嗅觉感觉神经元表达多种轴突分选分子，以建立正确的神经环路。本方案描述了一种免疫组织化学染色方法，用于可视化嗅觉感觉神经元轴突末端处轴突分选分子的组合表达。
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本文内容
摘要
摘要
由于小鼠嗅觉系统具有简单的解剖结构，常被用于研究神经环路形成的机制。嗅觉感觉神经元（Olfactory Sensory Neuron, OSN）是一种双极细胞，具有单一树突和单一无分支的轴突。每个OSN仅表达一种嗅觉受体（Olfactory Receptor, OR）基因，而表达同一种OR的OSN会将其轴突投射至嗅球（Olfactory Bulb, OB）中少数几组位置恒定的嗅小球。OSN投射的一个显著特征是，所表达的OR在轴突投射过程中发挥指导性作用。OR可调控多种轴突导向分子的表达，并在OSN轴突末端产生这些轴突导向分子的组合型分子编码。因此，为了理解OR特异性轴突导向的分子机制，关键在于表征同一嗅小球内OSN轴突末端的这些分子表达谱型。本文旨在介绍在单个OB切片上尽可能收集多个嗅小球的方法，以及使用多种抗体进行免疫染色的技术，从而能够在不同OB切片间无染色差异的前提下，对轴突导向分子的表达模式进行比较与分析。
引言
在发育过程中，神经元会精确地相互连接，形成正确的神经环路，这对大脑的正常功能至关重要。由于大脑中异常的神经环路被认为是自闭症和精神分裂症等精神疾病的原因，因此解析神经环路形成的机制是神经科学领域面临的主要挑战之一。
在小鼠嗅觉系统中，嗅上皮（Olfactory Epithelium, OE）内的每个嗅觉感觉神经元（Olfactory Sensory Neuron, OSN）仅表达一种有功能的嗅觉受体（Olfactory Receptor, OR）基因，而表达相同OR的OSN会将其轴突汇聚至嗅球（Olfactory Bulb, OB）内特定且位置保守的一对小球结构1,2。小鼠嗅觉系统是研究神经环路形成分子机制的理想模型系统，因为研究人员可利用OR的表达来鉴定特定类型的OSN，并将OSN轴突的投射位点以清晰的小球结构进行可视化观察。OSN投射的一个显著特征是，OR在引导OSN轴突投射至OB的过程中发挥指令性作用3,4,5,6。更具体而言，在OSN轴突被引导至大致目标区域后，它们会以依赖于OR的方式分离并形成独立的小球结构。先前的研究表明，OR分子通过调控轴突分选分子的表达来控制小球的分离过程7,8。此外，越来越多的证据表明，OR分子通过轴突分选分子的独特组合生成神经元身份编码9。因此，要理解OR依赖性小球分离的机制，必须明确OSN中轴突分选分子的表达谱型。
荧光免疫染色是可视化特定基因表达的常用方法。由于轴突分选分子的蛋白质主要定位于嗅觉感觉神经元（OSN）的轴突上，研究人员需要利用嗅球（OB）切片来表征这些分子在OSN中的表达模式。冠状切片是免疫染色中常规使用的OB切片方式。然而，这种切片方式在同一OB切片中丢失了沿前后轴的拓扑信息。因此，我们开发了一种OB内侧的旁矢状面切片方法，可在同一OB切片上尽可能多地呈现周围的小球结构。结合多种抗体的免疫染色，该切片方法能够在无嗅球切片间染色差异的情况下，实现对轴突分选分子表达模式的比较与分析。
此外，本文介绍了一种无需经PFA后固定和蔗糖处理的免疫组织化学染色方法。该方法可使研究人员获得足够高质量的染色数据，用于多变量数据分析。本文提供的方案将为研究嗅觉神经环路形成的科研人员提供一系列强大方法的详细操作步骤。
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方案
所有实验操作均经东京大学动物实验伦理委员会批准，并遵循东京大学关于实验动物护理和使用的指南。
1. 溶液的配制
- 配制 0.01 M 磷酸盐缓冲液（PBS）：将一片 PBS 片剂（含 0.14 M NaCl、0.0027 M KCl、0.010 M PO43-，pH 7.4）加入 1 L 蒸馏水中，在室温下搅拌至完全溶解。
- 配制 PBS 中的 4% 多聚甲醛（PFA）：将 4 g PFA 加入 100 mL PBS 中。在 60 °C 下搅拌溶液，直至完全溶解。
- PFA 在 PBS 中溶解后，用 1 N 氢氧化钠（NaOH）将溶液 pH 调至 7.4。然后在冰上冷却，并通过滤纸过滤溶液以去除任何颗粒物质。于 4 °C 保存。
注意：使用这些试剂时应采取适当防护措施。务必小心操作，在通风橱内佩戴手套、护目镜和实验服。
备注：使用新配制的 4% PFA 溶液，配制时间不超过 2 天。
- PFA 在 PBS 中溶解后，用 1 N 氢氧化钠（NaOH）将溶液 pH 调至 7.4。然后在冰上冷却，并通过滤纸过滤溶液以去除任何颗粒物质。于 4 °C 保存。
- 配制含 0.3% Triton X-100 的 0.01 M PBS（PBST）：将 3 mL Triton X-100 加入 997 mL PBS 中，在室温下搅拌至完全溶解。
- 配制 1% 和 5% 封闭液：将 10 g 脱脂奶粉加入 200 mL PBST 中，配制成 5% 封闭液。在室温下搅拌至完全溶解。用 PBST 将 5% 封闭液稀释 5 倍，得到 1% 封闭液。
2. 水平切面嗅球切片的制备
- 使用 1 至 2 周龄的动物。该年龄段适用于以下实验，因为此时嗅球小球结构清晰可见，且脑组织可连同颅骨进行切片。
