通过基因转移在新型RIP-Tag; RIP-tva小鼠模型中鉴定和表征转移因子

摘要

我们提出了一种利用RIP-Tag; RIP-tva小鼠模型展示新型体细胞基因转移系统的研究方案，用于分析基因在转移过程中的功能。通过心内注射将禽类逆转录病毒递送至成年小鼠体内，以确保将基因导入胰腺β细胞的癌前非侵袭性病灶中。

摘要

转移性癌症导致了90%的实体瘤患者死亡。迫切需要更深入地了解癌症转移的驱动因素，并确定新的治疗靶点。为了研究从原发性癌症进展为转移性癌症过程中的分子事件，我们开发了一种双转基因小鼠模型RIP-Tag; RIP-tva。在此小鼠模型中，大鼠胰岛素启动子（RIP）驱动SV40 T抗原（Tag）以及A亚群禽类白血病病毒受体（tva）在胰腺β细胞中的表达。这些小鼠会以100%的外显率发展出胰腺神经内分泌肿瘤，其发生过程经历明确的阶段，类似于人类肿瘤的发生过程，包括增生、血管生成、腺瘤和侵袭性癌等阶段。由于RIP-Tag; RIP-tva小鼠不会自发产生转移性疾病，因此可以方便地识别促进转移的遗传改变。通过心内注射携带目标遗传改变的禽类逆转录病毒，可实现对表达tva的、正在增殖的胰腺β细胞癌前病变进行体细胞基因转移。每毫升感染单位数超过>1 × 10⁸的病毒滴度被认为适合用于体内感染。此外，禽类逆转录病毒能够高效感染从RIP-Tag; RIP-tva小鼠肿瘤中建立的细胞系。这些细胞系也可用于鉴定和表征促转移因子。本文将演示如何利用该小鼠模型及细胞系来评估候选基因在肿瘤转移中的功能。

引言

大多数癌症源于体细胞突变¹。传统的基因工程小鼠模型（GEMM）在揭示特定遗传改变对肿瘤发生的作用方面提供了重要见解²。然而，这些模型存在若干局限性。此类模型的主要缺点在于无法模拟人类肿瘤形成的散发性特征，即仅组织中的部分细胞获得遗传改变。此外，转基因和基因敲除小鼠的突变属于生殖系突变，可能影响发育过程。而且，构建这些小鼠模型的成本高昂且耗时较长。

转移是癌症领域中的一个重要问题。在基因工程小鼠模型（GEMM）中建立转移模型一直较为困难。在小鼠中，自发性转移极为罕见。GEMM转移模型的外显率具有变异性，且潜伏期较长³。实验性转移模型通过将细胞直接注射到小鼠循环系统中，从而绕过了转移级联反应的早期步骤。

为了克服上述在小鼠模型中研究转移因子的一些局限性，我们开发了一种双转基因小鼠模型 RIP-Tag; RIP-tva⁴。该策略基于将高度同步的肿瘤进展小鼠模型 RIP-Tag ⁵ 与A亚群禽白血病病毒受体 tva ^6,7 相结合。RIP-Tag; RIP-tva 小鼠模型允许将基因以体细胞方式导入单一的双转基因小鼠品系中。SV40 T抗原可抑制Rb和p53的肿瘤抑制功能，小鼠由此发生胰腺神经内分泌肿瘤，其发生过程与人类肿瘤发生相似，包含增生、血管生成、腺瘤及侵袭性癌等阶段。该 RIP-Tag 模型极大地促进了我们对癌症特征的理解，其应用不仅限于胰腺神经内分泌肿瘤，还已被用于临床前试验 ⁸。

我们介绍了一种通过心内注射禽类逆转录病毒至RIP-Tag; RIP-tva小鼠体内实现体细胞基因转移的实验方案。使用RCASBP衍生的禽类逆转录病毒成功感染靶细胞的前提是靶细胞处于活跃增殖状态。因此，我们选择7周龄的RIP-Tag; RIP-tva小鼠进行实验，此时约50%的胰岛已出现增生。为达到10–20%的感染效率，需向左心室进行高滴度病毒的心内注射⁴。该递送方式可减少病毒颗粒在到达胰岛前因血液循环而造成的显著稀释。

