利用三维荧光漂白后恢复显微镜分析间隙连接依赖性miRNA转移

摘要

本文描述了三维荧光漂白后恢复技术（3D-FRAP）在分析依赖间隙连接的miRNA转运中的应用。与常用方法相比，3D-FRAP能够以高时空分辨率实时定量小RNA的细胞间转移。

摘要

小分子反义RNA（如miRNA和siRNA）在细胞生理与病理过程中发挥重要作用，此外还可作为治疗多种疾病的治疗剂。miRNA/siRNA治疗新策略的开发依赖于对相关机制的深入理解。近期研究表明，小分子RNA以间隙连接依赖的方式在细胞间进行交换，从而在受体细胞中诱导基因调控效应。分子生物学技术与流式细胞术分析常用于研究miRNA的细胞间转移。然而，这些方法无法提供研究分子通过间隙连接传递所必需的高时间分辨率。因此，为探究miRNA/siRNA作为细胞间信号分子的作用，亟需开发可在单细胞水平分析这些小分子RNA的新工具。本实验方案描述了三维荧光漂白后恢复（3D-FRAP）显微技术在阐明心肌细胞间miRNA分子间隙连接依赖性交换中的应用。重要的是，这种简便且非侵入性的活细胞成像方法能够以高时空分辨率实时可视化并定量荧光标记的小分子RNA通过间隙连接的穿梭过程。3D-FRAP获得的数据证实了一种新的细胞间基因调控通路，即小分子RNA在细胞间网络中充当信号分子。

引言

小非编码RNA在细胞基因调控中发挥着重要作用。这些分子由20-25个核苷酸组成，能够与特定的靶mRNA结合，从而导致翻译受阻或mRNA降解^1,2。小RNA（如miRNA和siRNA）所介导的基因调控过程是一种高度保守的机制，在多种不同物种中均有发现³。特别是miRNA分子在多种生理过程中具有关键作用，包括增殖、分化和再生^4,5。此外，miRNA表达的失调与多种病理状态相关。因此，miRNA已被证明可作为疾病诊断的生物标志物，并有望用于基因治疗中的治疗剂^6,7。

间隙连接（GJs）是相邻两个细胞质膜上的特化蛋白质结构，允许分子量高达1 kD的分子通过扩散进行交换。研究表明，间隙连接在组织发育、细胞分化、细胞死亡以及癌症或心血管疾病等病理紊乱中具有重要作用^8,9,10。已有多种分子被证实能够通过间隙连....

方案

本方案中涉及新生小鼠的所有步骤均遵循罗斯托克大学医学中心动物护理的伦理指南。

1. 心肌细胞培养的细胞培养皿和培养基的制备

1. 用 PBS 中含 0.1% 明胶的溶液包被细胞培养板，在 37 °C 下孵育 4 小时，或在 4 °C 下过夜孵育。去除明胶溶液，并在无菌层流空气中干燥。
2. 准备细胞培养基，包含 50 mL DMEM，添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素（P/S）。预热至 37 °C。

2. 新生儿心肌细胞的分离

1. 使用无菌剪刀断头处死新生小鼠（1-2日龄），沿胸骨打开胸腔。用镊子取出心脏，同时轻轻挤压胸腔，并将心脏转移至含有冰浴HBSS（不含Ca²⁺和Mg²⁺）的24孔板中。
2. 使用无菌镊子去除非心肌组织和较大的血管。将清理后的心脏转移至含有冰浴HBSS的1.5 mL离心管中。每管最多放入5个心脏用于酶消化。
3. 用小剪刀将心脏剪成<0.5至1 mm³的小块。
4. 使用1 mL微量移液器通过吸除/添加HBSS的方式清洗剪碎的心脏组织两次。在加入酶之前，彻底去除HBSS。
5. 对新生小鼠心脏进行酶消化时，使用市售试剂盒并按照制造商提供的说明操作（见材料表）。在37 °C....

