（RGCs）以及视神经（ON），因而也包括.......
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OCT系统是一种非侵入性 体内 成像方法，可提供高分辨率的类似视网膜横截面的扫描图像。因此，其主要优势在于具备进行详细分析的潜力，并能很好地将常规应用于人类的实验方案转用于小鼠模型。
在 Opa1delTTAG 突变小鼠的示例中，谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）结果显示视网膜神经纤维层（RNFL）和神经节细胞复合层厚度增加，从而为进一步探索常染色体显性视神经萎缩（DOA）的病理生理机制提供了可能9。仅依靠组织学分析无法实现这一发现。相比之下，组织学无法像环形或放射状OCT扫描那样对整个视网膜进行可视化观察。此外，考虑到在包含多个时间点的研究中所需动物数量增加，组织学方法更加耗时且成本更高。事实上，SD-OCT技术推动了对DOA中一种新型视网膜细胞——穆勒细胞（Müller cell）——的发现9。尽管该系统无法实现单细胞分辨率或特异性细胞识别，但通过对视乳头周围区域以厚度或整体状态为重点的分析，已足以检测到细胞退变。随后，可在.......
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作者无任何利益冲突需要披露。
本工作由法国国家健康与医学研究院（Inserm）、蒙彼利埃大学、法国视网膜协会、法国国家盲人与视力障碍者联盟（UNADEV）、Wolfram综合征协会、法国医学研究基金会、法国基金会以及卓越实验室EpiGenMed项目资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 小鼠 | |||
| Opa1delTTAG 小鼠 | 法国蒙彼利埃神经科学研究所，INSERM UMR 1051 | - | Opa1基因敲入小鼠携带 C57Bl6/J 背景下的 OPA1 c.2708_2711delTTAG 突变 |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
| 设备 | |||
| EnVisu R2200 SD-OCT 成像系统 | Bioptigen，Leica Microsystems，德国 | - | 光谱域光学相干断层扫描系统 |
| EnVisu R2200 SD-OCT 成像系统软件 | Bioptigen，Leica Microsystems，德国 | - | OCT图像采集与分析软件 |
| ImageJ 1.48v | Wayne Rasband，美国国立卫生研究院 | - | 用于分析的软件，需下载并安装两个自制宏：http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool |
| 自调节加热板 | Bioseb，法国 | BIO-062 | 抗低体温 |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
| 耗材 | |||
| 鼻带 | - | - | 弹性带 |
| 纱布垫 3" × 3" | 美国 Curad 公司 | CUR20434ERB | 抗低体温保护 |
| 双头棉签 applicator | 美丽之源，CVS健康公司，美国 | - | 凝胶应用 |
| 棉签 | 法国 CentraVet | T.7979C.CS | 小鼠定位 |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
| 试剂和药物 | |||
| Néosynéphrine Faure 10% | Laboratoires Europhtha，摩纳哥 | - | 瞳孔散大 |
| 0.5% Mydriaticum | 实验室 Thé法国 | 3397908 | 瞳孔散大 |
| Cebesine 0.4% | Laboratoire Chauvin, Bausch&安普&罗姆，法国 | 3192342 | 局部麻醉 |
| Imalgene 1000 | 法国 Merial / 法国 CentraVet | IMA004 | 全身麻醉 |
| Rompun | 拜耳医疗，德国/ CentraVet，法国 | ROM001 | 全身麻醉、镇痛、肌肉松弛 |
| NaCl 0.9% | 法国 Osalia 实验室 | 103697114 | 生理盐水 |
| Systene Ultra | 爱尔康，诺华，美国 | - | 眼部水合 |
| GenTeal | 爱尔康，诺华，美国 | - | 用于减少光线折射和混浊的眼科凝胶 |
| Aniospray Surf 29 | 法国 Laboratoires Anios | 59844 | 消毒剂 |
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