方法文章

光学相干断层扫描：活体成像小鼠视网膜神经节细胞 In Vivo

19.2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/55865

⸱

2017年9月22日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1INSERM U1051, Institut of Neurosciences of Montpellier, 2CNRS UMS3426, BioCampus Montepellier, 3University of Montpellier, 4CHRU Montpellier, Centre of Reference for Genetic Sensory Diseases, CHU Gui de Chauliac Hospital

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文描述了一种利用高分辨率谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）对小鼠视网膜进行活体成像的实验方案。重点针对视乳头周围区域的视网膜神经节细胞（RGC），介绍了多种扫描与定量分析方法。

摘要

视网膜结构改变是眼科疾病的常见表现。光学相干断层扫描（OCT）可实现对其的识别。 体内—快速、重复且高分辨率地成像。本方案将描述小鼠视网膜的光学相干断层扫描（OCT）成像，作为一种研究视神经病变（OPN）的有力工具。OCT系统是一种基于干涉测量技术的非侵入性方法，可作为常规 死后 组织学检测。该方法可快速准确地评估视网膜厚度，从而实现对视网膜变薄或增厚等变化的动态监测。本文以 Opa1 为例，介绍成像过程及分析方法。delTTAG 小鼠品系。建议采用三种扫描方式，并提供两种定量分析方法：标准卡尺法和自制卡尺法。后者在进行放射状扫描时更适用于视乳头周围视网膜，因其精度更高，更适合分析较薄的结构。本文所述所有方法均针对视网膜神经节细胞（RGC）设计，但可轻松适配于其他细胞群体。总之，光学相干断层扫描（OCT）在小鼠模型表型分析中具有高效性，并有望用于治疗干预效果的可靠评估。

引言

光学相干断层扫描（OCT）是一种诊断工具，可实现对视网膜结构1（包括视神经乳头（ONH））的检查。多年来，它已成为评估人类2,3以及啮齿类动物4,5疾病进展的可靠指标。该技术利用干涉测量法生成视网膜各层的横截面图像，轴向分辨率达2-µm。最内层为视网膜神经纤维层（RNFL），其中含有视网膜神经节细胞（RGC）的轴突；其外侧为神经节细胞层（GCL），主要包含RGC胞体。接下来是内丛状层（IPL），RGC的树突在此与双极细胞、水平细胞和无长突细胞的轴突相连接。这些细胞连同水平细胞共同构成内核层（INL），其突起进一步与光感受器细胞的轴突在外丛状层（OPL）中连接。随后是外核层（ONL），包含光感受器细胞的胞体，该层与光感受器层之间由外限制膜（OLM）分隔，后者也称为内节/外节（IS/OS）层。最后，在小鼠视网膜中可观察到的最外层结构为视网膜色素上皮层（RPE）和脉络膜（C）。在小鼠中，RNFL通常过于菲薄而难以单独测量；因此，分析RNFL/GCL复合层更为可取4,5。另一种选择是神经节细胞复合层（GC complex layer），该层除包含GCL外，还纳入了IPL，因而厚度更大，在OCT扫描中更易于测量4。因此，OCT可提供关于视网膜病理状态的信息，例如在视神经病变（OPNs）中的应用。

或者，小鼠视网膜的厚度通常通过以下方法进行分析： 死后 组织学。然而，该技术在组织采集、固定、切片、染色、封片等方面存在局限性 等等。 因此，一些缺陷（例如细微的厚度变化）无法被检测到。最后，由于同一小鼠无法在多个时间点进行检测，导致每项研究所需的动物数量大幅增加，而光学相干断层扫描（OCT）则不存在这一问题。综上所述，OCT技术因其非侵入性、高分辨率、可重复性、随时间进行动态监测以及操作简便等优势，成为视网膜疾病研究的首选方法。

小鼠模型被用于鉴定基因缺陷并阐明视网膜病变的分子机制6。视神经病变（OPN）是一种以视神经（ON）严重损伤为特征的视网膜病变，ON由约120万根视网膜神经节细胞（RGC）轴突组成。OPN可原发于视神经，也可继发于其他先天性或后天性疾病7，导致视野缺损，最终致盲。OPN的典型特征是RGC丢失和ON损伤，这些可在人类光学相干断层扫描（OCT）中观察到，表现为视网膜神经纤维层（RNFL）和神经节细胞层（GCL）变薄2,3。然而，OPN的病理生理机制仍不甚清楚，因此仍需对小鼠视网膜进行研究。

