使用非交联、无甲醛组织固定剂进行HER2 FISH的实验方案：结合冷冻保存与甲醛固定的优点

摘要

荧光 原位 在个体化医疗中，为选择治疗方案，通常需要将组织病理学和分子诊断与荧光原位杂交（FISH）联合应用。本文介绍一种新型的非交联、无甲醛组织固定剂，通过在FISH前增加一步后固定处理，可实现对同一样本进行高质量的形态学、分子生物学及FISH分析。

摘要

数十年来，由于福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织样本能够优异地保存组织形态，其形态学评估一直是癌症诊断的金标准。随着个性化医学的发展，通过结合形态学与分子分析技术及诊断手段，可为特定个体疾病提供量身定制的靶向治疗。然而，从同一FFPE样本中同时开展形态学和分子检测具有挑战性，原因是福尔马林会引起核酸和蛋白质的化学修饰与交联，从而产生不利影响。最近开发出一种非交联、无福尔马林的组织固定剂，旨在同时满足两方面需求：即在形态学保存上达到FFPE水平，在生物分子保存上达到冷冻保存水平。由于荧光原位杂交（FISH）常需与组织病理学及分子诊断联合应用，我们测试了现有FISH方案在采用这种新型固定剂处理的组织上的适用性。我们发现，在非交联、无福尔马林且石蜡包埋（NCFPE）的乳腺癌组织切片上进行福尔马林后固定处理后，其人表皮生长因子受体2（HER2）FISH分析结果与FFPE组织相当。本方案描述了如何通过对组织切片进行简单的后固定步骤，将原本为FFPE组织开发并验证的FISH检测方法应用于NCFPE组织。

引言

个体化医疗日益依赖于结合组织形态学和分子分析的多参数检测。作为金标准的福尔马林固定能够提供优异的形态学质量^1,2。然而，福尔马林引起的蛋白质和核酸的化学修饰及交联^3,4,5会干扰分子分析⁶。这些分子修饰会降低核酸和蛋白质的质量，并可能导致基因序列假象⁷或基于聚合酶链式反应（PCR）检测的灵敏度下降⁸。尽管已投入大量努力优化针对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织的分子检测，但总体而言，组织的冷冻保存仍优于福尔马林固定，因此常需将组织样本分样以进行不同的保存处理。为避免分子分析必须依赖冷冻保存，已开发出一种非交联、不含福尔马林的固定液PAXgene Tissue。该商业化系统由一种固定液和一种稳定液组成，其中含有多种醇类、乙酸以及一种可溶性有机化合物。多项研究已证实，该系统可有效保存核酸、（磷酸化）蛋白质及组织形态^{6,9,10,11,12,13}。

在癌症诊断中，FISH 的一个特定应用是检测多种染色体改变，例如易位、亚显微缺失和扩增¹⁴。例如，20%的浸润性乳腺癌肿瘤表现出人表皮生长因子受体2（HER2）基因的扩增^15,16,17，该现象与不良预后相关^18,19。通过FISH检测乳腺癌中HER2的过表达和扩增状态，对于筛选适合接受抗HER2靶向治疗的患者至关重要，且该检测已被美国食品药品监督管理局（FDA）列为伴随诊断方法（http://www.fda.gov/MedicalDevices/ProductsandMedicalProcedures/InVitroDiagnostics/ucm301431.htm）¹⁷。为了在医疗实践中广泛开展基于FISH的伴随诊断，相关检测方法已针对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织开发并获得批准。

在之前的一项研究中，我们发现NCFPE组织不能用于已批准用于FFPE组织的FISH检测。然而，对NCFPE组织经4%缓冲甲醛进行不同后固定时间处理的时间序列实验表明，NCFPE组织切片后固定时间达到18小时或更长时间时，可获得与FFPE组织相当的结果¹⁴。

本研究中，我们提供了一项详细方案，并展示了非交联、无甲醛组织固定以及同一原代组织样本在用于HER2 FISH和RNA质量分析的切片上，经24小时4%缓冲甲醛后固定的处理效果。

图1：荧光实验步骤示意图 原位 杂交（FISH）以及对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）和非交联、无福尔马林固定的石蜡包埋（NCFPE）组织的RNA分析 请点击此处以查看此图的放大版本。

