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方法文章

利用三维荧光漂白后恢复显微镜分析间隙连接依赖性miRNA转移

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DOI：

10.3791/55870

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2017年6月19日

 ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), 2Department of Cardiac Surgery, University of Rostock, 3Department of Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty, University of Rostock

本文内容

摘要

本文描述了三维荧光漂白后恢复技术（3D-FRAP）在分析依赖间隙连接的miRNA转运中的应用。与常用方法相比，3D-FRAP能够以高时空分辨率实时定量小RNA的细胞间转移。

摘要

小分子反义RNA（如miRNA和siRNA）在细胞生理与病理过程中发挥重要作用，此外还可作为治疗多种疾病的治疗剂。miRNA/siRNA治疗新策略的开发依赖于对相关机制的深入理解。近期研究表明，小分子RNA以间隙连接依赖的方式在细胞间进行交换，从而在受体细胞中诱导基因调控效应。分子生物学技术与流式细胞术分析常用于研究miRNA的细胞间转移。然而，这些方法无法提供研究分子通过间隙连接传递所必需的高时间分辨率。因此，为探究miRNA/siRNA作为细胞间信号分子的作用，亟需开发可在单细胞水平分析这些小分子RNA的新工具。本实验方案描述了三维荧光漂白后恢复（3D-FRAP）显微技术在阐明心肌细胞间miRNA分子间隙连接依赖性交换中的应用。重要的是，这种简便且非侵入性的活细胞成像方法能够以高时空分辨率实时可视化并定量荧光标记的小分子RNA通过间隙连接的穿梭过程。3D-FRAP获得的数据证实了一种新的细胞间基因调控通路，即小分子RNA在细胞间网络中充当信号分子。

引言

小非编码RNA在细胞基因调控中发挥着重要作用。这些分子由20-25个核苷酸组成，能够与特定的靶mRNA结合，从而导致翻译受阻或mRNA降解1,2。小RNA（如miRNA和siRNA）所介导的基因调控过程是一种高度保守的机制，在多种不同物种中均有发现3。特别是miRNA分子在多种生理过程中具有关键作用，包括增殖、分化和再生4,5。此外，miRNA表达的失调与多种病理状态相关。因此，miRNA已被证明可作为疾病诊断的生物标志物，并有望用于基因治疗中的治疗剂6,7。

间隙连接（GJs）是相邻两个细胞质膜上的特化蛋白质结构，允许分子量高达1 kD的分子通过扩散进行交换。研究表明，间隙连接在组织发育、细胞分化、细胞死亡以及癌症或心血管疾病等病理紊乱中具有重要作用8,9,10。已有多种分子被证实能够通过间隙连接通道，包括离子、代谢物和核苷酸。有趣的是，间隙连接还被发现为小RNA在细胞间的转移提供了通路11,12。因此，miRNA不仅可在其产生的细胞内发挥作用，也可在受体细胞内产生效应。这凸显了miRNA在细胞间信号转导系统中的作用。同时，这些数据表明，间隙连接介导的细胞间通讯与miRNA功能密切相关。鉴于miRNA和间隙连接在组织稳态、疾病病理及诊断中的重要意义，全面理解间隙连接的功能及其相关的miRNA细胞间动态过程，将有助于阐明基于miRNA的疾病机制，并为开发miRNA治疗新策略提供依据。

根据缝隙连接耦合程度的不同，miRNA分子在细胞间的转移可能是一个非常迅速的过程。因此，需要一种能够可视化并定量分析这些调控性信号分子快速细胞间运动的方法。通常，流式细胞术和分子生物学技术已被用于证明小RNA的穿梭作用11,12,13,14。然而，与FRAP显微技术相比，这些方法缺乏必要的高时间分辨率，而高时间分辨率在分析miRNA通过缝隙连接（GJs）进行交换时至关重要。此外，FRAP显微技术侵入性更小，因此是一种强大且新颖的活细胞成像技术，可用于评估多种细胞类型中依赖缝隙连接的分子交换15,16,17。

