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基于芯片的PIP研究：蛋白质-磷脂酰肌醇相互作用的无标记分析

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DOI：

10.3791/55869

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2017年7月27日

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1Department of Biochemistry and Molecular Biology, The Pennsylvania State University, 2Department of Chemistry, The Pennsylvania State University

本文内容

摘要

本文介绍了一种基于微流控平台的支撑脂双层，用于通过基于pH调节的无标记方法研究蛋白质与磷脂酰肌醇之间的相互作用。

摘要

许多细胞蛋白通过与膜表面相互作用来调控关键的细胞过程。这些相互作用可靶向膜内的特定脂质组分，例如磷脂酰肌醇磷酸酯（PIPs），以确保蛋白在细胞内的特异性定位和/或激活。为了深入理解PIPs及其细胞内PIP结合结构域在细胞生理学中的作用，已有大量研究对此展开。本研究采用基于支持性脂双层（SLBs）的pH调控检测方法，作为研究蛋白-PIP相互作用的工具。在此方法中，使用对pH敏感的邻位-磺基罗丹明B标记的磷脂酰乙醇胺作为探针，用于检测蛋白与含PIP膜表面的结合。当蛋白结合到含PIP的膜界面时，界面电势发生变化（即局部pH改变），从而改变探针分子的质子化状态。本文以磷脂酶C delta1的Pleckstrin同源结构域（PLC-δ1 PH）与磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PI(4,5)P2）之间的相互作用为例，展示了pH调控检测方法的成功应用。该相互作用的表观解离常数（Kd,app）为0.39 ± 0.05 µM，与他人报道的Kd,app值相近。与先前研究结果一致，PLC-δ1 PH结构域对PI(4,5)P2具有高度特异性，对磷脂酰肌醇4-磷酸的结合较弱，且在纯磷脂酰胆碱SLBs上无结合信号。与传统的PIP结合检测方法相比，芯片上PIP检测（PIP-on-a-chip）具有多项优势，包括但不限于样品用量少、无需对配体或受体进行标记、可检测小分子和大分子与膜之间的高亲和力及低亲和力相互作用，以及更高的信噪比。因此，采用PIP-on-a-chip方法将有助于阐明多种膜相互作用的分子机制。此外，该方法还可能用于筛选能够调节蛋白与膜结合能力的潜在治疗分子。

引言

在二维流体膜表面会发生大量相互作用和生化过程。真核细胞中由膜包被的细胞器不仅在生化过程及其相关的蛋白质组方面具有独特性，其脂质组成也各具特征。其中一类特殊的磷脂是磷脂酰肌醇磷酸盐（phosphoinositides, PIPs）。尽管它们仅占细胞脂质组的1%，但在信号转导、自噬以及膜运输等过程中发挥着关键作用1,2,3,4。细胞内的PIP激酶通过对肌醇头部基团进行动态磷酸化，产生七种单磷酸化、双磷酸化或三磷酸化的PIP头部基团5。此外，PIPs可定义膜结构的亚细胞身份，并为含有一个或多个磷脂酰肌醇结合结构域的蛋白质/酶提供特异性的膜锚定位点，例如Pleckstrin同源结构域（Pleckstrin Homology, PH）、Phox同源结构域（Phox Homology, PX）以及epsin N端同源结构域（epsin N-terminal Homology, ENTH）6,7。其中研究最为深入的PIP结合结构域之一是磷脂酶C（phospholipase C, PLC）-δ1的PH结构域，该结构域可特异性地与磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate, PI(4,5)P2）结合，其亲和力范围处于高纳摩尔至低微摩尔水平8,9,10,11。

已开发并使用了多种定性和定量的体外方法来研究这些相互作用的机制、热力学特性和特异性。其中最常用的PIP结合检测方法包括表面等离子共振（SPR）、等温滴定量热法（ITC）、核磁共振（NMR）波谱法、脂质体漂浮/沉降实验以及脂质印迹法（脂质斑点/PIP条带）12,13。尽管这些方法被广泛使用，但它们均存在诸多缺点。例如，SPR、ITC和NMR需要大量样品、昂贵的仪器和/或经过专业培训的技术人员12,13。某些检测方法（如基于抗体的脂质印迹法）使用水溶性形式的PIP，并以非生理状态呈现，从而可能影响结果的可靠性12,14,15,16。此外，脂质印迹法难以进行可靠的定量分析，且常导致假阳性或假阴性结果12,17,18。为克服这些挑战并改进现有工具，研究人员建立了一种基于微流控平台中支撑脂双层（SLB）的新型无标记检测方法，并已成功应用于蛋白质-PIP相互作用的研究（图1）19。

