嗅球的四次免疫染色用于嗅觉感觉轴突分子识别码的可视化

Summary

嗅觉神经元表达各种各样的轴突分选分子，建立适当的神经电路。该方案描述了一种免疫组织化学染色方法来观察嗅觉神经元轴突末端的轴突分选分子的组合表达。

Abstract

由于其简单的解剖结构，小鼠嗅觉系统通常用于研究神经回路形成的机制。嗅觉神经元（OSN）是具有单个枝晶和单个无分支轴突的双极细胞。 OSN仅表达一个嗅觉受体（OR）基因，表达给定类型的OR的OSN将其轴突收敛于嗅球（OB）中的几组不变的肾小球。 OSN预测的一个显着特征是表达的ORs在轴突投影中起到指导作用。 ORs调节多个轴突分选分子的表达，并在OSN轴突末端产生轴突分选分子的组合分子代码。因此，要了解OR特异性轴突引导机制的分子机制，在同一肾小球中的OSN轴突末端表征其表达谱是至关重要的。本文的目的是介绍收集尽可能多的肾小球的方法e在单个OB部分上，并使用多个抗体进行免疫染色。这将允许比较和分析轴突分选分子的表达模式，而在OB部分之间没有染色变异。

Introduction

在发育过程中，神经元彼此精确连接，形成适当的神经回路，这对正常脑功能至关重要。由于大脑中的异常神经回路被认为是自闭症和精神分裂症等精神障碍的原因，因此了解神经回路形成的机制是神经科学领域的主要挑战之一。

在小鼠嗅觉系统中，嗅觉上皮（OE）中的每个嗅觉感觉神经元（OSN）仅表达一个功能性嗅觉受体（OR）基因，并且表达相同OR的OSN在其定型位置收敛其轴突到特定的一对肾小球嗅球（OB） ^1，2 。小鼠嗅觉系统是研究神经回路形成的分子机制的优秀模型系统，因为研究人员可以利用OR表达来识别特定的sOSN的ubtype和可视化OSN轴突的投影位点作为清晰的肾小球结构。 OSN投射的一个显着特征是ORs在将OSN轴突投影到OB 3，4，5，6等方面发挥了指导作用。更具体地说，在OSN轴突被引导到近似目标区域之后，它们以OR依赖的方式被分离以形成肾小球。以前的研究表明，OR分子控制轴突分选分子的表达，调节肾小球分离^7,8 。此外，积累的证据表明OR分子通过轴突分选分子⁹的独特组合产生神经元识别码。因此，为了理解OR依赖性肾小球分离的机制，有必要表征轴突分选的表达谱OSN中的ecules。

荧光免疫染色是可视化特定基因表达的常用方法。由于轴突分选分子的蛋白质主要定位于OSN轴突，研究人员需要使用OB部分来表征其在OSN中的表达模式。 OB的冠状切片常规用于免疫染色。然而，该制剂在相同的OB部分中沿着前后轴线丢失了地形信息。因此，我们开发了OB的内侧的旁侧制剂，其可以在相同的OB部分上安装尽可能多的周围的肾小球。结合使用多种抗体的免疫染色，该制剂允许比较和分析轴突分选分子的表达模式，而在OB部分之间没有染色变异。

此外，已经提出了免疫组织化学染色方法，而不需要用PFA a进行固定nd蔗糖处理。这种方法允许研究人员获得足够高质量的染色数据进行多变量数据分析。本文介绍的方案将为研究嗅觉神经电路形成的研究人员提供有力的方法。

Protocol

所有实验程序均经东京大学动物实验伦理委员会和东京大学批准实验动物护理和使用指南进行。

1.准备解决方案

1. 准备0.01M磷酸盐缓冲盐水（PBS）:将PBS片剂（0.14M NaCl，0.0027M KCl，0.010M PO ₄ ^3- ，pH 7.4）加入到1L蒸馏水中，并在室温下搅拌直到其完全溶解。
2. 在PBS中制备4％多聚甲醛（PFA）:将4g PFA加入到100mL PBS中。将溶液在60℃下搅拌直至完全溶解。
   1. 将PFA溶解在PBS中后，用1N氢氧化钠（NaOH）将溶液的pH调节至7.4。然后，在冰上冷却并通过滤纸过滤溶液以除去任何颗粒物。储存于4°C。
      注意:使用这些试剂时，请妥善保管。处理小心使用手套，安全护目镜和化学罩下的实验室外套。
      注意:使用2 d内制备的新鲜4％PFA溶液。
3. 准备补充有0.3％Triton X-100（PBST）的0.01M PBS:加入3mL Triton X- 100至997mL PBS。在室温下搅拌该溶液直到其完全溶解。
4. 制备1％和5％封闭溶液:加入10g脱脂乳至200 mL PBST，制备5％封闭溶液。在室温下搅拌直至完全溶解。用PBST稀释5％封闭溶液5次以制备1％封闭溶液。

Parasagittal OB部分的准备

1. 使用1-2周龄的动物。这些年龄组适用于以下实验，因为肾小球清晰可见，可以用头骨切割大脑。
2. 用腹膜内注射戊巴比妥（50mg / kg体重）麻醉动物。用冰冷的4％P经皮灌注动物FA在PBS。小心处理，使用手套，安全护目镜和化学罩下的实验室外套。
3. 灌注后，用剪刀切开头部，小心地取出皮肤。然后，将剪刀刀片插入上下齿之间的空间，水平切割以去除下颚骨。用镊子和剪刀剪掉多余的组织，以留下嗅觉组织，包括OB和OE。
   注意:不要去除OB周围的头骨，因为它保留了内侧肾小球垂直排列。
4. 将嗅觉组织浸泡在PBS中以去除鼻腔中的空气。垂直切除脑后部，将嗅觉组织放置在嵌入模具的底部，切割面朝下。用最佳切割温度（OCT）复合物填充模具，然后将模具浸入液氮中。
   1. 化合物中的组织完全冷冻后，将其孵育在冷冻液中tat在-20℃下1小时。
5. 用低温恒温器制作OB的串联旁路截面（10μm），并通过粘贴到MAS涂覆的玻璃片上收集。粘贴后，立即用吹风机干燥载玻片。

