嗅觉感觉神经元表达多种轴突分选分子，以建立正确的神经环路。本方案描述了一种免疫组织化学染色方法，用于可视化嗅觉感觉神经元轴突末端处轴突分选分子的组合表达。
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本文内容
摘要
摘要
由于小鼠嗅觉系统具有简单的解剖结构，常被用于研究神经环路形成的机制。嗅觉感觉神经元（Olfactory Sensory Neuron, OSN）是一种双极细胞，具有单一树突和单一无分支的轴突。每个OSN仅表达一种嗅觉受体（Olfactory Receptor, OR）基因，而表达同一种OR的OSN会将其轴突投射至嗅球（Olfactory Bulb, OB）中少数几组位置恒定的嗅小球。OSN投射的一个显著特征是，所表达的OR在轴突投射过程中发挥指导性作用。OR可调控多种轴突导向分子的表达，并在OSN轴突末端产生这些轴突导向分子的组合型分子编码。因此，为了理解OR特异性轴突导向的分子机制，关键在于表征同一嗅小球内OSN轴突末端的这些分子表达谱型。本文旨在介绍在单个OB切片上尽可能收集多个嗅小球的方法，以及使用多种抗体进行免疫染色的技术，从而能够在不同OB切片间无染色差异的前提下，对轴突导向分子的表达模式进行比较与分析。
引言
在发育过程中，神经元会精确地相互连接，形成正确的神经环路，这对大脑的正常功能至关重要。由于大脑中异常的神经环路被认为是自闭症和精神分裂症等精神疾病的原因，因此解析神经环路形成的机制是神经科学领域面临的主要挑战之一。
在小鼠嗅觉系统中，嗅上皮（Olfactory Epithelium, OE）内的每个嗅觉感觉神经元（Olfactory Sensory Neuron, OSN）仅表达一种有功能的嗅觉受体（Olfactory Receptor, OR）基因，而表达相同OR的OSN会将其轴突汇聚至嗅球（Olfactory Bulb, OB）内特定且位置保守的一对小球结构1,2。小鼠嗅觉系统是研究神经环路形成分子机制的理想模型系统，因为研究人员可利用OR的表达来鉴定特定类型的OSN，并将OSN轴突的投射位点以清晰的小球结构进行可视化观察。OSN投射的一个显著特征是，OR在引导OSN轴突投射至OB的过程中发挥指令性作用3,4,5,6。更具体而言，在OSN轴突被引导至大致目标区域后，它们会以依赖于OR的方式分离并形成独立....
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方案
所有实验操作均经东京大学动物实验伦理委员会批准，并遵循东京大学关于实验动物护理和使用的指南。
1. 溶液的配制
- 配制 0.01 M 磷酸盐缓冲液（PBS）：将一片 PBS 片剂（含 0.14 M NaCl、0.0027 M KCl、0.010 M PO43-，pH 7.4）加入 1 L 蒸馏水中，在室温下搅拌至完全溶解。
- 配制 PBS 中的 4% 多聚甲醛（PFA）：将 4 g PFA 加入 100 mL PBS 中。在 60 °C 下搅拌溶液，直至完全溶解。
- PFA 在 PBS 中溶解后，用 1 N 氢氧化钠（NaOH）将溶液 pH 调至 7.4。然后在冰上冷却，并通过滤纸过滤溶液以去除任何颗粒物质。于 4 °C 保存。
注意：使用这些试剂时应采取适当防护措施。务必小心操作，在通风橱内佩戴手套、护目镜和实验服。
备注：使用新配制的 4% PFA 溶液，配制时间不超过 2 天。
- PFA 在 PBS 中溶解后，用 1 N 氢氧化钠（NaOH）将溶液 pH 调至 7.4。然后在冰上冷却，并通过滤纸过滤溶液以去除任何颗粒物质。于 4 °C 保存。
- 配制含 0.3% Triton X-100 的 0.01 M PBS（PBST）：将 3 mL Triton X-100 加入 997 mL PBS 中，在室温下搅拌至完全溶解。
- 配制 1% 和 5% 封闭液：将 10 g 脱脂奶粉加入 200 mL PBST....