检测蛋白质与磷脂酰肌醇磷酸（PIP）相互作用的策略基于pH调控传感机制。该方法采用一种pH敏感性染料，即邻位-磺基罗丹明B（oSRB），其直接与磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine）的头部基团共价连接20。oSRB-POPE探针（图2A）在低pH条件下具有强荧光，而在高pH条件下荧光被淬灭，其在含有7.5 mol% PI(4,5)P2的固相脂双层膜（SLB）中的pKa约为6.7（图5B）。由于PLC-δ1的PH结构域对PI(4,5)P2具有高度特异性，因此已被广泛用于验证蛋白质-PIP结合方法的有效性（图5A）21,22,23,24,25。因此，我们推断PLC-δ1的PH结构域可用于通过“芯片上PIP”（PIP-on-a-chip）检测方法验证其与PI(4,5)P2的结合能力。本研究中使用的PH结构域构建体带有净正电荷（pI为8.4），因而可吸引OH-离子（图5C）。当该PH结构域结合至含PI(4,5)P2的SLB时，会将OH-离子带至膜表面，从而调节界面电势，并改变oSRB-POPE的质子化状态（图5C）26。随着PH结构域浓度的增加，荧光信号逐渐淬灭（图6A）。最终，将归一化数据拟合为结合等温线，以确定PH结构域与PI(4,5)P2相互作用的亲和力（图6B、6C）。

本研究提供了一种详细的实验方案，用于在微流控平台上实现蛋白质与含磷脂酰肌醇磷酸（PIP）的支撑脂双层（SLB）的结合。该方案涵盖了微流控装置的组装、囊泡制备、SLB的形成以及蛋白质结合的全过程。此外，还提供了数据分析方法，用于提取PLC-δ1 PH结构域与PI(4,5)P2相互作用的亲和力信息。

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方案

1. 清洁玻璃盖玻片

  1. 在100 mm深的平底硼硅酸盐玻璃皿中，将7倍浓缩清洗液（见材料表）用去离子水稀释7倍，并在水平加热板上加热至95 °C，持续20分钟，或直至浑浊溶液变为澄清。
    注意：溶液温度较高，操作时需谨慎以避免身体伤害。7倍浓缩清洗液为六钠[氧代-[氧代(磷酸根氧代)磷酸根]氧代磷酸根]磷酸盐、2-(2-丁氧基乙氧基)乙醇、钠 1,4-双(2-乙基己氧基)-1,4-二氧代丁烷-2-磺酸盐及其他无害添加物的专有混合物。
  2. 使用镊子将盖玻片（40 mm长 × 22 mm宽 × 0.16–0.19 mm厚）以交替方向排列在铝制染色架上。每片盖玻片之间保留一个空位，防止彼此接触。
  3. 将带有盖玻片的染色架完全浸入清洗液中，保持1小时。
    注意：随着水分蒸发，需持续添加新鲜去离子水，以维持溶液浓度不变。
  4. 将染色架从清洗液中取出，用大量去离子水冲洗盖玻片，以去除残留洗涤剂。
  5. 用氮气吹干盖玻片（每架约5分钟），然后将盖玻片放入窑炉中，在550 °C下退火6小时。
    注意：此为关键步骤，可使玻璃表面的粗糙结构变得平滑。
  6. 将盖玻片放入塑料容器中，并置于无尘环境中保存。

2. 制备微图案化PDMS块

  1. 按10:1（w/w）的质量比将聚二甲基硅氧烷（PDMS）预聚物与固化剂在大型塑料称量皿中混合，并在真空度为500 Torr或更低的条件下抽真空脱气1小时。
    注：PDMS是一种透明且惰性的硅基聚合物。为获得所需厚度（0.5 cm）的PDMS块，可将55 g预聚物与5.5 g固化剂混合。
  2. 将含有多个相同SU-8微图案复制品的硅模板置于一个较大的塑料称量皿中（底面直径10 cm），倒入已脱气的PDMS，随后在60 °C干燥烘箱中过夜固化。
    注：微图案尺寸足够大，可直接用肉眼观察。每个图案包含8个微通道（100 µm宽 × 40 µm高 × 1 cm长），通道之间间距为40 µm（图1A，1B）。硅片模具由高温烘焙的SU-8光刻胶制成，其制备在纳米加工设施中完成27。其他模板制备方法包括氢氟酸（HF）蚀刻、高温水蚀刻、刀绘法（xurography）和3D打印28,29,30,31。也可使用商业途径获取硅模板。微流控装置的图案设计采用绘图软件完成（见材料表）。包含图案设计的原始文件作为补充材料提供，文件名为“Pattern Design.dwg”，可直接提交给制造商。
  3. 用手小心地将PDMS从硅模板上剥离。使用外科手术刀片和直尺，在每个微图案外围标出矩形边界，然后将PDMS切割成独立的块状。
  4. 使用组织穿孔器（穿孔直径1.0 mm）在每个微通道两端 punching 16个孔（每块PDMS上有8个入口和8个出口），具体位置如图3B所示。
  5. 用胶带覆盖每块PDMS，以保护微图案免受损伤和灰尘污染，并将其存放于塑料容器中。

3. 制备小单层囊泡 (SUVs)

