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基于芯片的PIP研究：蛋白质-磷脂酰肌醇相互作用的无标记分析

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DOI：

10.3791/55869

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2017年7月27日

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1Department of Biochemistry and Molecular Biology, The Pennsylvania State University, 2Department of Chemistry, The Pennsylvania State University

本文内容

摘要

本文介绍了一种基于微流控平台的支撑脂双层，用于通过基于pH调节的无标记方法研究蛋白质与磷脂酰肌醇之间的相互作用。

摘要

许多细胞蛋白通过与膜表面相互作用来调控关键的细胞过程。这些相互作用可靶向膜内的特定脂质组分，例如磷脂酰肌醇磷酸酯（PIPs），以确保蛋白在细胞内的特异性定位和/或激活。为了深入理解PIPs及其细胞内PIP结合结构域在细胞生理学中的作用，已有大量研究对此展开。本研究采用基于支持性脂双层（SLBs）的pH调控检测方法，作为研究蛋白-PIP相互作用的工具。在此方法中，使用对pH敏感的邻位-磺基罗丹明B标记的磷脂酰乙醇胺作为探针，用于检测蛋白与含PIP膜表面的结合。当蛋白结合到含PIP的膜界面时，界面电势发生变化（即局部pH改变），从而改变探针分子的质子化状态。本文以磷脂酶C delta1的Pleckstrin同源结构域（PLC-δ1 PH）与磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PI(4,5)P2）之间的相互作用为例，展示了pH调控检测方法的成功应用。该相互作用的表观解离常数（Kd,app）为0.39 ± 0.05 µM，与他人报道的Kd,app值相近。与先前研究结果一致，PLC-δ1 PH结构域对PI(4,5)P2具有高度特异性，对磷脂酰肌醇4-磷酸的结合较弱，且在纯磷脂酰胆碱SLBs上无结合信号。与传统的PIP结合检测方法相比，芯片上PIP检测（PIP-on-a-chip）具有多项优势，包括但不限于样品用量少、无需对配体或受体进行标记、可检测小分子和大分子与膜之间的高亲和力及低亲和力相互作用，以及更高的信噪比。因此，采用PIP-on-a-chip方法将有助于阐明多种膜相互作用的分子机制。此外，该方法还可能用于筛选能够调节蛋白与膜结合能力的潜在治疗分子。

引言

在二维流体膜表面会发生大量相互作用和生化过程。真核细胞中由膜包被的细胞器不仅在生化过程及其相关的蛋白质组方面具有独特性，其脂质组成也各具特征。其中一类特殊的磷脂是磷脂酰肌醇磷酸盐（phosphoinositides, PIPs）。尽管它们仅占细胞脂质组的1%，但在信号转导、自噬以及膜运输等过程中发挥着关键作用1,2,3,4。细胞内的PIP激酶通过对肌醇头部基团进行动态磷酸化，产生七种单磷酸化、双磷酸化或三磷酸化的PIP头部基团5。此外，PIPs可定义膜结构的亚细胞身份，并为含有一个或多个磷脂酰肌醇结合结构域的蛋白质/酶提供特异性的膜锚定位点，例如Pleckstrin同源结构域（Pleckstrin Homology, PH）、Phox同源结构域（Phox Homology, PX）以及epsin N端同源结构域（epsin N-terminal Homology, ENTH）6,7。其中研究最为深入的PIP结合结构域之一是磷脂酶C（phospholipase C, PLC）-δ1的PH结构域，该结构域可特异性地与磷....