本文以 Opa1delTTAG 小鼠品系8,9（一种常染色体显性视神经萎缩（DOA）模型）为例，描述了视网膜各层厚度的成像与定量方法10。为评估视网膜神经节细胞（RGC）的病理生理状态，对放射状、矩形及环形扫描图像进行了定量分析。定量可采用光学相干断层扫描（OCT）软件自带的标准卡尺工具，或使用为开源图像处理程序开发的自制宏来完成。标准卡尺操作困难，且其宽度常大于视网膜神经纤维层（RNFL）/神经节细胞层（GCL）的实际厚度；而自制卡尺使用简便、可重复性强且更为精确。该宏可在视盘周围区域视盘两侧的固定位置，自动识别视网膜层并进行五个点的厚度测量。本方案的目标是描述OCT扫描的获取流程，以明确视网膜定位，重点关注RGCs的分析。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

实验方案已获得法国国家健康与医学研究院（Inserm；法国蒙彼利埃）的批准，符合欧洲相关指令，并遵守ARVO关于在眼科研究中使用动物的声明。本研究在朗格多克-鲁西永动物实验伦理委员会（CEEALR；编号CEEA-LR-12123）的许可下进行。

1. 仪器设置与成像前准备

注意：此处使用谱域（SD）眼科成像系统对小鼠视网膜进行光学相干断层扫描（OCT）（图1A）。SD-OCT设备由基座和带有啮齿类动物校准平台（RAS）的动物成像支架（AIM）组成（图1B）。基座包含计算机、OCT引擎、SD-OCT探头以及专用于小鼠的镜头。探头安装在AIM上，AIM包含Z轴平移装置。RAS通过配备X轴和Y轴平移台的载物台、可旋转和摆动的样品盒，以及可拆卸的咬合杆和鼻带，实现小鼠的精确定位。制造商提供的软件可用于OCT图像的采集与分析，但后者也可使用开源图像处理程序完成。

  1. 将探针牢固地放入AIM中。
  2. 将小鼠专用镜头连接至探头。
  3. 调整参考臂设置以适配特定镜头（此处功率设为 086，位置设为 964）。
  4. 确保小鼠专用镜头与胶片盒保持足够距离，将带有鼻带的咬合杆安装到胶片盒上。
    注意：可通过位于AIM后部的Z轴调节螺钉来调整镜头与暗盒之间的距离。鼻带为市售弹性带，应根据小鼠的大小调整其张力。
  5. 打开电源（推车右下角），然后启动计算机。
  6. 双击屏幕上的相应快捷方式以启动成像程序。
    注意：这取决于镜头类型；此处为小鼠视网膜。
  7. 创建一项新的临床研究并添加所需的方案；否则，使用现有的临床研究和/或方案。
    1. 通过选择添加一项新研究 "研究名称"; "ID"; "治疗组规格" （此处， "未分类"）；以及预定义的 "扫描方案"，如果存在的话。
  8. 选择一个 "检查者" 在 "临床研究" 部分
    注意：对于新的 "检查者"，前往 "设置检测人员 & 医师" 来定义它。
  9. 在“患者/检查”部分，通过点击“添加患者”并输入 "ID", "名称", "姓氏", "性别"，以及 "出生日期" （可选）
    注意：若更方便，可在每次测试小鼠前进行此操作。确保编号不超过10个字符。该小鼠双眼的屈光误差为0，眼轴长度为23.0。
  10. 点击 "添加考试" 并选择所需的 "实验方案" 通过添加 "预设扫描" 从列表中选择，从首先测量的眼睛开始（此处为右眼），或通过自定义扫描进行。
  11. 要自定义扫描，可使用现有的扫描作为模板进行编辑，或从头开始创建。 "添加自定义扫描" 选项。添加所有扫描至列表后，使用以下方式定义新协议 "输入 "新实验方案名称" 选项（OS：oculus sinister，左眼；OD：oculus dexter，右眼）。
    注意：本方案包含三次扫描：（i）径向扫描，直径1.4 mm，水平和垂直偏移均为0 mm，每B扫描包含1,000条A扫描线，每体积100个B扫描，每B扫描1帧，每B扫描包含80条无效A扫描线，共1个体积；（ii）矩形扫描，长和宽均为1.4 mm，角度0°，水平和垂直偏移均为0 mm，每B扫描包含1,000条A扫描线，共100个B扫描，每B扫描1帧，每B扫描包含80条无效A扫描线，共1个体积；（iii）环形扫描，最小直径0.4 mm，最大直径0.6 mm，水平和垂直偏移均为0 mm，每B扫描包含1,000条A扫描线，每体积3个B扫描，每B扫描48帧，每B扫描包含80条无效A扫描线，共1个体积。