方案

该研究已获得奥地利格拉茨医科大学伦理委员会批准（参考编号 20-066）。在患者签署书面知情同意书后，采集了两例手术切除的原发性浸润性乳腺癌组织样本。

1. 组织固定

注意：组织固定可使用标准缓冲福尔马林溶液（SBFS），即根据 CEN/TS 16827-1:2015 定义的含有 3.7% 质量分数（相当于 4% 体积分数）甲醛、缓冲至 pH 6.8 至 pH 7.2 的 10% 福尔马林溶液，或使用非交联、无福尔马林的组织固定系统（下文亦称为替代固定溶液），后者在室温（RT）下由固定剂和稳定剂溶液组成。

1. 使用无菌手术刀将乳腺癌组织样本切成两半，每块厚度为4 mm，以确保足够的组织量。用于NCFPE或SBFS组织固定的组织最大尺寸为4 × 15 × 15 mm。
2. 将每块肿瘤组织样本放入标准组织包埋盒中，并浸入SBFS或替代固定液中固定24小时，固定液体积与组织体积之比（v/v）为4:1（即每1 g组织使用4 mL固定液，理想情况下为10 mL/1 g）。
3. 打开容器，将组织包埋盒旋转180°后浸入稳定化溶液中，使经替代固定液处理的样本在其中转移并孵育2–72小时。
4. 将经SBFS固定的组织包埋盒放入250 mL 70%乙醇中，在室温下处理30分钟，以去除残留的SBFS。
   注意：此步骤至关重要，可避免在自动组织处理仪中SBFS污染非交联性固定液处理的样本，否则会破坏非交联性固定液在生物分子保存方面的有益特性。
   警告：SBFS为危险溶液，可引起皮肤刺激、严重眼损伤，可能引发过敏性皮肤反应，疑似导致遗传缺陷，可能致癌，引起呼吸道刺激、嗜睡，并对器官造成损害。替代固定液经吸入、皮肤接触或吞咽后有毒，对眼睛和皮肤具有刺激性，经吸入、皮肤接触或吞咽后有造成严重不可逆损害的危险。应避免与这两种固定液发生吸入或直接身体接触。操作时须穿戴适当的防护服、手套以及眼面部防护装备，并在通风橱内进行操作。
5. 继续进行组织处理、包埋及切片（见第2和第3节）。

2. 组织处理与包埋

1. 使用固定组织样本的组织盒进行梯度脱水：70 % 乙醇（2 次，每次 15 分钟）、80 % 乙醇（30 分钟）、90 % 乙醇（60 分钟）、99 % 乙醇（2 次，每次 60 分钟），然后用二甲苯处理（2 次，每次 60 分钟）。随后在自动组织处理机中用石蜡浸润（4 次，每次 45 分钟）。
2. 用镊子将已脱水并经石蜡渗透的样本（或另法固定及 SBFS 固定的样本）放入金属模具中。
3. 使用石蜡包埋仪，将样本包埋于 5 - 10 mL 熔化石蜡（凝固点 56-58 °C）中。
4. 将模具置于 -5 °C 冷却板上冷却 30 分钟。
5. 从模具中取出石蜡包埋的组织块。
6. 将所得组织块（另法固定石蜡包埋组织块（NCFPE）及 SBFS 固定石蜡包埋组织块（FFPE））避光保存于 4 °C，直至使用。