结果

本文介绍了一种非侵入性的3D-FRAP显微技术，用于研究荧光标记的miRNA在新生大鼠心肌细胞间通过缝隙连接进行的转运过程。分离得到的心肌细胞呈现出典型的α-肌动蛋白（α-actinin）条纹结构，并在细胞间边界处观察到大量Cx43蛋白斑块（图1A，白色箭头），表明细胞间具有较强的分子交换能力。通过显微镜下对α-actinin阳性细胞进行定量分析，评估了分离心肌细胞的纯度。尽管培养物中存在少量非心肌细胞（α-actinin阴性细胞），但分离后的心肌细胞仍为主要细胞类型，占比达79.62 ± 3.68%（图1B）。

为了研究缝隙连接介导的miRNA交换，我们使用荧光标记的miRNA转染细胞。电穿孔是将miRNA分子递送至细胞的首选方法，因其可确保较高的转染效率以及转染物质在细胞间的均匀分布，而这对于荧光漂白后恢复（FRAP）分析至关重要.......

讨论

miRNA 是细胞生理学中的关键调控因子，已被证实可通过包括间隙连接（GJs）在内的多种途径作为信号分子进行细胞间交换^11,12,22当前方案展示了一种 体外 利用细胞簇中的荧光miRNA，通过活细胞成像技术表征这种间隙连接依赖性的穿梭过程。

该方案以心肌细胞作为细胞模型系统进行开发。然而，若电穿孔是适用于miRNA转染的合适方法，则该方法也可应用于多种其他细胞类型。除细胞间交换外，本研究所提出的技术还可用于分析miRNA分子的细胞内运动性。例如， 用于鉴定细胞内可能的转运机制）^23,24.

利用FRAP显微镜研究miRNA转移需要使用荧光标记的miRNA分子（图2

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
新生NMRI小鼠	Charles River
明胶	Sigma Aldrich	G7041	PBS中0.1%溶液，已灭菌
PBS	Pan Biotech	P04-53500
Dulbecco´s改良培养基	Pan Biotech	P04-03550
青霉素/链霉素	Thermo Fisher Scientific	15140122	100 U/mL, 100µg/mL
胎牛血清	Pan Biotech	P30-3306
细胞培养塑料器皿	TPP
原代心肌细胞分离试剂盒	Thermo Fisher Scientific	88281
HBSS	Thermo Fisher Scientific	88281	包含于原代心肌细胞分离试剂盒中
台盼蓝	Thermo Fisher Scientific	15250061
miRIDIAN Dy547标记的microRNA模拟物	Dharmacon	CP-004500-01-05	溶于无RNA酶水，储存液浓度为20µM
磷酸二氢钠	Sigma	S3139
磷酸氢二钠	Carl Roth	T877.2
氯化钾	Sigma	P9333
氯化镁	Serva	28305.01
琥珀酸钠	Carl Roth	3195.1
0.05%胰蛋白酶/EDTA溶液	Merck	L2153
4孔玻璃底培养板	IBIDI	80827	用0.1%明胶溶液包被
Amaxa Nucleofector II	Lonza		电穿孔使用程序G-009
LSM 780 ELYRA PS.1系统	Zeiss
Excel软件	Microsoft
α-肌动蛋白抗体	Abcam	ab9465	稀释比例1:200
连接蛋白43抗体	Santa Cruz	sc-9059	稀释比例1:200
山羊抗小鼠Alexa 594抗体	Thermo Fisher Scientific	A-11005	稀释比例1:300
山羊抗兔Alexa 488抗体	Thermo Fisher Scientific	A-11034	稀释比例1:300
连接蛋白43 siRNA	Thermo Fisher Scientific	AM16708 ID158724	终浓度250 nM
近红外活/死细胞染色试剂盒	Thermo Fisher Scientific	L10119
CellTrace Calcein Red-Orange	Thermo Scientific	C34851
DAPI细胞核染色剂	Thermo Scientific	D1306