本文介绍了一种详细的操作方案，用于应用三维荧光漂白后恢复技术（3D-FRAP）评估心肌细胞间miRNA的转运过程。为此，将心肌细胞转染带有荧光标记的miRNA。对一个被该miRNA标记的细胞进行光漂白，随后以时间依赖的方式记录相邻细胞通过缝隙连接（GJs）向该细胞重新流入miRNA的过程。FRAP实验具有较高的时间分辨率，可用于开展动力学研究，从而精确评估活细胞之间miRNA和siRNA的细胞间转移。此外，由于小RNA可通过多种机制进行交换，且不同机制的动力学特征差异显著，FRAP显微技术有助于阐明缝隙连接在特定转运过程中所起的作用程度18。同时，3D-FRAP还可用于研究生理和病理条件下缝隙连接通透性的改变及其对小RNA转移的影响15,19。

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方案

本方案中涉及新生小鼠的所有步骤均遵循罗斯托克大学医学中心动物护理的伦理指南。

1. 心肌细胞培养的细胞培养皿和培养基的制备

  1. 用 PBS 中含 0.1% 明胶的溶液包被细胞培养板，在 37 °C 下孵育 4 小时，或在 4 °C 下过夜孵育。去除明胶溶液，并在无菌层流空气中干燥。
  2. 准备细胞培养基，包含 50 mL DMEM，添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素（P/S）。预热至 37 °C。

2. 新生儿心肌细胞的分离

  1. 使用无菌剪刀断头处死新生小鼠（1-2日龄），沿胸骨打开胸腔。用镊子取出心脏，同时轻轻挤压胸腔，并将心脏转移至含有冰浴HBSS（不含Ca2+和Mg2+）的24孔板中。
  2. 使用无菌镊子去除非心肌组织和较大的血管。将清理后的心脏转移至含有冰浴HBSS的1.5 mL离心管中。每管最多放入5个心脏用于酶消化。
  3. 用小剪刀将心脏剪成<0.5至1 mm³的小块。
  4. 使用1 mL微量移液器通过吸除/添加HBSS的方式清洗剪碎的心脏组织两次。在加入酶之前，彻底去除HBSS。
  5. 对新生小鼠心脏进行酶消化时，使用市售试剂盒并按照制造商提供的说明操作（见材料表）。在37 °C条件下孵育35分钟，期间每5分钟轻轻振荡含有剪碎心脏的离心管。
  6. 将悬浮细胞接种于未包被的细胞培养皿中，加入细胞培养基培养1.5-2小时，以促进非心肌细胞组分的贴壁。若需要获得高纯度的心肌细胞，可重复此步骤。如有需要，可进一步培养非心肌细胞组分。
    注：对于15个心脏的细胞悬液，预贴壁步骤可在75 cm²细胞培养瓶中进行。通常，每个新生小鼠心脏可获得约5 × 105个细胞。
  7. 将上清液收集至15 mL锥形离心管中，以300 × g离心10分钟。用1 mL细胞培养基重悬细胞沉淀。
  8. 使用血细胞计数板（Neubauer腔计数器）或等效方法进行细胞计数。
  9. 将分离的心肌细胞以3 × 105个细胞/cm²的密度接种于6孔板中，在37 °C、5% CO2条件下培养过夜。
    注：可选择在此时对细胞进行转染。然而，观察发现，在电穿孔前将细胞培养一天可提高细胞存活率。