2. 小鼠准备

  1. 瞳孔散大与固定
    1. 在数据采集前至少15分钟，向小鼠眼内滴入10%去氧肾上腺素滴眼液，去除多余液体后，再滴入0.5%托吡卡胺滴眼液。
      注意：首次散瞳可一次性对本实验批次中所有小鼠进行。确保液体处于室温。
    2. 在实施全身麻醉后（步骤2.2），立即滴加0.4%盐酸奥布卡因滴眼液，保持3秒以麻醉并固定眼球。随后擦去滴眼液，并重复滴入10%去氧肾上腺素和0.5%托吡卡胺，以确保瞳孔充分散大。
      注意：确保液体处于室温，并防止小鼠吞咽奥布卡因。
  2. 全身麻醉
    1. 配制含氯胺酮（20 mg/mL）和赛拉嗪（1.17 mg/mL）的生理盐水麻醉溶液。4 °C保存，最长不超过2周。
    2. 测试前约5分钟，根据小鼠年龄和体型，按每克体重5 - 10 µL剂量经腹腔注射麻醉液。
      注意：幼龄和/或体型瘦小的小鼠所需麻醉剂量较小，起效更快，但苏醒也更快。本实验中采用8 µL/g（即氯胺酮160 mg/kg，赛拉嗪9.33 mg/kg）。
    3. 可选：使用黏性滴眼液或眼用凝胶润滑眼球，以防角膜干燥。

3. 小鼠体位摆放

  1. 使用粘稠的甘油基滴眼液润滑眼睛，以保持角膜湿润。
    注意：若检查过程中眼睛显得干燥，需重新滴加滴眼液。
  2. 用外科纱布包裹小鼠，以保持其体温。
  3. 使用海绵或棉芯，在每只眼睛上涂抹一层含0.3%羟丙基甲基纤维素的眼用凝胶，以减少光线折射、避免混浊，并确保角膜湿润。操作时应将眼睫毛和胡须拨开。
  4. 将小鼠放入样品架中，头部保持正直并朝向前方。
  5. 轻轻打开咬合杆夹具，将咬合杆放入小鼠口中，并使用鼻带固定其位置。
    注意：确保咬合杆位于样品架中央。
  6. 若正在检测右（左）眼，则在右侧（左侧）下方放置棉卷。
  7. 保持夹式对焦头固定在小鼠专用镜头上，通过逆时针旋转Z轴平移螺钉，将镜头缓慢移向眼睛。
  8. 通过旋转和摆动样品架，以及调节咬合杆和X轴平移螺钉，预先设定小鼠的位置；目标是使右眼正对镜头，从而对齐眼睛与镜头的光轴。
    注意：若小鼠位置过高或过低，应首先使用Y轴平移螺钉进行调整。
  9. 在 "Exam" 中选择首个扫描项目，点击 "Start Aiming"，并对视网膜成像进行进一步的手动调整。
    1. 使用Z轴平移螺钉，在左侧面板上垂直移动视网膜（图2，水平B扫描对齐），在右侧面板上水平移动视网膜（图2，垂直B扫描对齐）。
    2. 旋转样品架，通过上下移动视盘（ONH）使其位于右侧面板中央；使用咬合杆螺钉校正右侧面板上的视网膜直线；摆动样品架，使视盘位于左侧面板中央。
    3. 使用X轴平移螺钉校准左侧面板上的视网膜水平。在明确各调节装置主要功能的基础上，进一步调整视网膜位置，使视盘居中。
      注意：如有需要，可使用Y轴平移螺钉在右侧面板上上下移动视盘。可在每次扫描之间随时对位置进行精细调整。

4. 视神经乳头和视网膜的谱域光学相干断层成像（SD-OCT）

  1. 调整满意后，点击 "开始扫描" 以开始 SD-OCT 扫描。
    1. 若无需进行三维成像，请取消勾选 OCU 选项。
  2. 保存扫描图像和报告。
  3. 继续进行下一次扫描。
  4. 如需对第二只眼成像，在撤回镜头后，相应地旋转盒式组件，并重复步骤 3.6 - 4.3。

5. 采集完成

  1. 采集完成后，将小鼠从样品架中取出，每只眼睛滴加含0.3%羟丙基甲基纤维素的眼用凝胶，并将小鼠置于加热板上使其苏醒。
  2. 最后一次采集结束后，关闭软件，并关闭计算机和OCT仪器（电源按钮）。
  3. 使用消毒剂清洁样品架。