利用这一方法，我们先前已证明Bcl-xL可促进癌症转移，且该作用独立于其抗凋亡功能^4,9。在RIP-Tag; RIP-Bcl-xL小鼠模型中，当Bcl-xL在整个肿瘤发生过程中于所有胰腺β细胞中通过转基因表达时，并未观察到这种不依赖抗凋亡作用的转移功能¹⁰。因此，我们的小鼠模型为研究在肿瘤发生后期阶段表达的基因功能提供了独特的机会。由于在未感染病毒的RIP-Tag; RIP-tva双转基因小鼠中，仅有2%-4%的胰岛会发展为肿瘤，且并非所有癌前病变均被RCASBP来源的禽类逆转录病毒感染，因此只有那些相较于肿瘤自然进程具有选择性优势的因子才能被鉴定出来。特别是转移相关因子最容易通过该方法被识别，因为在RIP-Tag; RIP-tva小鼠中通常不会发生向胰腺淋巴结或其他器官的转移。

方案

伦理声明：动物实验严格按照威尔康奈尔医学院动物护理和使用委员会制定的指南和规定进行。

1. 禽逆转录病毒载体的选择（基于RCASBP(A)或基于RCANBP(A)）

• 载体源自劳斯肉瘤病毒¹¹禽类逆转录病毒载体可递送 cDNA（≤2.5 kb）、短发夹 RNA（shRNA）、微小 RNA（miRNA）及其他非编码 RNA。 commercially available vectors 的列表见于 材料 以及其他需要直接向作者申请获取的资源。
• 过表达目的基因，使用以下载体之一：RCASBP(A)¹² (图1A），RCAS-X（图1B），RCAS-Y¹³ (图1C），RCASBP-Y DV¹⁴，或其他 ALV-A 载体（https://home.ncifcrf.gov/hivdrp/RCAS/mice.html）。
• 利用shRNA敲低目的基因，使用以下载体之一：RCAN-X DV¹⁵ 或 RCAS-RNAi¹⁶.
• 过表达miRNA，按照所述方法构建RCAS-miR载体¹⁷.
• 转化至 E. coli 以及DNA需求。
• 建议将DNA转化至Stbl2或Stbl3感受态细胞中，这些细胞具有独特的基因型，可稳定直接重复序列和逆转录病毒序列。使用能够获得高纯度转染级质粒DNA的方法进行质粒DNA纯化。所需DNA量为5 µg，最低浓度为0.1 µg/µl。

2. 鸡成纤维细胞DF1细胞系中的病毒增殖

1. 进行细胞培养时必须使用带滤膜的移液吸头，以防止病毒储备液之间发生交叉污染¹⁸。
2. 将DF1细胞培养于6 cm培养皿中，使用生长培养基（含高糖DMEM、10%胎牛血清、6 mM（终浓度）L-谷氨酰胺、10 单位/ml 青霉素、10 µg/ml 链霉素），在37 ^oC、5% CO₂条件下培养。若DF1细胞为刚从冻存状态复苏，则转染前需至少培养3天。
3. 转染前一天，将DF1细胞传代至6 cm组织培养皿中，使其在转染时达到30–50%的融合度。
4. 在组织培养超净台内，用不含血清、青霉素和链霉素的DMEM将5 µg纯病毒DNA稀释至总体积150 µl，置于微量离心管中。
5. 将30 µL Superfect直接加入已稀释的DNA管中；涡旋混合10秒；在组织培养超净台中室温静置5–10分钟，以形成转染复合物。
6. 在复合物形成期间，轻柔吸除DF1细胞培养皿中的生长培养基，并用4 ml PBS^-/-小心洗涤细胞。
7. 吸取5 ml生长培养基（含血清和抗生素）；将其中4 ml转移至Falcon管中备用；将剩余的1 ml加入转染复合物中。用移液器轻轻吹打混合2次，立即把全部转染复合物转移至DF1细胞中。轻轻摇动培养皿以确保细胞层被均匀覆盖；在37^oC孵育2–3小时。
8. 吸除转染混合液，用4 ml PBS^-/-洗涤细胞，加入4 ml新鲜生长培养基（含血清和抗生素），将细胞放回37^oC培养箱中继续培养。
9. 当细胞达到汇合状态时进行传代（可在转染后48至72小时检测瞬时表达）。
10. 继续传代培养约7天，直至所有细胞均被感染；通过PCR检测病毒DNA整合情况，并通过Western blotting检测蛋白表达水平；最后用含10% DMSO和20%胎牛血清的DMEM培养基将细胞冻存。