3. FISH 实验的组织切片与玻片制备

注意：FFPE 切片可直接用于 FISH，而 NCFPE 切片则需在 SBFS 中后固定 24 小时后再进行 FISH 操作。

1. 将一次性刀片插入切片机，并将切片机调节至 10 µm。
2. 从冷却板上取下第一个包埋块，并将其插入仪器中。
3. 修块至表面平整。用刷子清洁切片机，并将其调整至 3 µm。弃去前 2–3 个切片。
4. 切取 NCFPE 和 FFPE 包埋块的 3 µm 切片，并将其放入冷水中（超纯水）。
   注意：为了获得无细胞核重叠的更佳显微图像，此处展示的是 2 µm 切片的图像，而非厂家说明书推荐的 3–5 µm 切片。
5. 使用细毛笔和针将漂浮的切片逐一转移至经处理的载玻片上，以利于组织切片贴附。
6. 将载玻片浸入温水浴（40 °C）中，使切片充分展开。
7. 小心地将载玻片从水中拉出，使切片重新附着于玻片上，并避免产生皱褶。
8. 将所有切片在室温下干燥 1 小时。
9. 将载玻片置于 70 °C 的孵育箱中加热 30 分钟，以熔化石蜡。
10. 将载玻片水平放入玻璃染色缸中。
11. 在室温下，于盛有 250 mL 各种液体的染色缸中逐步进行水化处理，每步时间如下：100 % 二甲苯 2 次，每次 15 分钟；96 % 乙醇 2 次，每次 15 分钟；90 % 乙醇 2 分钟；80 % 乙醇 2 分钟；70 % 乙醇 2 分钟；50 % 乙醇 2 分钟；蒸馏水 2 次，每次 10 分钟。
    警告：脱蜡和水化步骤应在通风橱中进行，避免吸入有毒挥发性溶剂。
    注意：根据切片和组织类型的不同，可能需要预先测试不同的孵育时间。

4. NCFPE 标本的后固定

1. 将NCFPE切片放入盛有SBFS的新染色缸中，在室温下进行24小时的后固定。在24小时后固定过程中，将染色缸置于通风橱内。
2. 用磷酸盐缓冲液洗涤（3次，每次10分钟）和蒸馏水洗涤（2次，每次10分钟）以去除多余的SBFS。

5. 荧光 原位 杂交（FISH）

注意：此处荧光原位杂交（FISH）采用市售的HER2/CEN17双色探针试剂盒，按照制造商提供的说明书进行操作。在杂交和洗涤步骤中，切勿让组织切片干燥。探针溶液及4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）DNA复染溶液应避免长时间暴露于光照下，所有操作均需在避光条件下使用避光容器进行。根据样本材料的保存时间和固定步骤，可适当调整变性和洗涤温度，以获得更佳的杂交结果。

1. 将含有 250 mL 柠檬酸预处理液的染色缸置于 98 °C 水浴中。
2. 将复水后的 FFPE 和后固定的 NCFPE 切片放入染色缸中，孵育 15 分钟。每个染色缸中切片数量不得超过六张。
3. 在新的染色缸中，用蒸馏水在室温下清洗切片 3 分钟。
4. 进行蛋白酶消化时，将切片放入温度可控的杂交系统中，于 37 °C 下孵育。
   1. 立即以滴加方式（每滴约 30 µl）将即用型胃蛋白酶溶液（2 mg/ml）滴加至组织切片上，直至完全覆盖组织。在杂交系统中于 37 °C 孵育 9 分钟。
      注意：建议孵育时间为 5–15 分钟。最佳蛋白酶消化时间应预先确定。
   2. 将切片放入含有 SSC 洗涤缓冲液的染色缸中，孵育 5 分钟。
   3. 在室温下用蒸馏水冲洗切片 1 分钟。
   4. 依次在 50 %、70 %、90 % 和 100 % 的梯度乙醇中进行脱水，每种浓度各 1 分钟。将切片自然晾干。
   5. 进行杂交时，用移液器吸取 10 µL HER2/CEN17 探针滴加至干燥的组织切片上，每张样本加盖盖玻片，并用橡胶胶水密封。
      注意：建议每 22 × 22 mm 组织区域使用 10 µL 探针。轻微加热探针有助于移液操作。避免产生气泡，并避免探针长时间暴露于光线下。
   6. 在杂交系统中于 75 °C 下共变性探针与样本 DNA 10 分钟。
   7. 将杂交系统设定为 37 °C，过夜杂交。
   8. 杂交后检测前，用镊子小心去除橡胶胶水。
   9. 将切片放入含有预热至 37 °C 的 1 × 洗涤缓冲液 A 的染色缸中孵育 5 分钟，随后取下盖玻片。
   10. 用预热至 37 °C 的 1 × 洗涤缓冲液 A 洗涤切片两次，每次 5 分钟。
   11. 在 70 %、90 % 和 100 % 乙醇中依次脱水，每种浓度各 1 分钟。
   12. 将样本在空气中干燥，并避光保存。
   13. 进行染色时，向杂交区域滴加 30 µL DAPI 溶液，避免产生气泡，然后加盖盖玻片。
   14. 避光孵育 15 分钟。
   15. 用滤纸轻轻按压切片，小心去除多余的 DAPI 溶液。
   16. 将切片在 2–8 °C 避光条件下保存，最长可保存两周，直至进行共聚焦显微镜观察。