6. 分析

  1. 进行视网膜层厚度测量时，使用制造商提供的自动分割软件。
    1. 点击 "患者"，从列表中选择所需的 "检查"，然后点击 "查看检查" 选项。
    2. 通过在目标扫描图像上右键单击文件夹图标，将所需的OCT数据加载到OCT软件中。
    3. 右键单击B扫描图像；通过启用最多10个测量卡尺来配置卡尺；并输入其名称、角度和颜色。
    4. 通过在B扫描图像上右键单击，选择所需的卡尺，并将其相应地放置在视网膜上进行测量。
      注意：对于以视神经乳头（ONH）为中心的扫描，在其两侧各设置5个卡尺，彼此等距分布。进行乳头周围分析时，确保卡尺不要离ONH太远。对于径向扫描，分析OCT软件选定的每幅扫描中的10张图像。其编号可在 "报告" 文件夹中找到。
    5. 通过右键单击B扫描图像并点击 "保存结果"，将结果保存至电子表格软件进行分析。
      注意：结果文件位于与扫描数据相同的文件夹中。
  2. 或者，使用为开源图像处理程序开发的自制卡尺宏 "MRI Retina Tool"（参见材料表）。
    1. 确保 "MRI Retina Tool" 和 "Modify Polygon Section Tool" 宏已激活。加载图像后，点击m按钮以开始测量。
      注意：该宏会自动在ONH两侧各创建一个长度为0.2 mm的测量盒。每个测量盒包含5个作为卡尺使用的测量点。其横向位置不可更改，专为径向扫描中的乳头周围区域定制。测量盒的水平位置预设用于测量RNFL/GCL厚度，但可轻松修改以测量GC复合层。如果扫描质量较差，则需要调整水平位置，或从分析中排除该图像。
    2. 如需进行水平调整，请点击e按钮。在新打开的 "ROI Manager" 窗口中，选择第一个测量盒。
    3. 点击蓝色多边形按钮，并通过点击图像中被测层的边界来调整第一个测量盒的位置。
    4. 首先在 "ROI Manager" 窗口中选择第二个测量盒，然后点击相应的图像区域完成调整。点击r按钮重新测量。在 "Measurements" 窗口中查看结果。
      注意：结果可随时复制到电子表格软件中。结果包含以下数值（右测量盒r、左测量盒l及总体total）：Intden — 测量盒内的积分密度；Area — 测量面积，单位为 mm2；Len — 测量盒内卡尺的长度，单位为 mm；Mean — 测量盒内信号的平均强度；Std — 信号平均强度的标准误差。
    5. 继续处理下一张图像。
    6. 在电子表格软件中进一步分析数据。
      注意：要计算该层的平均厚度，请取10个Len值的均值。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

SD-OCT 技术能够实现与组织学相媲美的视网膜成像和厚度分析，且速度更快、细节更丰富图3）。如在野生型C57Bl/6小鼠中所呈现的，尽管SD-OCT扫描的质量（图3A，右侧）不如视网膜横截面图像的成像效果好图 3A，左侧），可显示更多层（例如， OLM）。此外，该方法包括小鼠准备在内仅需约40分钟，而组织学分析则需数天至数周。最后，该方法无需进行苏木精、伊红和番红等处理与染色步骤，避免了可能的组织损伤及由此导致的错误数据采集。OCT可清晰测量的视网膜层次包括RNFL/GCL、IPL、INL、OPL、ONL、IS/OS、RPE和C（图3B），因此可对整个视网膜进行复杂而深入的研究。视网膜结构的变化能够反映疾病的发展过程。对于视神经通路疾病（OPNs），这主要涉及视网膜神经节细胞（RGCs）以及视神经（ON），因而也包括...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

OCT系统是一种非侵入性 体内 成像方法，可提供高分辨率的类似视网膜横截面的扫描图像。因此，其主要优势在于具备进行详细分析的潜力，并能很好地将常规应用于人类的实验方案转用于小鼠模型。