3. In Vivo 感染 RIP-Tag; RIP-tva 小鼠

1. 病毒的收集与浓缩
   使用新鲜浓缩的病毒 体内 感染。保存在 4 的病毒滴度 ^o一周内C的含量未见显著降低。然而，病毒储备液的冻存等分试样在解冻后滴度下降10倍。
   1. 根据所需病毒的量，将病毒生产用DF1细胞扩增至15 cm培养皿中。对于 体内 小鼠感染实验中，每只小鼠准备平均一个培养皿。
   2. 将转子（例如 SW28）、摆桶及超速离心机预冷至 4^oC.
   3. 从汇合的15 cm培养皿中收集上清液。在4 °C下以1,650 × g低速离心10分钟，去除细胞碎片^oC.
   4. 将病毒上清液转移至超速离心管（聚碳酸酯离心管）中，在4 °C条件下以95,400 × g离心1.5小时 ^oC. 对于 Beckman XL-100 超速离心机，使用加速档位：1；减速档位：1 的设置。
   5. 尽可能移除超速离心管中的上清液。加入不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）^-/-将病毒悬液加至超速离心管中，从一个15 cm培养皿中制备终体积为100 µl的病毒悬液。用Parafilm封口膜覆盖管口。通过在中等速度下涡旋振荡超速离心管2分钟，重悬不可见的病毒沉淀。
   6. 在4℃下轻轻摇动超速离心管 ^o4°C 下孵育一小时至过夜。
   7. 将病毒悬液转移至微量离心管中。在注射小鼠前，将病毒悬液升温至室温。
2. 病毒滴度测定
   每种新的病毒载体构建完成后，在使用前均需测定其病毒滴度 体内 感染
   1. 将DF1细胞接种于12孔组织培养板的所有孔中（建议：2 × 10⁵ 细胞/孔）⁴ 细胞/孔，1 毫升/孔），使其在感染时融合度达到30%。每项病毒滴度测定需要一个12孔板。
   2. 在生长培养基中对病毒上清液进行连续10倍梯度稀释，步骤如下：
      1. 将5 µl病毒上清液与495 µl培养基混合，制备10⁻²稀释度² 在微量离心管中进行稀释。涡旋振荡数秒。
      2. 从10中取出40 µl² 稀释至360 µl培养基中，置于微量离心管内，用于10倍稀释³ 稀释。涡旋振荡数秒。
      3. 按照步骤 3.2.2.2 进行 10 次⁴ 和 10⁵ 稀释
      4. 准备5个6 ml聚苯乙烯管，每管分装2.25 ml培养基，并标记为10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰分别。
      5. 混合 0.25 ml 来自 10⁵ 用2.25 ml培养基在6 ml聚苯乙烯管中进行稀释，用于10倍稀释⁶ 稀释。涡旋振荡数秒。
      6. 按照步骤 3.2.2.5 操作，持续 10⁷, 10⁸, 10⁹，和10¹⁰ 稀释
      7. 从12孔板中的DF1细胞中移除原始培养基。每孔加入1 ml稀释后的病毒液，设两个重复孔（未感染组，10¹⁰ 至 10⁶ IU/ml