- 通过腹腔注射戊巴比妥（50 mg/kg 体重）对动物进行麻醉。用冰预冷的含 4% 多聚甲醛（PFA）的 PBS 溶液经心脏灌注动物。操作时需小心谨慎，在通风橱内佩戴手套、护目镜和实验服。
- 灌注完成后，用剪刀剪下头部并小心去除皮肤。随后将剪刀尖插入上下牙齿之间的空隙，水平剪开以移除下颌骨。使用镊子和剪刀清除多余组织，保留包含嗅球（OB）和嗅上皮（OE）的嗅觉组织。
注意：请勿移除围绕嗅球的颅骨部分，以保持垂直排列的内侧小球结构完整。 - 将嗅觉组织浸入 PBS 中以去除鼻腔内的空气。垂直切除脑组织后部，将嗅觉组织切面朝下放置于包埋模具底部。向模具中加入最佳切割温度（O.C.T.）包埋剂，随后将模具浸入液氮中冷冻。
- 待组织在包埋剂中完全冻结后，将其置于恒冷切片机中，在 -20 °C 下孵育 1 小时。
- 使用恒冷切片机对嗅球进行连续冠状旁切片（厚度 10 µm），并将切片贴附于 MAS 防脱玻片上收集。贴片后立即用吹风机干燥玻片。
3. 第1天： OB切片的四重免疫染色
- 在室温下用 PBS 清洗载玻片 5 分钟。重复 3 次。
- 在室温下用 5% 封闭液孵育载玻片 1 小时，以封闭非特异性结合位点。
- 在室温下，用 1% 封闭液中的初级抗体混合物（每张载玻片 400 µL）孵育载玻片过夜。使用的初级抗体如下：豚鼠抗 Kirrel2 抗体（1:1000）、山羊抗 Sema7A（Semaphorin-7A）抗体（1:500）、大鼠抗 OL-protocadherin（OLPC）抗体（1:500）和小鼠抗 VGLUT2（vesicular glutamate transporter2）抗体（1:500）。
4. 第2天： OB切片的四重免疫染色
- 弃去一抗溶液，用 PBST 在室温下洗涤载玻片 5 分钟。重复 3 次。
- 在室温下用二抗混合液（每张载玻片 400 µL）孵育 1 小时。使用的二抗包括：驴抗小鼠 Alexa Fluor 405（1:400）、驴抗山羊 Alexa Fluor 488（1:400）、驴抗豚鼠 Alexa Fluor 555（1:400）和驴抗大鼠 Alexa Fluor 647（1:400）。
注意：所有二抗应来源于同一宿主物种。为确保荧光波长无重叠，每种一抗对应的二抗应选择不同的荧光波长。 - 弃去溶液，用 PBS 在室温下洗涤载玻片 5 分钟。重复 3 次。
- 用封片剂将盖玻片封固在载玻片上。操作时，在每张载玻片上滴加 2 滴封片剂，然后盖上盖玻片，并去除气泡。
5. 强度测量
- 使用荧光显微镜获取荧光图像。采用以下滤光片组：DAPI滤光片组（360/40 nm激发光，460/50 nm发射光，400 nm二向色镜）用于Alexa Fluor 405信号，GFP滤光片组（470/40 nm激发光，525/50 nm发射光，495 nm二向色镜）用于Alexa Fluor 488，TRITC滤光片组（545/25 nm激发光，605/70 nm发射光，565 nm二向色镜）用于Alexa Fluor 555，Cy5滤光片组（620/60 nm激发光，700/75 nm发射光，600 nm二向色镜）用于Alexa Fluor 647。
注意：调整曝光时间，以获得无信号饱和的荧光图像。 - 通过VGLUT2的免疫荧光信号界定肾小球结构。使用ImageJ测量肾小球内轴突分选分子的染色强度。
6. 数据分析
- 从轴突分选分子的染色强度中减去背景信号。
- 构建表达数据矩阵，其中列表示轴突分选分子，行表示肾小球。
- 利用准备好的表达数据集进行主成分分析（PCA），然后获得每个主成分的PCA得分、贡献率和因子载荷。
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结果
嗅觉小球图谱由嗅觉感觉神经元轴突的初始全局投向以及随后的小球分离过程共同形成1,2。小球分离过程受轴突排序分子介导的黏附/排斥性轴突相互作用调控，而这些分子的表达水平由所表达的嗅觉受体（OR）分子决定7。参与小球分离的轴突排序分子在嗅球（OB）中以位置无关的马赛克方式表达9。在本研究中，我们选取了以下基因：Kirrel2、Sema7A、OLPC、BIG-2 和 PCDH17。其中部分轴突排序分子以依赖神经元活动的方式表达7,8,10。
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讨论
对嗅球矢状切面进行四重免疫染色，可同时在更多数量的嗅小球中可视化并定量多达四种轴突分选分子的表达水平。通过主成分分析（PCA）对这些多变量数据进行分析，可推测这些分子的表达特征。
为了获得成功的染色效果，组织样本的制备至关重要。一些实验方案建议使用4%多聚甲醛（PFA）对组织进行后固定，并用30%蔗糖进行冷冻保护处理。然而，本方案中省略了这些步骤，因为在许多情况下，这些处理会降低染色信号强度并增加背景信号。此外，在任何操作步骤中均应避免切片干燥，以防止染色过程中出现高背景。
最佳染色条件因所用组织类型和抗体的不同而有所差异。因此，有必要为每个实验确定特定的染色条件。此外，一抗的浓度也至关重要。当浓度过高时，会增加背景信号；而浓度过低时，则会减弱目标信号。因此，确定合适的一抗浓度对于获得高质量的染色结果非常重要。该方法的一个局限性在于，其结果在很大程度上依赖于一抗的质量以及一抗与动物种属的匹配情况。
嗅球的冠状切片已常规用于免疫染色。然而，在本方案中，采用了嗅球内侧的旁矢状...