6. FISH 切片的共聚焦成像与扫描

1. 使用配备40倍/1.2数值孔径物镜、四通道滤光片（DAPI/FITC/TRITC/Cy5）和550万像素、16位、冷却型科学互补金属氧化物半导体（CMOS）相机的共聚焦数字扫描仪，对切片进行共聚焦成像与扫描。
2. 使用绿色（激发：503 nm，发射：528 nm）和橙色（激发：547 nm，发射：572 nm）通道的滤光片采集图像。

7. 结果解读

注意：HER2/CEN17 探针由两种成分组成，一种是红色荧光标记的 CEN17 探针，特异性结合于 17 号染色体（D17Z1）着丝粒区的 α 卫星重复序列；另一种是绿色荧光标记的 HER2 探针，特异性结合于 HER2 基因（探针定位 17q12）。每个细胞核中 HER2:CEN17 比值 ≤2.0 的肿瘤标本判读为正常，而比值 ≥2.0 的则判读为扩增¹⁷。

1. 使用开源软件 CaseViewer 2.1²⁰ 对图像进行质量分析。
   1. 评估至少 20 个细胞，这些细胞应位于病理学家所定义的癌浸润组分的两个不同区域。计数区域内应包含清晰可辨、分布良好的细胞核。排除位于组织边界以及收缩或挤压区域的组织部分。

8. RNA 质量

1. RNA 提取
   1. 确保所有仪器和工具均无 RNA 酶。使用去除 RNA 酶的溶液。
   2. 使用切片机按照操作步骤切取 10 至 20 片 NCFPE 或 FFPE 样本（厚度为 5 µm），直至步骤 3.8。
   3. 使用 RNA 提取试剂盒（参见材料表）从 NCFPE 样本中提取 RNA；使用 FFPE RNA 提取试剂盒从 FFPE 样本中提取 RNA。
      注意：非交联固定剂处理的样本提取 RNA 时，需采用适应该固定方法的提取方式。不得使用其他 RNA 提取方法（例如，NCFPE 样本不得使用 Trizol、RNeasy FFPE 等方法）。
   4. 使用分光光度计测定 RNA 浓度和纯度。260 nm 与 280 nm 处吸光度比值（A260/280）应约为 2.0。
   5. 将提取的 RNA 储存于 -70 °C，待后续分析使用。
2. 使用不同长度扩增子的引物，进行甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）实时反转录 PCR^8,9。
   1. 根据制造商说明书，使用 cDNA 反转录试剂盒进行 cDNA 合成。每份样本使用 500 ng RNA。将 cDNA 储存于 -20 °C，以备后续使用。
   2. 根据制造商说明书配制 PCR 主混合液。
   3. 将 PCR 主混合液分装至 384 孔反应板中，每孔设三个复孔。每孔加入 4 µL 经 1:16 稀释的 cDNA（PCR 模板）。按照制造商说明书进行 PCR 扩增。
      注意：针对人源 GAPDH，使用以下引物：GAPDH 正向引物：5´-CCACATCGCTCAGACACCAT-3´；GAPDH 反向引物：71 bp 对应 5´-ACCAGGCGCCCAATACG-3´，153 bp 对应 5´-GTAAACCATGTAGTTGAGGTC-3´，200 bp 对应 5´-TTGACGGTGCCATGGAATTT-3´，277 bp 对应 5´-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3´，323 bp 对应 5´-AAGACGCCAGTGGACTCCA-3´，以及 530 bp 对应 5´-ACGATACCAAAGTTGTCATG-3´。
   4. 使用适用于 PCR 仪器的软件分析结果。必须基于熔解曲线分析排除非特异性产物²¹。