   3. 让细胞生长至少 7 天（必要时进行胰酶消化）。收集细胞以提取 DNA，并按照所述方法通过 PCR 检测病毒 DNA 的存在 "6. PCR 实验方案". 如果该病毒滴度为 10⁸ 每毫升感染单位（IU/ml），使用含10个细胞的DNA进行PCR检测时，将观察到398 bp的阳性产物（来自RCASBP）⁸ 至 10⁶ IU/ml 病毒，但不来自未感染的细胞或含有 10 的细胞¹⁰ 至 10⁹ IU/ml 病毒。滴度为 >1 × 10⁸ 每毫升感染单位应被用于 体内 感染
3. 心内注射
   半合子 RIP-Tag 小鼠，而非纯合子小鼠，被用于本研究。半合子 RIP-Tag 小鼠在7至12周龄时会发展出胰腺神经内分泌肿瘤，而纯合子小鼠的肿瘤潜伏期更短。由于细胞增殖是病毒cDNA整合到宿主基因组所必需的，因此使用7周龄的小鼠 RIP-Tag；RIP-tva 使用具有胰岛β细胞增生的小鼠。请注意，在成年小鼠中，大多数正常的β细胞并不发生增殖。
   1. 使用7周龄的 RIP-Tag；RIP-tva 用于实验的纯C57BL/C背景小鼠
   2. 使用氯胺酮/赛拉嗪组合（150 mg/kg；15 mg/kg）对小鼠进行麻醉。在整个麻醉过程中，使用加热装置维持小鼠体温。
   3. 在双眼内涂抹眼用润滑剂，以防止角膜干燥。
   4. 剃除胸部区域的毛发 RIP-Tag；RIP-tva 小鼠。将小鼠仰卧放置，胸部朝上。进行足趾夹捏以观察动物是否无反应，从而确认麻醉完全生效。
   5. 伸展前肢并用胶带固定。在小鼠胸部标记注射位置，在胸骨切迹与剑突顶端之间的中点处标记，位置略偏胸骨左侧（解剖学左侧）。图2).
   6. 用聚维酮碘消毒液或氯己定消毒液擦洗前胸壁，随后使用浸有70%异丙醇或70%乙醇的纱布擦拭。
   7. 用无菌的28G½胰岛素注射器抽取50 µl空气，以在500 µl注射器的柱塞与液面之间形成空隙，随后吸入100 µl病毒。该气腔在管壁无液体附着的情况下，对于观察心脏搏动至关重要。
   8. 保持针头垂直。一手绷紧小鼠皮肤，将针头插入标记位置。当注射器内出现鲜红色搏动性血流时，停止推进针头，并用一只手固定针头在小鼠体内的深度。
   9. 用另一只手仔细且缓慢地推动针栓，在约60秒的时间内注入病毒悬液（约100 µl）。当在注射器内观察到鲜红色的血液脉冲时，立即注入10–20 µl。持续有鲜红色富氧血液进入透明的针头连接部，表明针头已正确置于左心室。
   10. 在最后一次推动活塞以注入病毒悬液后，且在观察到下一次血液搏动性回流之前，迅速将针头从胸腔中拔出。
   11. 在注射部位施加轻柔压力，以减少出血，持续至少1分钟。
   12. 将小鼠小心地移至加热垫上或加热灯下，直至完全清醒。在麻醉作用消退期间需持续观察小鼠，直至其能够自主远离刺激物，此过程通常持续约一小时。术后每日监测小鼠被毛是否均匀完整，以及行为是否出现任何变化。