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方案

1. 清洁玻璃盖玻片

  1. 在100 mm深的平底硼硅酸盐玻璃皿中，将7倍浓缩清洗液（见材料表）用去离子水稀释7倍，并在水平加热板上加热至95 °C，持续20分钟，或直至浑浊溶液变为澄清。
    注意：溶液温度较高，操作时需谨慎以避免身体伤害。7倍浓缩清洗液为六钠[氧代-[氧代(磷酸根氧代)磷酸根]氧代磷酸根]磷酸盐、2-(2-丁氧基乙氧基)乙醇、钠 1,4-双(2-乙基己氧基)-1,4-二氧代丁烷-2-磺酸盐及其他无害添加物的专有混合物。
  2. 使用镊子将盖玻片（40 mm长 × 22 mm宽 × 0.16–0.19 mm厚）以交替方向排列在铝制染色架上。每片盖玻片之间保留一个空位，防止彼此接触。
  3. 将带有盖玻片的染色架完全浸入清洗液中，保持1小时。
    注意：随着水分蒸发，需持续添加新鲜去离子水，以维持溶液浓度不变。
  4. 将染色架从清洗液中取出，用大量去离子水冲洗盖玻片，以去除残留洗涤剂。
  5. 用氮气吹干盖玻片（每架约5分钟），然后将盖玻片放入窑炉中，在550 °C下退火6小时。
    注意：此为关键步骤，可使玻璃表面的粗糙结构变得平滑。
  6. 将盖玻片放入塑料容器中，并置于无尘环境中保存。

2. 制备微图案化PDMS块

  1. 按10:1（w/w）的质量比将聚二甲基硅氧烷（PDMS）预聚....

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结果

我们采用pH调节实验来研究PLC-δ1 PH 结构域-PI(4,5)P2 微流控芯片上的相互作用图1）。通过详细的实验方案，我们展示了如何制备和组装微流控装置组件，以及如何制备小单层脂质体（SUVs）图2），在装置内形成SLB图3，并测试了蛋白质与含PIP的固体支持双层膜（SLB）的结合。典型的SLB结合实验流程图如图所示。 图4pH 调控检测原理如图所示 图 5 使用PH结构域-PI(4,5)P2 以结合为例。本研究结果表明，PH结构域可结合PI(4,5)P2含SLBs。更具体地说，我们观察到结合后局部pH变得更偏碱性。这种局部pH变化被 oSLB 中存在的 SRB-POPE 荧光探.......

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讨论

每种PIP变体尽管浓度较低，但均存在于特定细胞器的胞质表面，有助于形成细胞器膜独特的物理组成和功能特异性1PIP 的最重要用途之一是作为多种蛋白质的特异性停泊平台，这些蛋白质需要特定的亚细胞定位和/或激活6,7由于蛋白质与磷脂酰肌醇磷酸（PIP）相互作用在细胞生理学和疾病中的重要作用，研究这些相互作用的能力 体外在生理相关背景下研究蛋白质与磷脂酰肌醇磷酸（PIP）的相互作用具有重要意义。本文所述的检测方法能够在含有多种磷脂混合物的流动脂双层环境中，以天然取向的极性头部基团和自然长度的脂肪酰基链来研究蛋白质与PIP的相互作用。

该检测方法结合pH调节作为其检测系统，并以微流控平台中的支撑脂双层（SLB）作为模型膜系统，相较于其他膜结合技术具有独特优势。首先，微流控平台因所需蛋白和脂质的用量极低（总通道体积为40 nL，SLB表面积为1.0 mm2），显著节省了实验材料。此外，可使用.......