结果

FISH HER2 检测：

FFPE 和 NCFPE 样本中的 HER2-FISH 信号强度相似（图 2）。在大多数细胞中，两种样本均显示出绿色信号明显多于红色信号（绿色信号代表扩增的 HER2 基因位点，红色信号为 CEN17 参考基因）。因此，该病例显示 HER2 基因扩增，提示该患者可能对曲妥珠单抗（一种抗 HER2 靶向治疗药物）有治疗反应。FFPE 样本作为阳性对照。在非肿瘤细胞中（包括 FFPE 和 NCFPE 样本）观察到的信号可作为 HER2 基因扩增的内部参考和阴性对照。每次分析系列中，至少应使用一个已知基因扩增状态的切片作为杂交反应的阳性对照。

RNA 质量：

通过实时逆转录PCR检测两个不同病例的相应FFPE和NCFPE样本，显示出RNA质量的差异。实验结果表明，GAPDH mRNA在不同扩增子长度（即71 bp、153 bp、200 bp、275 bp、323 bp）下的扩增效率存在差异。所有来自FFPE样本的Ct（循环阈值）均高于NCFPE样本。该差异表明从FFPE组织中提取的mRNA的PCR扩增能力较低，提示其发生了更显著的化学修饰。此外，长扩增子的Ct值高于短扩增子，表明mRNA存在片段化现象。相比之下，不同扩增子长度的Ct值变化斜率显示，FFPE组织中的mRNA片段化程度明显高于NCFPE组织（图3）。

图2：对应福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）和非交联、无福尔马林固定石蜡包埋（NCFPE）组织切片的HER2 FISH代表性结果。 显示来自相同组织的FFPE（A）和NCFPE（B）对应的样本。与正常间期细胞（C）中预期出现两个绿色信号（HER2）和两个红色信号（CEN17）不同，HER2基因位点扩增的细胞表现为多个绿色信号拷贝（HER2）（D）。HER2扩增状态在FFPE和经后固定的NCFPE切片（A，B）中一致。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：用于 RNA 质量控制的实时反转录 PCR 检测结果。 Y 轴：显示 X 轴上不同扩增子长度（71 bp、153 bp、200 bp、275 bp、323 bp）对应的 GAPDH 基因的 Ct（循环阈值）值。mRNA 来自两个不同乳腺癌组织样本的 FFPE 和 NCFPE，样本并行处理，提取后反转录为 cDNA 进行 PCR 扩增。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

结果表明有两个关键发现。首先，对NCFPE组织切片进行简单的24小时SBFS后固定步骤，足以在使用经批准用于FFPE组织的FISH检测时获得与FFPE组织相当的结果（另见参考文献¹⁴）。该方案的优势在于可直接使用最初为FFPE组织开发并获批的FISH检测，而无需进行全面的重新验证（例如，无需针对非交联组织优化杂交前条件）。FISH实验方案可完全按照制造商提供的说明书进行操作。

本方案中对制造商说明书中所述步骤的微小修改（例如组织切片直径以及脱蜡步骤中的孵育时间），源于此前的适应性调整，制造商明确建议根据所用不同组织类型和固定方法进行此类调整。

后固定步骤至关重要，因为它需要18-24小时的化学反应时间，虽然会使分析时间延长一天，但能够与常规FFPE组织所采用的每日工作流程保持一致（图1）。据报道，SBFS穿透组织的平均速率为每小时1毫米²²，在2小时内可穿透5毫米，具体速度取决于组织类型^23,24。观察发现，只有当后固定时间超过18小时，才能使NCFPE切片的性质转变为类似FFPE切片，这表明决定结果的关键因素并非固定剂的渗透，而是足够的化学反应时间^1,14。

其次，未用于后固定的剩余NCFPE组织可用于进一步的分子分析，因为生物分子得到了良好保存。这一点已通过实时逆转录PCR得到证实（图3）。与电泳图谱-derived RIN值（RNA完整性数值）相比，该检测方法在评估石蜡包埋组织中提取的mRNA的RNA质量（即化学修饰和片段化）方面具有更高的敏感性和特异性⁸。本研究的质量控制仅限于实时PCR，因为已有独立研究组表明，除RNA外，从NCFPE组织中提取的DNA和蛋白质质量也优于FFPE组织^8,9,13。

本方案遵循适用于预分析流程的CEN技术规范要求（如SBFS配方、固定条件、RNA质量控制、验证等） 体外 体外诊断（IVD），这些标准最近由欧洲标准化委员会（CEN）发布（例如，CEN/TS 16827-1:2015，用于从FFPE组织中分离RNA，该标准引用了ISO 15189标准）。