在 Opa1delTTAG 突变小鼠的示例中，谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）结果显示视网膜神经纤维层（RNFL）和神经节细胞复合层厚度增加，从而为进一步探索常染色体显性视神经萎缩（DOA）的病理生理机制提供了可能9。仅依靠组织学分析无法实现这一发现。相比之下，组织学无法像环形或放射状OCT扫描那样对整个视网膜进行可视化观察。此外，考虑到在包含多个时间点的研究中所需动物数量增加，组织学方法更加耗时且成本更高。事实上，SD-OCT技术推动了对DOA中一种新型视网膜细胞——穆勒细胞（Müller cell）——的发现9。尽管该系统无法实现单细胞分辨率或特异性细胞识别，但通过对视乳头周围区域以厚度或整体状态为重点的分析，已足以检测到细胞退变。随后，可在...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由法国国家健康与医学研究院（Inserm）、蒙彼利埃大学、法国视网膜协会、法国国家盲人与视力障碍者联盟（UNADEV）、Wolfram综合征协会、法国医学研究基金会、法国基金会以及卓越实验室EpiGenMed项目资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
小鼠
Opa1delTTAG 小鼠法国蒙彼利埃神经科学研究所，INSERM UMR 1051-Opa1基因敲入小鼠携带  C57Bl6/J 背景下的 OPA1 c.2708_2711delTTAG 突变
名称公司目录编号评论
设备
EnVisu R2200 SD-OCT 成像系统Bioptigen，Leica Microsystems，德国-光谱域光学相干断层扫描系统
EnVisu R2200 SD-OCT 成像系统软件Bioptigen，Leica Microsystems，德国-OCT图像采集与分析软件
ImageJ 1.48vWayne Rasband，美国国立卫生研究院-用于分析的软件，需下载并安装两个自制宏：http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool
自调节加热板Bioseb，法国BIO-062抗低体温
名称公司目录编号评论
耗材
鼻带--弹性带
纱布垫 3" × 3"美国 Curad 公司CUR20434ERB抗低体温保护
双头棉签 applicator美丽之源，CVS健康公司，美国-凝胶应用
棉签法国 CentraVetT.7979C.CS小鼠定位
名称公司目录编号评论
试剂和药物
Néosynéphrine Faure 10%Laboratoires Europhtha，摩纳哥-瞳孔散大
0.5% Mydriaticum实验室 Thé法国3397908瞳孔散大
Cebesine 0.4%Laboratoire Chauvin, Bausch&安普&罗姆，法国3192342局部麻醉
Imalgene 1000法国 Merial / 法国 CentraVetIMA004全身麻醉
Rompun拜耳医疗，德国/ CentraVet，法国ROM001全身麻醉、镇痛、肌肉松弛
NaCl 0.9%法国 Osalia 实验室 103697114生理盐水
Systene Ultra爱尔康，诺华，美国-眼部水合
GenTeal爱尔康，诺华，美国-用于减少光线折射和混浊的眼科凝胶
Aniospray Surf 29法国 Laboratoires Anios59844消毒剂

参考文献

  1. Drexler, W., Fujimoto, J. G. State-of-the-art retinal optical coherence tomography. Prog Retin Eye Res. 27 (1), 45-88 (2008).
  2. Grenier, J., et al. WFS1 in Optic Neuropathies: Mutation Findings in Nonsyndromic Optic Atrophy and Assessment of Clinical Severity. Ophthalmology. 123 (9), 1989-1998 (2016).
  3. Zmyslowska, A., et al. Retinal thinning as a marker of disease progression in patients with Wolfram syndrome. Diabetes Care. 38 (3), e36-e37 (2015).
  4. Fischer, M. D., et al. Noninvasive, in vivo assessment of mouse retinal structure using optical coherence tomography. PLoS One. 4 (10), e7507(2009).
  5. Grieve, K., Thouvenin, O., Sengupta, A., Borderie, V. M., Paques, M. Appearance of the Retina With Full-Field Optical Coherence Tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (9), OCT96-OCT104 (2016).
  6. Chang, B., et al. Retinal degeneration mutants in the mouse. Vision Res. 42 (4), 517-525 (2002).
  7. Mustafa, S., Pandit, L. Approach to diagnosis and management of optic neuropathy. Neurol India. 62 (6), 599-605 (2014).
  8. Sarzi, E., et al. The human OPA1delTTAG mutation induces premature age-related systemic neurodegeneration in mouse. Brain. 135 (Pt 12), 3599-3613 (2012).
  9. Sarzi, E., et al. Increased steroidogenesis promotes early-onset and severe vision loss in females with OPA1 dominant optic atrophy. Hum Mol Genet. 25 (12), 2539-2551 (2016).
  10. Delettre-Cribaillet, C., Hamel, C. P., Lenaers, G., et al. Optic Atrophy Type 1. Gene Reviews. Pagon, R. A. 7 (2007), University of Washington. Seattle. (2007).
  11. Lenaers, G., et al. Dominant optic atrophy. Orphanet J Rare Dis. 7 (46), (2012).
  12. Delettre, C., et al. Nuclear gene OPA1, encoding a mitochondrial dynamin-related protein, is mutated in dominant optic atrophy. Nat Genet. 26 (2), 207-210 (2000).
  13. Liu, Y., et al. Monitoring retinal morphologic and functional changes in mice following optic nerve crush. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (6), 3766-3774 (2014).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

ImageJ

相关文章