4. 肿瘤的组织病理学分析

1. 注射后第九周，处死16周龄的RIP-Tag; RIP-tva小鼠。记录原发性胰腺肿瘤的大小和数量，以及任何肉眼可见的转移灶。
2. 将胰腺、肝脏和/或其它器官置于10%中性缓冲福尔马林中，在室温下于摇床上固定过夜。
3. 次日将固定后的组织转移至70%乙醇中。将组织处理并包埋于石蜡中，制备成切片。
4. 按照制造商说明书对突触素（神经内分泌标志物）或胰岛素（β细胞特异性标志物）进行免疫组织化学染色，以鉴定胰腺淋巴结或肝脏中胰腺β细胞的转移灶。然而，去分化的肿瘤细胞或低分化肿瘤细胞可能丧失胰岛素表达，仅能通过突触素免疫染色检测到。

5. 体外 感染表达tva的细胞

进行体外感染时，无需使用浓缩病毒。in vitro 感染可采用以下所述的两轮感染方案。如需进行更多轮次的感染，可重复执行以下方案。

1. 从汇合的 DF1 细胞中收集病毒上清液。将病毒上清液置于 4 ^oC 保存，并在一周内用于感染。感染前，将病毒上清液通过 0.45 μm 滤器过滤，以获得无细胞的病毒。
2. 用 PBS^-/- 快速冲洗表达 tva 的靶细胞（例如来自 RIP-Tag; RIP-tva 小鼠的 N134 胰腺 β 细胞肿瘤细胞系），以去除含有胰蛋白酶抑制剂的血清残留。再用胰蛋白酶-EDTA 溶液（例如 0.25% 胰蛋白酶-2.21 mM EDTA）快速冲洗靶细胞。加入胰蛋白酶-EDTA 溶液，孵育 2 分钟。轻轻敲击培养皿，于倒置显微镜下观察细胞。细胞通常在 2 至 3 分钟内脱落。将靶细胞接种至 6 cm 培养皿中，并使用 3~4 ml 过滤后的病毒上清液作为生长培养基。
   注意：病毒上清液中的营养物质已被 DF1 细胞消耗，因此次日需更换培养基。
3. 次日，将足量的病毒上清液恢复至室温。吸除靶细胞中的培养基，并替换为 3–4 ml 病毒上清液。
4. 第三天，根据需要传代细胞。若细胞密度尚不足以传代，则将约 4 ml 常规生长培养基（含高糖 DMEM、10% 胎牛血清、6 mM（终浓度）L-谷氨酰胺、10 单位/mL 青霉素、10 µg/mL 链霉素）预热后替换病毒上清液。
5. 扩增感染后的细胞，并通过 Western 印迹法检测候选蛋白的表达¹⁹。可利用 Transwell 实验分析候选基因对细胞迁移和侵袭能力的影响。此外，还可通过尾静脉注射转移模型实验，评估这些细胞系向肝脏转移的潜能。

6. PCR 实验方案

所有溶液应尽快在冰上配制。可为大量样品预先配制不含模板的主混合液（mastermix），并分装至各PCR管中。将每种试剂所需用量乘以样品数量。在加入主混合液前，通过轻弹混匀试剂，并用移液器吸头轻轻吹打混匀。每向主混合液管中加入一种试剂后，均需用移液器反复吸打数次，以确保吸头内残留液体完全转移。