注意：阴性对照双分子层的组成为99.5 mol% 1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（POPC）和0.5 mol% 邻位-磺基罗丹明B-1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（oSRB-POPE）。测试双分子层的组成为92.0 mol% POPC、0.5 mol% oSRB-POPE，以及7.5 mol%的L-α-磷脂酰肌醇-4-磷酸（PI4P）或L-α-磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PI(4,5)P2）。以下为制备含92.0 mol% POPC、0.5 mol% oSRB-POPE和7.5 mol% PI(4,5)P2的小单层囊泡（SUVs）的操作步骤。本研究中所用的oSRB-POPE的合成方法此前已有描述20。

  1. 计算需要混合的 POPC、PI(4,5)P2 和 oSRB-POPE 的体积，使其分别达到以下总量：POPC 2.22 mg、PI(4,5)P2 0.26 mg 以及 oSRB-POPE 2.1 × 10-5 mg。
  2. 用移液器将计算体积的 POPC、PI(4,5)P2 和 oSRB-POPE 加入一个 20 mL 玻璃闪烁瓶中。
    注意：POPC 和 oSRB-POPE 的储备液为氯仿溶液，而 PI(4,5)P2（及其他磷脂酰肌醇类）储备液为氯仿:甲醇:水（20:9:1）的溶剂混合物。为保证准确性，使用前应先用氯仿润洗移液器吸头。出于安全考虑，该步骤应在化学通风橱内进行。
  3. 在化学通风橱内，向瓶中通入氮气流干燥混合物 10 分钟，或直至溶剂完全蒸发并在瓶底形成一层薄脂膜。
  4. 将混合物置于真空条件下干燥 ≥3 小时，真空度为 10 mTorr，以去除任何残留的有机溶剂。
    注意：本方案中 SUV 制备的规模所需干燥时间为 3 小时已足够，可满足 50 次实验的需求。若需更大规模制备 SUV，可进行过夜干燥。
  5. 用 5 mL 运行缓冲液（20 mM HEPES，100 mM NaCl，pH 7.0）重新水化干燥的脂质膜，并将样品置于工作频率为 35 kHz 的超声水浴中处理 30 分钟，室温下进行。
    注意：按照步骤 3.1 中指定的脂质用量混合，并在步骤 3.5 中加入 5 mL 运行缓冲液，最终可获得浓度为 0.5 mg/mL 的囊泡悬浮液。此时囊泡悬浮液中包含单层和多层囊泡（图 2B）。溶液呈粉红色/紫色，外观较浑浊。
  6. 使用液氮和 40 °C 水浴对囊泡悬浮液进行冻融处理，以获得单层囊泡。重复冻融过程 10 次。
    注意：（可选）为确保悬浮液中无非单层囊泡，可进行离心步骤32,33。
  7. 使用脂质挤出器（见材料表）将囊泡悬浮液通过孔径为 0.10 µm 的核径迹蚀刻聚碳酸酯膜进行挤出，以富集 SUV。重复挤出 10 次。
    注意：可使用 15 mL 圆锥形离心管收集挤出后的囊泡。此时溶液应无浑浊。SUV 的直径可通过动态光散射（DLS）确认（图 2C）。SUV 最适合用于形成支持性脂双层（SLB）34。
  8. 用铝箔包裹锥形管，4 °C 保存，待用时取出。

4. 组装微流控装置

  1. 用去离子水冲洗瓶通过孔道喷射去离子水，检测PDMS模块的入口和出口是否堵塞。然后用氮气吹干PDMS模块。
    注意：此步骤还将去除可能滞留在通道内和/或通道间的任何灰尘颗粒。如有必要，可使用氮气对预清洁的盖玻片进行去尘，以去除残留的灰尘颗粒。
  2. 将PDMS块和预清洁的盖玻片（见第1节）放入氧气等离子体系统（见材料表）的样品腔中，以75瓦的功率和10 cm³/min的氧气流速进行氧气等离子体处理45秒3/分钟，真空强度为200 mTorr。
  3. 将经过氧气等离子体处理后的PDMS块的图案面立即与盖玻片接触。轻轻按压以去除接触部位的任何气泡。
  4. 将装置置于水平的加热板上 100 °C 3 分钟以增强结合。
  5. 使用湿润的无绒布擦拭例如 用100%乙醇润湿的无尘纸（kimwipe）擦拭装置的顶部（PDMS）和底部（玻璃），以去除任何灰尘颗粒。然后，将装置用胶带固定在载玻片表面。
    注意：不要使用过量乙醇，并避免乙醇进入进样和出样通道。建议在设备仍处于高温状态时进行此步骤，以确保乙醇立即蒸发。玻璃显微镜载玻片可保存在100%乙醇溶液中，以去除灰尘和其他污染物。