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结果
嗅觉小球图谱的形成依赖于嗅觉神经元（OSN）轴突的初始全局投向以及随后的小球分离过程1,2。小球分离过程由轴突导向分子介导的黏附/排斥性轴突相互作用所调控，而这些分子的表达水平由所表达的嗅觉受体（OR）分子决定7。参与小球分离的轴突导向分子在嗅球（OB）中以位置无关的镶嵌方式表达9。在本研究中，我们选取了以下基因：Kirrel2、Sema7A、OLPC、BIG-2 和 PCDH17。其中部分轴突导向分子以神经活动依赖的方式表达7,8,10。
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讨论
对嗅球矢状切面进行四重免疫染色，可同时在更多数量的嗅小球中可视化并定量多达四种轴突分选分子的表达水平。通过主成分分析（PCA）对这些多变量数据进行分析，可推测这些分子的表达特征。
为了获得成功的染色效果，组织样本的制备至关重要。一些实验方案建议使用4%多聚甲醛（PFA）对组织进行后固定，并用30%蔗糖进行冷冻保护处理。然而，本方案中省略了这些步骤，因为在许多情况下，这些处理会降低染色信号强度并增加背景信号。此外，在任何操作步骤中均应避免切片干燥，以防止染色过程中出现高背景。
最佳染色条件因所用组织类型和抗体的不同而有所差异。因此，有必要为每个实验确定特定的染色条件。此外，一抗的浓度也至关重要。当浓度过高时，会增加背景信号；而浓度过低时，则会减弱目标信号。因此，确定合适的一抗浓度对于获得高质量的染色结果非常重要。该方法的一个局限性在于，其结果在很大程度上依赖于一抗的质量以及一抗与动物种属的匹配情况。
嗅球的冠状切片已常规用于免疫染色。然而，在本方案中，采用了嗅球内侧的旁矢状.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本工作得到了三菱基金会、武田科学基金会、日本科学技术振兴机构（JST）PRESTO 项目以及日本学术振兴会（JSPS）科学研究费补助金（编号 16H06144）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 磷酸盐缓冲液（PBS）片剂，pH 7.4 | TAKARA BIO | T9181 | |
| 脱脂奶粉 | nacalai tesque | 31149-75 | |
| 山羊抗 Sema7A 抗体 | R&D Systems | AF2068 | |
| 大鼠抗 OLPC 抗体 | Merck Millipore | MABT20 | |
| 小鼠抗 VGLUT2 抗体 | Merck Millipore | MAB5504 | |
| 山羊抗 BIG-2 抗体 | R&D Systems | AF2205 | |
| 豚鼠抗 Kirrel2 抗体 | Operon Biotechnologies | Anti-Kirrel2 抗体通过用 KLH 偶联的合成肽（644-673aa）：CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP 免疫豚鼠制备 | |
| 驴抗小鼠 Alexa Fluor 405 | Abcam | ab175658 | |
| 驴抗山羊 Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| 驴抗豚鼠 Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A21432 | |
| 驴抗大鼠 Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | |
| 多聚甲醛（PFA） | Wako | 162-16065 | |
| MAS 涂层载玻片 | MATSUNAMI | MAS-01 | |
| 镊子 | Fine Science Tools | 11253-27 | |
| Vannas 弹簧剪 | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| 解剖剪 | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| 荧光显微镜 | KEYENCE | BZ-X700 | |
| DAPI 滤光片组 | KEYENCE | OP-87762 | |
| GFP 滤光片组 | KEYENCE | OP-87763 | |
| TRITC 滤光片组 | KEYENCE | OP-87764 | |
| Cy5 滤光片组 | KEYENCE | OP-87766 | |
| 滤纸 | ADVANTEC | 00011185 | |
| O.C.T. 包埋剂 | Sakura Finetek | M71484 |
参考文献
- Mori, K., Sakano, H. How is the olfactory map formed and interpreted in the mammalian brain? Annu Rev Neurosci. 34, 467-499 (2011).
- Takeuchi, H., Sakano, H. Neural map formation in the mouse olfactory system. Cell Mol Life Sci. 71, 3049-3057 (2014). ....
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