1. 检测感染或转染细胞中是否存在 RCASBP。
   以下方案每份样品需要 11.5 µL 混合液和 1 µL 基因组 DNA。添加每种试剂前务必轻轻混匀。
   1. 配制混合液：7.68 µL 无核酸酶水、0.75 µL DMSO、1.25 µL AmpliTaq DNA 聚合酶 10x 缓冲液 II、1.375 µL 25 mM MgCl₂ 和 0.125 µL 25 mM dNTP。
   2. 向混合液中加入 0.125 µL 100 µM 正向引物 RCAS5626F（5'-ACCGGGGGATGCGTAGGCTTCA-3'）和 0.125 µL 100 µM 反向引物 RCAS6023R（5'-CCGCAACACCCACTGGCATTACC-3'）。
   3. 向混合液中加入 0.075 µL AmpliTaq DNA 聚合酶。
   4. 用手指轻弹管壁混匀混合液，短暂离心 3~5 秒使液体沉至管底。
   5. 从混合液中分装 11.5 µL 至各 PCR 管中。每次分装至新管前均需轻轻混匀。
   6. 轻轻混匀后，向每根 PCR 管中加入 1 µL 基因组 DNA 模板。基因组 DNA 的制备方法如下：
      1. 用 200 µL 0.05 M NaOH 裂解细胞沉淀，反复吹打以充分溶解沉淀。
      2. 将细胞裂解液在 PCR 仪中 98 °C 加热 20 分钟，随后冷却至 25 °C。
      3. 向管中加入 20 µL 1.0 M Tris-HCl（pH 7.5），并将 DNA 样品置于 4°C 保存。
   7. 轻弹混匀样品，短暂离心 3~5 秒，将 PCR 管放入 PCR 仪中。
   8. PCR 程序设定为：92 °C 预变性 2 分钟；随后进行 40 个循环，每个循环包括 94 °C 变性 30 秒、67 °C 退火 30 秒、72 °C 延伸 30 秒；最后 72 °C 延伸 10 分钟。
   9. PCR 结束后，向每个样品中加入 3 µL 6x DNA 上样染料，轻弹混匀，短暂离心 3~5 秒。
   10. PCR 产物通过 1x TAE 缓冲液中的 2%（w/v）琼脂糖凝胶电泳进行检测，其扩增产物大小为 398 bp。
2. Tag 基因分型。
   以下方案每份样品需要 10.5 µL 混合液和 2 µL 基因组 DNA。添加每种试剂前务必轻轻混匀。
   1. 配制混合液：4.5 µL 无核酸酶水和 4.00 µL MyTaq DNA 聚合酶 5x MyTaq 反应缓冲液。
   2. 向混合液中加入 0.4 µL 100 µM 正向引物 TagF2（5'-GGACAAACCACAACTAGAATGCAGTG-3'）和 0.4 µL 100 µM 反向引物 TagR2（5'-CAGAGCAGAATTGTGGAGTGG-3'）。
   3. 向混合液中加入 0.8 µL 10 µM β-2-微球蛋白前体（B2m）引物混合物作为内参对照。B2m 内参对照的 PCR 引物为 B2 F（5'-CACCGGAGAATGGGAAGCCGAA-3'）和 B2 R（5'-TCCACACAGATGGAGCGTCCAG-3'）。
   4. 向混合液中加入 0.4 µL MyTaq DNA 聚合酶。
   5. 用手指轻弹管壁混匀混合液，离心机短暂离心 3~5 秒使液体沉至管底。
   6. 从混合液中分装 10.5 µL 至各 PCR 管中。每次分装至新管前均需轻轻混匀。
   7. 轻轻混匀后，向每根 PCR 管中加入 2 µL 基因组 DNA 模板。基因组 DNA 的制备方法如上所述。
   8. 轻弹混匀溶液，短暂离心 3~5 秒，将 PCR 管放入 PCR 仪中。
   9. PCR 程序设定为：95 °C 预变性 3 分钟；随后进行 35 个循环，每个循环包括 95 °C 变性 15 秒、65 °C 退火 15 秒、72 °C 延伸 30 秒；最后 72 °C 延伸 10 分钟。
   10. PCR 结束后，向每个样品中加入 3 µL 6x 上样染料，轻弹混匀，短暂离心 3~5 秒。
   11. PCR 产物通过 1x TAE 缓冲液中的 2%（w/v）琼脂糖凝胶电泳进行检测，Tag 和 B2m 的 PCR 产物大小分别为约 450 bp 和 300 bp。
3. tva 基因分型。
   以下方案每份样品需要 10.5 µL 试剂混合液。添加每种试剂前务必轻轻混匀。
   1. 配制混合液：5.6 µL 无核酸酶水、0.5 µL DMSO、1.25 µL AmpliTaq DNA 聚合酶 10x 缓冲液 II、1.375 µL 25 mM MgCl₂ 和 0.125 µL 25 mM dNTP。
   2. 向混合液中加入 0.125 µL 100 µM tva-3（5'-GCCCTGGGGAAGGTCCTGCCC-3'）和 0.125 µL 100 µM tva-5（5'-CTGCTGCCCGGTAACGTGACCGG-3'）。
   3. 向混合液中加入 1.275 µL 10 µM B2m 引物混合物作为内参对照。
   4. 向混合液中加入 0.125 µL AmpliTaq DNA 聚合酶。
   5. 用手指轻弹管壁混匀混合液，离心机短暂离心 3~5 秒使液体沉至管底。
   6. 从混合液中分装 10.5 µL 至各 PCR 管中。每次分装至新管前均需轻轻混匀。
   7. 轻轻混匀后，向每根 PCR 管中加入 2 µL 基因组 DNA 模板。基因组 DNA 的制备方法如上所述。
   8. 轻弹混匀溶液，短暂离心 3~5 秒，将 PCR 管放入 PCR 仪中。
   9. PCR 程序设定为：92 °C 预变性 2 分钟；随后进行 35 个循环，每个循环包括 94 °C 变性 30 秒、60 °C 退火 30 秒、72 °C 延伸 30 秒；最后 72 °C 延伸 10 分钟。
   10. PCR 结束后，向每个样品中加入 3 µL 6x 上样染料，轻弹混匀，短暂离心 3~5 秒。
   11. PCR 产物通过 1x TAE 缓冲液中的 2%（w/v）琼脂糖凝胶电泳进行检测，tva 和 B2m 的 PCR 产物大小分别为 500 bp 和 300 bp。