5. 形成支撑脂质双层（SLB）

  1. 转移 100 µL PI(4,5)P的2将步骤 3.8 中的 SUVs 加入 0.65 mL 微离心管中。通过添加试剂将溶液 pH 调至约 3.2 6.4 µL 0.2 N 盐酸
    注意：使用配备微小pH探头的pH计（参见材料表）确认溶液的pH值。
  2. 移液器 10 µL 将pH调整后的SUV溶液通过入口加入每个通道，并通过移液枪施加压力，直至溶液到达出口。将移液枪吸头取下，使其仍连接在装置上。
  3. 对每个通道重复上述步骤，然后在室温下孵育装置 10 分钟。
    注意：在装置组装完成后，应立即向微通道内注射囊泡。
  4. 分别截取60 cm长的进液管和8 cm长的出液管。
    注意：将管路斜向切割以形成锋利边缘，有助于将管路更轻松地插入进液口和出液口。出液管路应呈弧形。进液管路的长度可根据显微镜的配置有所不同。管路的内径为0.05 cm。
  5. 使用镊子将出液管路连接至设备，然后用胶带将设备固定在显微镜载物台上。
  6. 将进样管路的一端浸入锥形管中盛有的25 mL流动缓冲液内，并用胶带固定管路以确保其稳固。
  7. 将锥形管置于高于设备约 20 cm 的位置，以利用重力使溶液流经微通道；可使用实验室升降架实现此高度。
  8. 对于每个进样管，使用注射器从管路的游离端吸取1 mL运行缓冲液。将移液器吸头从进样口移除，并将进样管的游离端插入装置中。
    注意：在入口处加入一滴运行缓冲液，以降低此步骤中气泡进入通道的概率。入口管路连接至装置后，使用无尘擦拭纸除去多余的缓冲液。
  9. 重复上述步骤，将所有进液管路连接至设备。
    注意：将运行缓冲液流经通道有助于去除多余的囊泡，并使双层膜达到实验条件下的平衡。
  10. 打开显微镜控制软件（参见材料表）。在左侧面板中，点击 "显微镜" 标签并选择 "10X" 目标。
  11. 点击 "活体" 然后 "Alexa 568" 工具栏上的图像图标。使用微调和粗调旋钮，对微通道进行聚焦。
  12. 扫描装置以检查SLB和通道的质量（图8。然后，单击 "FL快门关闭" 工具栏上的图像图标。
  13. 点击 "采集" 标签，以及在下方 "基本调整" 选择 "曝光时间。" 设置曝光时间为 "200 ms".
  14. 在左侧面板中，单击 "多维采集" 在“滤镜”菜单下选择红色通道（标记为 "Alexa 568"）。然后，点击 "时间推移" 菜单中，将时间间隔设为 5 min，持续时间设为 30 min，然后点击 "开始".
    注意：根据持续时间（30 分钟）和流速（~1.0 µL/min), 30 µL 使用运行缓冲液在通道内平衡SLB。 即 240 µL 所有8个通道均使用运行缓冲液。
  15. 选择 "圆形" 工具下方的 "测量" 标签，并在任意通道中绘制一个圆形。选中该圆形后右键点击，然后选择 "性质". 在……之下 "简介" 标签，检查 "所有 T" 以观察荧光强度随时间的变化。
    1. 确保该曲线达到平台期，表明已达到平衡状态，然后再进行下一步操作。
  16. 将缓冲液溶液降至与装置相同的水平位置，以停止液体流动。
  17. 保存延时文件。

6. 测试PLC-δ1 PH结构域与含PI(4,5)P2的固体支持双层膜（SLBs）的相互作用

  1. 使用流动缓冲液作为稀释剂，配制PH结构域的不同浓度稀释液。
    注意：由于芯片内有八个通道，至少使用其中两个作为空白对照。选择两侧最外端的通道，其余通道用于蛋白质稀释液。测试的PH结构域浓度分别为：0.10、0.25、0.50、1.00 和 2.50 µM。每种稀释液约需 200 µL，可在 30 分钟内达到平衡。
  2. 依次取下每个出口管路，用移液器将 200 µL 各种蛋白质稀释液加入出口通道中。不要施加任何压力，让重力完成加样过程。移液器吸头取下后应保持连接在微流控装置上。
  3. 对每个通道重复上述步骤，并确保在此过程中未引入气泡。
  4. 将入口管路降低至微流控装置下方的地面位置，以启动蛋白质在微通道中的流动。将管路的自由端用胶带固定至废液容器。使蛋白质稀释液持续流动 30 分钟。
    注意：此操作将逆转流动方向，使蛋白质进入通道。达到平衡所需的时间以及所需的蛋白质稀释液体积取决于相互作用的亲和力。
  5. 在软件左侧面板的“时间序列”选项卡下，点击“开始”以重新启动成像。
  6. 重复步骤 5.15，以确认已达到平衡。实验完成后，保存时间序列文件。