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本工作得到了三菱基金会、武田科学基金会、日本科学技术振兴机构（JST）PRESTO 项目以及日本学术振兴会（JSPS）科学研究费补助金（编号 16H06144）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 磷酸盐缓冲液（PBS）片剂，pH 7.4 | TAKARA BIO | T9181 | |
| 脱脂奶粉 | nacalai tesque | 31149-75 | |
| 山羊抗 Sema7A 抗体 | R&D Systems | AF2068 | |
| 大鼠抗 OLPC 抗体 | Merck Millipore | MABT20 | |
| 小鼠抗 VGLUT2 抗体 | Merck Millipore | MAB5504 | |
| 山羊抗 BIG-2 抗体 | R&D Systems | AF2205 | |
| 豚鼠抗 Kirrel2 抗体 | Operon Biotechnologies | Anti-Kirrel2 抗体通过用 KLH 偶联的合成肽（644-673aa）：CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP 免疫豚鼠制备 | |
| 驴抗小鼠 Alexa Fluor 405 | Abcam | ab175658 | |
| 驴抗山羊 Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| 驴抗豚鼠 Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A21432 | |
| 驴抗大鼠 Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | |
| 多聚甲醛（PFA） | Wako | 162-16065 | |
| MAS 涂层载玻片 | MATSUNAMI | MAS-01 | |
| 镊子 | Fine Science Tools | 11253-27 | |
| Vannas 弹簧剪 | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| 解剖剪 | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| 荧光显微镜 | KEYENCE | BZ-X700 | |
| DAPI 滤光片组 | KEYENCE | OP-87762 | |
| GFP 滤光片组 | KEYENCE | OP-87763 | |
| TRITC 滤光片组 | KEYENCE | OP-87764 | |
| Cy5 滤光片组 | KEYENCE | OP-87766 | |
| 滤纸 | ADVANTEC | 00011185 | |
| O.C.T. 包埋剂 | Sakura Finetek | M71484 |
参考文献
- Mori, K., Sakano, H. How is the olfactory map formed and interpreted in the mammalian brain? Annu Rev Neurosci. 34, 467-499 (2011).
- Takeuchi, H., Sakano, H. Neural map formation in the mouse olfactory system. Cell Mol Life Sci. 71, 3049-3057 (2014).
- Mombaerts, P., et al. Visualizing an olfactory sensory map. Cell. 87, 675-686 (1996).
- Feinstein, P., Mombaerts, P. A contextual model for axonal sorting into glomeruli in the mouse olfactory system. Cell. 117, 817-831 (2004).
- Ishii, T., et al. Monoallelic expression of the odourant receptor gene and axonal projection of olfactory sensory neurones. Genes Cell. 6, 71-78 (2001).
- Nakashima, A., et al. Agonist-independent GPCR activity regulates anterior-posterior targeting of olfactory sensory neurons. Cell. 154, 1314-1325 (2013).
- Serizawa, S., et al. A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting. Cell. 127, 1057-1069 (2006).
- Kaneko-Goto, T., Yoshihara, S., Miyazaki, H., Yoshihara, Y. BIG-2 mediates olfactory axon convergence to target glomeruli. Neuron. 57, 834-846 (2008).
- Ihara, N., Nakashima, A., Hoshina, N., Ikegaya, Y., Takeuchi, H. Differential expression of axon-sorting molecules in mouse olfactory sensory neurons. Eur J Neuro. 44, 1998-2003 (2016).
- Williams, E. O., et al. Delta Protocadherin 10 is Regulated by Activity in the Mouse Main Olfactory System. Front Neural Circuits. 5, 9(2011).
- Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17, 681-693 (1996).
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重印与许可