该方法仅限于这种特定的固定剂。尽管已有多个研究证明，使用非交联、无甲醛固定剂能够良好地保存生物分子和形态结构，但其主要仍用于研究领域，尚未应用于常规医学实践。其中一个原因是，若以其他固定剂替代金标准SBFS固定法，则需要进行多种验证性研究，因为并非所有针对FFPE材料优化的实验方案都适用于非交联固定剂处理的样本。本FISH实验方案未测试其他组织固定方法。

本文所述的简单固定后步骤具有优势，可对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）和非固定冷冻包埋（NCFPE）组织使用经IVD批准的检测方法。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SAV LP GmbH，德国弗林茨巴赫	www.sav-lp.de	FN-200L-4-1	组织固定剂
Simport Plastic Ltd.，加拿大贝洛瓦	www.simport.com	M-498	用于组织样本的标记、固定和石蜡包埋的保存装置。
Qiagen GmbH，德国希尔登	www.qiagen.com	765112	用于组织样本的采集、固定和稳定：包含10个预填充试剂容器，内含PAXgene组织固定液（PAXgene Tissue FIX）和PAXgene组织稳定剂（PAXgene Tissue STABILIZER）。
ThermoFisher Scientific	www.thermofisher.com	813150	生物样本处理设备，从化学固定到石蜡浸润
Merck Millipore，德国慕尼黑	www.analytics-shop.com/de/hersteller/millipore.html	MC1009834000	组织样本脱水
VWR Chemicals，德国达姆施塔特	https://at.vwr.com	10293EP	组织样本脱水
ACM Herba Chemosan Apotheker AG，奥地利维也纳	www.herba-chemosan.at	2549662 32	组织处理设备中使用的石蜡
Leica Mikrosysteme Handels GmbH，奥地利维也纳	www.LeicaBiosystems.com	39602004	石蜡包埋介质
Sanova Diagnostik，奥地利维也纳	www.sanova.at	5229	用于组织学研究的组织石蜡包埋仪器
Histocom Medizintechnik Vertriebs GmbH，奥地利维也纳新多夫	www.histocom.info	M 910010	该设备用于生物学和医学中特别复杂的石蜡切片技术。仅限熟练或经过专门培训的人员操作切片机，包括样本夹持、修块、切片以及从仪器上取下切片等操作。
Dako Denmark A/S，丹麦格洛斯特鲁普	www.chem.agilent.com	K802021-2	涂层载玻片，用于贴附福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片。
Qiagen GmbH，德国希尔登	www.qiagen.com	73504	用于从福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片中纯化总RNA
Qiagen GmbH，德国希尔登	www.qiagen.com	765134	用于从PAXgene固定、石蜡包埋的组织切片中纯化总RNA
ZytoVision GmbH，德国布莱梅港	www.zytovision.com	Z-2015-200	用于检测实体恶性肿瘤（如乳腺癌样本）中常见的ERBB2（又称HER2）基因扩增。
3DHISTEC，匈牙利布达佩斯	www.3dhistech.com		用于扫描组织切片的数字设备，配备40x/1.2 NA物镜、四通道滤光片（DAPI/FITC/TRITC/Cy5）以及550万像素、16位、冷却型科学CMOS（互补金属氧化物半导体）相机。
ThermoFisher Scientific	www.thermofisher.com	4368814	高容量cDNA反转录试剂盒，包含将最多2 µg总RNA在单个20 µL反应体系中定量转化为单链cDNA所需的所有组分。
ThermoFisher Scientific	www.thermofisher.com	4367659	PCR主混合液，包含用于PCR扩增及扩增子定量的聚合酶、核苷酸和SYBR Green染料。
ThermoFisher Scientific，美国特拉华州威尔明顿	www.thermofisher.com	序列号 F239	用于核酸定量的分光光度计。
QuantStudio 7 Flex 实时荧光定量PCR系统	www.thermofisher.com	4485701	PCR仪
Vysis/Abbott Laboratories，美国伊利诺伊州艾博特公园	www.molecular.abbott/us/en/products/instrumentation/thermobrite#order	例如（ThermoBrite）07J91-020	温度可控的玻片处理系统，用于原位变性/杂交实验。