3. 转染荧光标记的miRNA

  1. 将细胞培养基（见步骤 1.2）在水浴锅或等效设备中预热至 37 °C。
  2. 在无 RNase 的无菌水中配制 20 µM 的荧光标记 miRNA 储存液。
  3. 配制电穿孔缓冲液，包含 90 mM Na2HPO4、90 mM NaH2PO4、5 mM KCl、10 mM MgCl2 和 10 mM 丁二酸钠，并将 pH 调至 7.2；电穿孔缓冲液可在 -20 °C 保存数月。
  4. 使用 0.05% 胰蛋白酶消化细胞 5 分钟，使其从培养皿上脱落。加入细胞培养基以终止胰蛋白酶的消化作用。
  5. 使用血细胞计数板（Neubauer 计数室）或等效方法对细胞进行计数。在 300 × g 条件下离心 10 分钟。
  6. 将细胞重悬于电穿孔缓冲液中，调整浓度至每 100 µL 含 4 × 105 个细胞。
  7. 取 100 µL 细胞悬液与荧光标记 miRNA（终浓度：0.25 µM）在离心管中混合，并将混合液转移至电穿孔杯中。
    1. 根据细胞类型，通过实验确定合适的 miRNA 用量。
  8. 使用电穿孔仪（参见材料表），选择"G-009"程序进行电穿孔操作。
  9. 加入 500 µL 预热的细胞培养基，将全部细胞悬液（4 × 105 个细胞）转移至 4 孔玻璃底培养板的一个孔中。在 37 °C、5% CO2 条件下培养 1 天。
    注意：进行荧光漂白恢复（FRAP）分析时，细胞密度约为 80% 最为理想。标记 miRNA 的转染应仅通过电穿孔方式进行。由于标记 miRNA 分子的均匀分布有利于 FRAP 检测，因此不推荐使用试剂介导的转染方法。

4. 应用三维荧光漂白后恢复显微技术（第3天）

  1. 将显微镜培养箱预热至 37 °C，并在进行 FRAP 测量前至少提前 2 小时开启共聚焦显微镜系统，以建立热平衡并减少漂移的可能性。如条件允许，维持 5% CO₂2 大气
  2. 将腔室载玻片插入载物台样品架中。
  3. 使用1.4数值孔径油镜（400倍放大），在低激光功率下以561 nm激光激发，检测范围为570–680 nm，寻找转染的心肌细胞簇。
    注意：FRAP 参数的设定、图像采集及分析均使用显微镜配套软件完成（参见 材料表).
  4. 激活 "z-轴扫描" "时间序列，" "漂白，" 和 "区域" 按钮在 "设置管理器"
  5. 定义FRAP参数。
    1. 定义图像采集设置 "采集模式" 通过设置菜单 "帧大小" 512 x 512 "线性步骤" 到 1，以及 "扫描时间" 到 <1 秒。
    2. 在 "通道" 菜单中，调节激光功率、偏移和增益设置，以在最低激光激发下获得最强荧光信号（例如， 激光功率：1-5%；调整至避免信号饱和。设置 "针孔尺寸" 至 2 µm。
    3. 接下来，在 "区域" 菜单，选择 "ROI 绘制工具" 使用光标标记目标细胞、参照细胞和背景区域。如有需要，选择多个目标细胞进行光漂白。
    4. 调整光漂白设置 "漂白" 菜单 (例如， 迭代次数：9-14，光漂白激光功率：100%，图像采集间隔：60 秒，循环次数：15。在初始扫描3次后定义漂白开始时间。
    5. 在 "z-轴层扫" 菜单中，根据细胞的厚度设定z轴层扫描的采集范围。调整 "z层的数量" 至 12 - 15。
    6. 开始FRAP实验并记录荧光恢复过程。
      注意：由于FRAP实验的设置取决于细胞类型、荧光染料和显微镜系统，因此最好先进行预实验以确定FRAP的最佳参数。漂白程度应足以使初始荧光强度至少降低50%。通常，应每30-60秒记录一次荧光恢复，直至达到平台期。

5. 数据分析

  1. 创建获取的 z-堆栈的最大投影，并获得漂白目标细胞、参考细胞和背景的荧光强度值。使用显微镜专用软件，点击 "Processing" → "Maximum intensity projection" → 选择文件 → "Apply"。
    1. 或者，使用等效的图像分析工具（e.g., ImageJ）。
  2. 将目标细胞、背景和参考细胞在所有时间点的荧光强度数据复制到电子表格中。
    1. 从目标细胞的强度值中减去背景强度和参考细胞的强度，以校正采集过程中引起的光漂白。对每个时间点执行背景和参考细胞校正。
    2. 通过将每个数值除以漂白前的初始荧光强度，将校正后的 FRAP 数据归一化。
    3. 为获得 FRAP 曲线，将漂白后立即测得的荧光强度设为基线，并从每个时间点的强度值中减去该基线。