7. 评估膜流动性

注意：每次使用新一批 SUV 及清洁的玻璃盖玻片时，都应进行荧光漂白后恢复（FRAP）实验，以确保支持性脂双层（SLB）具有流动性。

  1. 按照前述方法执行玻璃盖玻片清洗（1.1-1.6）、微图案化PDMS块制备（2.1-2.5）、小单层脂质体（SUV）制备（3.1-3.8）、微流控装置组装（4.1-4.5）以及支撑脂双层（SLB）形成（5.1-5.17）的操作步骤。
  2. 将显微镜聚焦于脂双层，设置曝光时间为200 ms，像素合并（binning）为1。
  3. 使用532 nm、2 mW的激光束对一个圆形区域进行光漂白（半径13 µm）。光漂白后立即开始采集图像序列，前45秒每3秒采集一次，之后每隔30秒采集一次，总时长为15分钟。数据采集完成后，保存时间序列图像文件。
  4. 使用圆形绘图工具选择漂白区域，以提取随时间变化的荧光强度值。此外，再选择附近两个区域，一个为未漂白区域，另一个为无SLB的区域。
  5. 根据以下公式计算荧光恢复率（y）：
    figure-protocol-1
    注：此处Ft表示漂白区域随时间变化的荧光强度，Fi表示漂白前的荧光强度（本例中使用“1”作为归一化值）；F0为背景强度。
  6. 以时间（x轴）为自变量，荧光恢复率（y轴）为因变量作图，生成FRAP曲线。随后将数据拟合为单指数函数，如下所示：
    figure-protocol-2
    注：此处A表示可移动组分比例，k为可移动组分的动力学常数，用于计算半恢复时间（t1/2）：
    figure-protocol-3
  7. 利用t1/2计算扩散系数（D）：
    figure-protocol-4
    注：此处R表示激光束半径（13 µm）。流体脂双层的扩散系数应≥1.0 µm2/s。

8. 数据处理

注意：数据分析的流程将取决于所使用的显微镜、图像处理软件以及曲线拟合软件。

  1. 打开滴定 PH 结构域之前（步骤 5.17）和之后（步骤 6.6）的时间序列文件。转到每个时间序列文件的最后一帧，并沿所有微通道进行线扫描，以获取荧光强度随像素距离变化的数据（图6A)。将数据转移至电子表格软件。
  2. 对于每个微通道（在添加PH结构域之前和之后），在通道内及其两侧代表基线的区域采集部分数据图7A).
    注意：空白通道的荧光强度应保持不变。所有其他通道均以空白通道为基准进行归一化处理，因此必须设置两个空白通道，并确保它们的荧光强度相互一致。
  3. 使用以下公式将数据归一化至空白通道；文中提供了一个示例计算过程 图7B.
    figure-protocol-5
    注意：此处 ΔF蛋白 表示蛋白通道经背景扣除后的荧光强度， ΔF空 表示空白通道经背景扣除后的荧光强度， pre 和 术后 参考蛋白质滴定步骤前后的变化，以及 α 表示校正因子，即蛋白通道与空白通道荧光强度的比值（[F蛋白/空白]pre在预蛋白滴定步骤中。由于荧光强度随PH结构域浓度的增加而降低，归一化后的数据值将为负数。
  4. 使用曲线拟合软件（参见 材料表），以PH结构域浓度为自变量，绘制归一化荧光强度曲线，并拟合为朗缪尔等温吸附方程（图6C):
    figure-protocol-6
    注意：此处 ∆F 表示荧光强度的变化相对于蛋白质在饱和浓度下荧光强度最大变化的比值（∆F最大），而 Kd,app 表示表观解离常数，其值等于主体蛋白浓度（[PLC-δ1 PH]达到50%覆盖率（膜结合复合物）时的浓度。这是一种基于平衡的结合测量方法，因此 归一化数据拟合到简单的朗缪尔等温线模型，以提取表观参数 实验参数 Kd,app. 根据拟合软件的 Kd,app 用于 PLC-δ1 PH-PI(4,5)P2 相互作用为0.39 ± 0.05 µM (图6B).

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结果

我们采用pH调节实验来研究PLC-δ1 PH 结构域-PI(4,5)P2 微流控芯片上的相互作用图1）。通过详细的实验方案，我们展示了如何制备和组装微流控装置组件，以及如何制备小单层脂质体（SUVs）图2），在装置内形成SLB图3，并测试了蛋白质与含PIP的固体支持双层膜（SLB）的结合。典型的SLB结合实验流程图如图所示。 图4pH 调控检测原理如图所示 图 5 使用PH结构域-PI(4,5)P2 以结合为例。本研究结果表明，PH结构域可结合PI(4,5)P2含SLBs。更具体地说，我们观察到结合后局部pH变得更偏碱性。这种局部pH变化被 oSLB 中存在的 SRB-POPE 荧光探...

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讨论

每种PIP变体尽管浓度较低，但均存在于特定细胞器的胞质表面，有助于形成细胞器膜独特的物理组成和功能特异性1PIP 的最重要用途之一是作为多种蛋白质的特异性停泊平台，这些蛋白质需要特定的亚细胞定位和/或激活6,7由于蛋白质与磷脂酰肌醇磷酸（PIP）相互作用在细胞生理学和疾病中的重要作用，研究这些相互作用的能力 体外在生理相关背景下研究蛋白质与磷脂酰肌醇磷酸（PIP）的相互作用具有重要意义。本文所述的检测方法能够在含有多种磷脂混合物的流动脂双层环境中，以天然取向的极性头部基团和自然长度的脂肪酰基链来研究蛋白质与PIP的相互作用。

该检测方法结合pH调节作为其检测系统，并以微流控平台中的支撑脂双层（SLB）作为模型膜系统，相较于其他膜结合技术具有独特优势。首先，微流控平台因所需蛋白和脂质的用量极低（总通道体积为40 nL，SLB表面积为1.0 mm2），显著节省了实验材料。此外，可使用...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