结果

基于RCASBP的病毒对RIP-Tag; RIP-tva肿瘤细胞的体内（in vivo）和体外（in vitro）感染率分别约为20%和80%²⁰。在RIP-Tag; RIP-tva小鼠模型中，每只小鼠约有400个胰岛，其中约4%会自然发展为肿瘤²⁰；因此每只小鼠体内均有足够数量的肿瘤细胞，可用于对病毒递送基因的潜在效应进行组织学和表型分析。利用该系统，研究人员鉴定出Bcl-xL在转移过程中的一种新的核功能⁹。感染RCASBP-Bcl-xL的RIP-Tag; RIP-tva小鼠比感染对照病毒RCASBP-ALPP的小鼠更易发生侵袭性癌（96% vs. 74%）。此外，在16周龄实施安乐死时，47%感染RCASBP-Bcl-xL的RIP-Tag; RIP-tva小鼠在胰腺淋...

讨论

在本研究中，我们描述了一种强大的小鼠模型RIP-Tag; RIP-tva，该模型可通过禽类逆转录病毒实现体细胞基因递送，用于鉴定和表征转移性因子。尽管RIP-Tag; RIP-tva小鼠会发展出胰腺神经内分泌肿瘤，但在此小鼠模型中鉴定出的转移性因子也可能促进其他类型癌症的转移。

我们的方法能够以时间可控的方式将体细胞遗传改变特异性地引入胰腺β细胞的癌前病变中，从而更真实地模拟人类散发性肿瘤的发生过程。该方法避免了传统转基因模型中因目的基因在发育过程中异位表达而对正常组织形成造成的潜在干扰。此外，与制备转基因小鼠相比，构建携带目的基因的禽类逆转录病毒载体更为快速。由RCASBP衍生的禽类逆转录病毒载体可将cDNA（≤2.5 kb）、shRNA、miRNA及其他非编码RNA递送至表达tva的细胞中 体外 和 体内感染效率（以及多重感染效率）取决于靶细胞的增殖速率和细胞的可及性。滴度为 >1 × 10⁸ 每毫升感染单位是必需的 体内 感染。可实现更高效的病毒递送

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RCASBP-Y DV 质粒	Addgene	11478
RCAS-RNAi 质粒	Addgene	15182
DMEM	Corning	10-013-CV
胎牛血清	Atlanta Biologicals	25-005-CI
L-谷氨酰胺，100倍浓度	Corning	25-005-CI
青霉素-链霉素溶液，100倍浓度	Corning	30-002-CI
PBS-/-，1倍浓度	Corning	21-040-CV
Superfect	Qiagen	301305
聚烯烃离心管	Beckman Coulter	326823
0.45 mm Nalgene 带PES膜的注射器滤器	Thermo Scientific	194-2545
胰岛素注射器	BD	329461
突触素（synaptophysin）	Vector Laboratories	VP-S284
VECTASTAIN Elite ABC HRP试剂盒（辣根过氧化物酶，兔IgG）	Vector Laboratories	PK-6101
含Buffer II的AmpliTaq DNA聚合酶	Life Technologies	N8080153
MyTaq DNA聚合酶	Bioline	BIO-21106