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

D.S. 和 C.E.C. 部分由资助项目 AI053531（NIAID，NIH）支持；S.S. 和 P.S.C. 由资助项目 N00014-14-1-0792（ONR）支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
盖玻片
玻璃盖玻片：矩形费舍尔科学公司12-544B22 x 40 x 0.16 - 0.19 mm，1.5号；硼硅酸盐玻璃
7X 清洗液MP 生物医学976670洗涤剂
PYREX 结晶皿康宁公司3140-190平底硼硅酸盐玻璃皿；直径 × 高度（190 × 100 mm）；分销商：VWR（89090-700）
Sentry Xpress 2.0Paragon IndustriesSC-2烧结炉
名称公司目录编号备注
PDMS
Sylgard 184 硅橡胶弹性体套件陶氏化学公司4019862聚二甲基硅氧烷（PDMS）；分销商：艾尔斯沃斯胶粘剂公司
PYREX 干燥器VWR89134-402耐真空
活检打孔器Harris15110-10Harris Uni-Core；1.0 mm 直径；Miltex 活检打孔器带推杆（目录号 15110-10）可作为替代品
名称公司目录编号备注
设备
等离子清洗系统PlasmaEtchPE25-JW两级直驱油真空泵，O₂ 服务（Krytox 充注）
数字加热板BenchmarkH3760-H通过 Denville Scientific 购买（目录号 1005640）
磨砂显微载玻片VWR48312-003磨砂、精选并预清洁；瑞士玻璃制成；厚度：1 mm；尺寸：75 x 25 mm；GR 144
名称公司目录编号备注
模具
AutoCADAutodeskv.2016用于光刻掩模设计的制图软件
光刻掩模CAD/Art ServicesN/A设计为黑色背景、透明特征，由 CAD/Art Services 在透明掩模（5 x 7 英寸）上以 20k dpi 分辨率打印
硅晶圆University Wafer1575优级，单面抛光；100 mm（4 英寸）直径；525 μm 厚度
SU-8 50MicroChem 公司N/A负性光刻胶；宾夕法尼亚州立大学纳米制造设施财产
SU-8 显影液MicroChem 公司N/A宾夕法尼亚州立大学纳米制造设施财产
名称公司目录编号备注
SUV
1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱Avanti 极性脂质公司850457CPOPC
L-α-磷脂酰肌醇-4-磷酸Avanti 极性脂质公司840045XPI4P
L-α-磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸Avanti 极性脂质公司840046XPI(4,5)P2
1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺Avanti 极性脂质公司850757CPOPE；合成 oSRB-POPE 所需
丽丝胺罗丹明B磺酰氯（混合异构体）赛默飞世尔科技公司L-20合成 oSRB-POPE 所需
pH 敏感性荧光脂质探针（oSRB-POPE）本实验室N/A本实验室合成（Huang D. 等，2013）
玻璃闪烁瓶VWR66022-06520 mL 容量
Aquasonic 250DVWRN/A超声水浴
Nuclepore 轨迹蚀刻膜Whatman110605聚碳酸酯膜；直径：25 mm；孔径：0.1 μm；分销商：Sigma-Aldrich
氯仿VWRCX1054-6色谱纯级
LIPEX 挤出器Transferra NanosciencesT.001LIPEX 10 mL 热压挤出器
Viscotek 802 DLSMalvern 仪器公司N/A动态光散射；宾夕法尼亚州立大学X射线晶体学设施财产
名称公司目录编号备注
数据分析
GraphPad PrismGraphPad 软件公司v.6用于数据分析的曲线拟合软件
名称公司目录编号备注
显微镜
Axiovert 200M 正置荧光显微镜卡尔·蔡司显微系统公司N/A显微镜
AxioCam MRm 相机卡尔·蔡司显微系统公司N/A相机
X-Cite 120Excelitas TechnologiesN/A光源
Alexa 568 滤光片组卡尔·蔡司显微系统公司N/A激发/发射 576/603 nm
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 软件卡尔·蔡司显微系统公司N/A图像处理软件
名称公司目录编号备注
其他
吸头VWR10034-132200 μL 移液器吸头；细长平滑尖端，用于将蛋白溶液加入微流控通道
吸头VWR53509-07010 μL 移液器吸头；细长平滑尖端，用于将囊泡溶液加入微流控通道
Orion Star A321 pH 计赛默飞世尔科技公司STARA3210pH 计
Orion 微型 pH 探针赛默飞世尔科技公司8220BNWP微型 pH 探针
N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸)VWRVWRB30487HEPES，游离酸
氯化钠VWRBDH8014-2.5KGRNaCl
管路Allied Wire & CableTFT-200-24 N内径：0.020–0.026 英寸（0.051–0.066 cm）；壁厚：0.010 英寸（0.025 cm）；柔性聚四氟乙烯薄壁管；天然色
工业级氮气普莱克斯公司N/A本地供应商
工业级氧气普莱克斯公司N/A本地供应商
液氮普莱克斯公司N/A本地供应商

参考文献

  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
  2. Shewan, A., Eastburn, D. J., Mostov, K. Phosphoinositides in cell architecture. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (8), a004796(2011).
  3. Picas, L., ....

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PIP pH C PH 45

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