D.S. 和 C.E.C. 部分由资助项目 AI053531（NIAID，NIH）支持；S.S. 和 P.S.C. 由资助项目 N00014-14-1-0792（ONR）支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
盖玻片
玻璃盖玻片：矩形费舍尔科学公司12-544B22 x 40 x 0.16 - 0.19 mm，1.5号；硼硅酸盐玻璃
7X 清洗液MP 生物医学976670洗涤剂
PYREX 结晶皿康宁公司3140-190平底硼硅酸盐玻璃皿；直径 × 高度（190 × 100 mm）；分销商：VWR（89090-700）
Sentry Xpress 2.0Paragon IndustriesSC-2烧结炉
名称公司目录编号备注
PDMS
Sylgard 184 硅橡胶弹性体套件陶氏化学公司4019862聚二甲基硅氧烷（PDMS）；分销商：艾尔斯沃斯胶粘剂公司
PYREX 干燥器VWR89134-402耐真空
活检打孔器Harris15110-10Harris Uni-Core；1.0 mm 直径；Miltex 活检打孔器带推杆（目录号 15110-10）可作为替代品
名称公司目录编号备注
设备
等离子清洗系统PlasmaEtchPE25-JW两级直驱油真空泵，O₂ 服务（Krytox 充注）
数字加热板BenchmarkH3760-H通过 Denville Scientific 购买（目录号 1005640）
磨砂显微载玻片VWR48312-003磨砂、精选并预清洁；瑞士玻璃制成；厚度：1 mm；尺寸：75 x 25 mm；GR 144
名称公司目录编号备注
模具
AutoCADAutodeskv.2016用于光刻掩模设计的制图软件
光刻掩模CAD/Art ServicesN/A设计为黑色背景、透明特征，由 CAD/Art Services 在透明掩模（5 x 7 英寸）上以 20k dpi 分辨率打印
硅晶圆University Wafer1575优级，单面抛光；100 mm（4 英寸）直径；525 μm 厚度
SU-8 50MicroChem 公司N/A负性光刻胶；宾夕法尼亚州立大学纳米制造设施财产
SU-8 显影液MicroChem 公司N/A宾夕法尼亚州立大学纳米制造设施财产
名称公司目录编号备注
SUV
1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱Avanti 极性脂质公司850457CPOPC
L-α-磷脂酰肌醇-4-磷酸Avanti 极性脂质公司840045XPI4P
L-α-磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸Avanti 极性脂质公司840046XPI(4,5)P2
1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺Avanti 极性脂质公司850757CPOPE；合成 oSRB-POPE 所需
丽丝胺罗丹明B磺酰氯（混合异构体）赛默飞世尔科技公司L-20合成 oSRB-POPE 所需
pH 敏感性荧光脂质探针（oSRB-POPE）本实验室N/A本实验室合成（Huang D. 等，2013）
玻璃闪烁瓶VWR66022-06520 mL 容量
Aquasonic 250DVWRN/A超声水浴
Nuclepore 轨迹蚀刻膜Whatman110605聚碳酸酯膜；直径：25 mm；孔径：0.1 μm；分销商：Sigma-Aldrich
氯仿VWRCX1054-6色谱纯级
LIPEX 挤出器Transferra NanosciencesT.001LIPEX 10 mL 热压挤出器
Viscotek 802 DLSMalvern 仪器公司N/A动态光散射；宾夕法尼亚州立大学X射线晶体学设施财产
名称公司目录编号备注
数据分析
GraphPad PrismGraphPad 软件公司v.6用于数据分析的曲线拟合软件
名称公司目录编号备注
显微镜
Axiovert 200M 正置荧光显微镜卡尔·蔡司显微系统公司N/A显微镜
AxioCam MRm 相机卡尔·蔡司显微系统公司N/A相机
X-Cite 120Excelitas TechnologiesN/A光源
Alexa 568 滤光片组卡尔·蔡司显微系统公司N/A激发/发射 576/603 nm
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 软件卡尔·蔡司显微系统公司N/A图像处理软件
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其他
吸头VWR10034-132200 μL 移液器吸头；细长平滑尖端，用于将蛋白溶液加入微流控通道
吸头VWR53509-07010 μL 移液器吸头；细长平滑尖端，用于将囊泡溶液加入微流控通道
Orion Star A321 pH 计赛默飞世尔科技公司STARA3210pH 计
Orion 微型 pH 探针赛默飞世尔科技公司8220BNWP微型 pH 探针
N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸)VWRVWRB30487HEPES，游离酸
氯化钠VWRBDH8014-2.5KGRNaCl
管路Allied Wire & CableTFT-200-24 N内径：0.020–0.026 英寸（0.051–0.066 cm）；壁厚：0.010 英寸（0.025 cm）；柔性聚四氟乙烯薄壁管；天然色
工业级氮气普莱克斯公司N/A本地供应商
工业级氧气普莱克斯公司N/A本地供应商
液氮普莱克斯公司N/A本地供应商