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结果

本文介绍了3D-FRAP显微镜作为一种非侵入性技术，用于研究荧光标记的miRNA在新生大鼠心肌细胞间通过缝隙连接进行的转运。分离得到的心肌细胞显示出典型的α-肌动蛋白（α-actinin）条纹状分布模式，并在细胞间边界处存在大量Cx43蛋白斑块（图1A，白色箭头），表明细胞间具有较高的分子转运能力。通过显微镜下对α-actinin阳性细胞进行定量分析，评估了分离心肌细胞的纯度。尽管培养物中存在少量非心肌细胞（α-actinin阴性细胞），但分离后的心肌细胞仍为主要细胞类型（79.62 ± 3.68%；图1B）。

为了研究缝隙连接介导的miRNA交换，将细胞转染带有荧光标记的miRNA。电穿孔是将miRNA分子递送至细胞的首选方法，因其可确保较高的转染效率以及转染物质在细胞间的均匀分布，而这对于荧光漂白恢复（FRAP）分析至关重要。在本...

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讨论

miRNA 是细胞生理学中的关键调控因子，已被证实可通过包括间隙连接（GJs）在内的多种途径作为信号分子进行细胞间交换11,12,22当前方案展示了一种 体外 利用细胞簇中的荧光miRNA，通过活细胞成像技术表征这种间隙连接依赖性的穿梭过程。

该方案以心肌细胞作为细胞模型系统进行开发。然而，若电穿孔是适用于miRNA转染的合适方法，则该方法也可应用于多种其他细胞类型。除细胞间交换外，本研究所提出的技术还可用于分析miRNA分子的细胞内运动性。例如， 用于鉴定细胞内可能的转运机制）23,24.

利用FRAP显微镜研究miRNA转移需要使用荧光标记的miRNA分子（图2

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作得到了德国联邦教育与研究部（FKZ 0312138A 和 FKZ 316159）、梅克伦堡-前波美拉尼亚州及欧盟结构基金（ESF/IVWM-B34-0030/10 和 ESF/IVBM-B35-0010/12）、德国研究基金会（DFG，DA1296-1）以及德国心脏基金会（F/01/12）的支持。此外，R.D. 还得到了罗斯托克大学医学中心 FORUN 项目（889001）、DAMP 基金会和德国联邦教育与研究部（BMBF，VIP+ 00240）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
新生NMRI小鼠Charles River
明胶Sigma AldrichG7041PBS中0.1%溶液，已灭菌
PBSPan BiotechP04-53500
Dulbecco´s改良培养基Pan BiotechP04-03550
青霉素/链霉素Thermo Fisher Scientific15140122100 U/mL, 100µg/mL
胎牛血清Pan BiotechP30-3306
细胞培养塑料器皿TPP
原代心肌细胞分离试剂盒Thermo Fisher Scientific88281
HBSSThermo Fisher Scientific88281包含于原代心肌细胞分离试剂盒中
台盼蓝Thermo Fisher Scientific15250061
miRIDIAN Dy547标记的microRNA模拟物DharmaconCP-004500-01-05溶于无RNA酶水，储存液浓度为20µM
磷酸二氢钠SigmaS3139
磷酸氢二钠Carl RothT877.2
氯化钾SigmaP9333
氯化镁Serva28305.01
琥珀酸钠Carl Roth3195.1
0.05%胰蛋白酶/EDTA溶液MerckL2153
4孔玻璃底培养板IBIDI80827用0.1%明胶溶液包被
Amaxa Nucleofector IILonza电穿孔使用程序G-009 
LSM 780 ELYRA PS.1系统Zeiss
Excel软件Microsoft
α-肌动蛋白抗体Abcamab9465稀释比例1:200
连接蛋白43抗体Santa Cruzsc-9059稀释比例1:200
山羊抗小鼠Alexa 594抗体Thermo Fisher ScientificA-11005稀释比例1:300
山羊抗兔Alexa 488抗体Thermo Fisher ScientificA-11034稀释比例1:300
连接蛋白43 siRNAThermo Fisher ScientificAM16708 ID158724终浓度250 nM
近红外活/死细胞染色试剂盒Thermo Fisher ScientificL10119
CellTrace Calcein Red-OrangeThermo ScientificC34851
DAPI细胞核染色剂Thermo ScientificD1306

参考文献

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