参考文献

  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
  2. Shewan, A., Eastburn, D. J., Mostov, K. Phosphoinositides in cell architecture. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (8), a004796(2011).
  3. Picas, L., Gaits-Iacovoni, F., Goud, B. The emerging role of phosphoinositide clustering in intracellular trafficking and signal transduction. F1000Res. 5, (2016).
  4. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Lett. 590 (15), 2454-2468 (2016).
  5. Balla, T. Phosphoinositides: Tiny lipids with giant impact on cell regulation. Physiol Rev. 93, 1019-1137 (2013).
  6. Lemmon, M. A. Membrane recognition by phospholipid-binding domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (2), 99-111 (2008).
  7. Kutateladze, T. G. Translation of the phosphoinositide code by PI effectors. Nat Chem Biol. 6 (7), 507-513 (2010).
  8. Harlan, J. E., Hajduk, P. J., Yoon, H. S., Fesik, S. W. Pleckstrin homology domains bind to phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate. Nature. 371 (6493), 168-170 (1994).
  9. Garcia, P., et al. The pleckstrin homology domain of phospholipase C-delta 1 binds with high affinity to phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in bilayer membranes. Biochemistry. 34 (49), 16228-16234 (1995).
  10. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (23), 10472-10476 (1995).
  11. Flesch, F. M., Yu, J. W., Lemmon, M. A., Burger, K. N. Membrane activity of the phospholipase C-delta1 pleckstrin homology (PH) domain. Biochem J. 389, 435-441 (2005).
  12. Narayan, K., Lemmon, M. A. Determining selectivity of phosphoinositide-binding domains. Methods. 39 (2), 122-133 (2006).
  13. Scott, J. L., Musselman, C. A., Adu-Gyamfi, E., Kutateladze, T. G., Stahelin, R. V. Emerging methodologies to investigate lipid-protein interactions. Integr Biol (Camb). 4 (3), 247-258 (2012).
  14. Dowler, S., Currie, R. A., Downes, C. P., Alessi, D. R. DAPP1: A dual adaptor for phosphotyrosine and 3-phosphoinositides. Biochem J. 342, 7-12 (1999).
  15. He, J., et al. Molecular basis of phosphatidylinositol 4-phosphate and ARF1 GTPase recognition by the FAPP1 pleckstrin homology (PH) domain. J Biol Chem. 286 (21), 18650-18657 (2011).
  16. Ceccarelli, D. F., et al. Non-canonical interaction of phosphoinositides with pleckstrin homology domains of Tiam1 and ArhGAP9. J Biol Chem. 282 (18), 13864-13874 (2007).
  17. Huang, S., Gao, L., Blanchoin, L., Staiger, C. J. Heterodimeric capping protein from Arabidopsis is regulated by phosphatidic acid. Mol Biol Cell. 17 (4), 1946-1958 (2006).
  18. Yu, J. W., et al. Genome-eide analysis of membrane targeting by S. cerevisiae pleckstrin homology domains. Mol Cell. 13 (5), 677-688 (2004).
  19. Jung, H., Robison, A. D., Cremer, P. S. Detecting protein-ligand binding on supported bilayers by local pH modulation. J Am Chem Soc. 131 (3), 1006-1014 (2009).
  20. Huang, D., Zhao, T., Xu, W., Yang, T., Cremer, P. S. Sensing small molecule interactions with lipid membranes by local pH modulation. Anal Chem. 85 (21), 10240-10248 (2013).
  21. Saxena, A., et al. Phosphoinositide binding by the pleckstrin homology domains of Ipl and Tih1. J Biol Chem. 277 (51), 49935-49944 (2002).
  22. Knödler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. Biotechniques. 38 (6), 858-862 (2005).
  23. Baumann, M. K., Swann, M. J., Textor, M., Reimhult, E. Pleckstrin homology-phospholipase C-delta1 interaction with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate containing supported lipid bilayers monitored in situ with dual polarization interferometry. Anal Chem. 83 (16), 6267-6274 (2011).
  24. Saliba, A. E., et al. A quantitative liposome microarray to systematically characterize protein-lipid interactions. Nat Methods. 11 (1), 47-50 (2014).
  25. Arauz, E., Aggarwal, V., Jain, A., Ha, T., Chen, J. Single-molecule analysis of lipid-protein interactions in crude cell lysates. Anal Chem. 88 (8), 4269-4276 (2016).
  26. Best, Q. A., Xu, R., McCarroll, M. E., Wang, L., Dyer, D. J. Design and investigation of a series of rhodamine-based fluorescent probes for optical measurements of pH. Org Lett. 12 (14), 3219-3221 (2010).
  27. Lee, J., Choi, K. H., Yoo, K. Innovative SU-8 lithography techniques and their applications. Micromachines. 6 (1), 1-18 (2014).
  28. Poyton, M. F., Sendecki, A. M., Cong, X., Cremer, P. S. Cu(2+) binds to phosphatidylethanolamine and increases oxidation in lipid membranes. J Am Chem Soc. 138 (5), 1584-1590 (2016).
  29. Karasek, P., Grym, J., Roth, M., Planeta, J., Foret, F. Etching of glass microchips with supercritical water. Lab Chip. 15 (1), 311-318 (2015).
  30. Thomas, M. S., et al. Print-and-peel fabrication for microfluidics: what's in it for biomedical applications? Ann Biomed Eng. 38 (1), 21-32 (2010).
  31. Waheed, S., et al. 3D printed microfluidic devices: enablers and barriers. Lab Chip. 16 (11), 1993-2013 (2016).
  32. Axmann, M., Schutz, G. J., Huppa, J. B. Single molecule fluorescence microscopy on planar supported bilayers. J Vis Exp. (105), e53158(2015).
  33. Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16 (12), 2806-2810 (1977).
  34. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surface Science Reports. 61 (10), 429-444 (2006).
  35. Hamai, C., Yang, T., Kataoka, S., Cremer, P. S., Musser, S. M. Effect of average phospholipid curvature on supported bilayer formation on glass by vesicle fusion. Biophys J. 90 (4), 1241-1248 (2006).
  36. Tero, R. Substrate effects on the formation process, structure and physicochemical properties of supported lipid bilayers. Materials. 5 (12), 2658-2680 (2012).
  37. Ferguson, K. M., Lemmon, M. A., Schlessinger, J., Sigler, P. B. Structure of the high affinity complex of inositol trisphosphate with a phospholipase C pleckstrin homology domain. Cell. 83 (6), 1037-1046 (1995).
  38. Simonsson, L., Hook, F. Formation and diffusivity characterization of supported lipid bilayers with complex lipid compositions. Langmuir. 28 (28), 10528-10533 (2012).
  39. Cong, X., Poyton, M. F., Baxter, A. J., Pullanchery, S., Cremer, P. S. Unquenchable surface potential dramatically enhances Cu(2+) binding to phosphatidylserine lipids. J Am Chem Soc. 137 (24), 7785-7792 (2015).
  40. Robison, A. D., et al. Polyarginine interacts more strongly and cooperatively than polylysine with phospholipid bilayers. J Phys Chem B. 120 (35), 9287-9296 (2016).
  41. Robison, A. D., Huang, D., Jung, H., Cremer, P. S. Fluorescence modulation sensing of positively and negatively charged proteins on lipid bilayers. Biointerphases. 8 (1), 1(2013).
  42. Tabaei, S. R., et al. Formation of cholesterol-rich supported membranes using solvent-assisted lipid self-assembly. Langmuir. 30 (44), 13345-13352 (2014).
  43. Johnson, S. J., et al. Structure of an adsorbed dimyristoylphosphatidylcholine bilayer measured with specular reflection of neutrons. Biophys J. 59 (2), 289-294 (1991).
  44. Koenig, B. W., et al. Neutron reflectivity and atomic force microscopy studies of a lipid bilayer in water adsorbed to the surface of a silicon single crystal. Langmuir. 12 (5), 1343-1350 (1996).
  45. Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).
  46. Renner, L., et al. Supported lipid bilayers on spacious and pH-responsive polymer cushions with varied hydrophilicity. J Phys Chem B. 112 (20), 6373-6378 (2008).
  47. Wagner, M. L., Tamm, L. K. Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: Silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker. Biophys J. 79 (3), 1400-1414 (2000).
  48. Pace, H., et al. Preserved transmembrane protein mobility in polymer-supported lipid bilayers derived from cell membranes. Anal Chem. 87 (18), 9194-9203 (2015).
  49. Braunger, J. A., Kramer, C., Morick, D., Steinem, C. Solid supported membranes doped with PIP2: Influence of ionic strength and pH on bilayer formation and membrane organization. Langmuir. 29 (46), 14204-14213 (2013).
  50. Paridon, P. A., de Kruijff, B., Ouwerkerk, R., Wirtz, K. W. Polyphosphoinositides undergo charge neutralization in the physiological pH range: A 31P-NMR study. Biochim Biophys Acta. 877 (1), 216-219 (1986).
  51. Liu, C., Huang, D., Yang, T., Cremer, P. S. Monitoring phosphatidic acid formation in intact phosphatidylcholine bilayers upon phospholipase D catalysis. Anal Chem. 86 (3), 1753-1759 (2014).
  52. Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11364-11369 (2006).
  53. Hsu, N. Y., et al. Viral reorganization of the secretory pathway generates distinct organelles for RNA replication. Cell. 141 (5), 799-811 (2010).
  54. Del Campo, C. M., et al. Structural basis for PI(4)P-specific membrane recruitment of the Legionella pneumophila effector DrrA/SidM. Structure. 22 (3), 397-408 (2014).
  55. Kolli, S., et al. Structure-function analysis of vaccinia virus H7 protein reveals a novel phosphoinositide binding fold essential for poxvirus replication. J Virol. 89 (4), 2209-2219 (2015).
  56. Cho, N. J., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate is an HCV NS5A ligand and mediates replication of the viral genome. Gastroenterology. 148 (3), 616-625 (2015).

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