第1天:OB切片的四次免疫染色

1. 在室温下用PBS洗涤载玻片5分钟。重复3次。
2. 通过在RT下用5％封闭溶液孵育载玻片1小时来阻断非特异性结合位点。
3. 在1％的封闭溶液中，将载玻片O / N与初级抗体混合（每个载玻片400μL）孵育。使用以下一抗:豚鼠抗Kirrel2抗体（1:1000），山羊抗Semaphorin-7A（Sema7A）抗体（1:500），大鼠抗OL-原螯合素（OLPC）抗体（1:500），和小鼠抗囊泡谷氨酸转运蛋白2（VGLUT2）抗体（1:500）。

4.第二天:OB的四次免疫染色片

1. 弃去一级抗体溶液，并在室温下用PBST洗涤载玻片5分钟。重复3次。
2. 在PBS中，用PBS中的二次抗体（每个载玻片400μL）混合1小时。使用以下二抗:驴抗小鼠Alexa Fluor 405（1:400），驴抗山羊Alexa Fluor 488（1:400），驴抗豚鼠Alexa Fluor 555（1:400）和驴抗 - 大鼠Alexa Fluor 647（1:400）。
   注意:所有二级抗体应来自相同的宿主物种。为每个一级抗体选择不同波长的二级抗体荧光，以确保波长不重叠。
3. 弃去溶液，并在室温下用PBS洗涤载玻片5分钟。重复3次。
4. 在载玻片上安装盖玻片与安装介质。为此，在每张幻灯片上涂2滴安装介质，然后通过去除气泡放置盖玻片。

强度我asurements

1. 用荧光显微镜获取荧光图像。使用以下过滤器立方体:对于Alexa Fluor 405信号的DAPI过滤器立方体（360/40nm激发，460/50nm发射和400nm分色镜），GFP滤光镜立方体（470/40nm激发，525/50nm发射，和用于Alexa Fluor 555的Alexa Fluor 488，TRITC滤色器立方体（545/25nm激发，605/70nm发射和565nm分色镜）和Cy5滤光器立方体（620/60nm激发，700 / 75nm发射和600nm二向色镜）用于Alexa Fluor 647。
   注意:调整曝光时间以获得图像的荧光信号而不饱和。
2. 通过VGLUT2的免疫荧光信号定义肾小球结构。用ImageJ测量肾小球内轴突分选分子的染色强度。

数据分析

1. 从轴突分选分子的染色强度中减去背景信号。
2. 准备e表达数据矩阵，其具有由轴突分选分子和由肾小球组成的行组成的列。
3. 使用准备的表达式数据集执行主成分分析（PCA）。然后，获得每个主成分的PCA分数，贡献率和因子负荷。

Results

嗅肾小球图由初始全局靶向和随后的OSN轴突^1,2的肾小球分离形成。通过由表达水平由表达的OR分子决定的轴突分选分子介导的粘附/排斥轴突相互作用调节肾小球分离⁷ 。涉及肾小球偏析的轴突分选分子在OB ⁹中以位置无关的镶嵌方式表达。在本研究中，我们选择了以下基因: Kirrel2 ， Sema7A ， OLPC ， BIG-2和PCDH17 。这些轴突分选分子中的一些以活性依赖性方式表达7,8,10。

四倍免疫这里所示的方法允许同一部分同时显示四个分子的表达模式。这些轴突分选分子显示位置无关的镶嵌表现，但它们的图案不相同（ 图1A，B ）。肾小球结构由VGLUT2的荧光信号定义（

Discussion

旁分泌OB部分的四次免疫染色使得能够在大量肾小球中同时观察和定量多达四个轴突分选分子的表达水平。通过用PCA分析这些多变量数据，可以推测这些分子表达的特征。

为了成功染色，组织样品制备至关重要。一些方案表明组织应用4％PFA后固定，并用30％蔗糖处理以进行冷冻保护。但是，在本协议中省略了这些步骤。这是因为在许多情况下，这些步骤减少染色信号强度并增加背景。此外，切片不应该在任何步骤干燥，以避免染色时的高背景。

根据所使用的组织和抗体的类型，最佳染色条件是不同的。所以是必须的y确定每个实验的具体染色条件。此外，一抗的浓度也是重要的。当浓度过高时，会增加背景。然而，当浓度太低时，会降低信号。因此，重要的是确定适当的一级抗体浓度以获得高质量的染色结果。一个限制是该方法在很大程度上取决于一级抗体和一级抗体组合相对于动物物种的质量。

OB的冠状切片已经常规用于免疫染色。然而，在该方案中，使用OB的内侧的旁侧部分能够将更多的肾小球放置在单个部分上。由于这些部分保留了沿背腹和前后轴的肾...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 片剂，pH7.4	TAKARA BIO	T9181
脱脂牛奶	nacalai tesque	31149-75
山羊抗 Sema7A 抗体	R&D Systems	AF2068
大鼠抗 OLPC 抗体	Merck Millipore	MABT20
小鼠抗 VGLUT2 抗体	Merck Millipore	MAB5504
山羊抗 BIG-2 抗体	R&D Systems	AF2205
gunea 猪抗 Kirrel2 抗体	Operon Biotechnologies		通过使用 KLH 偶联的合成肽 （644-673aa） 对豚鼠进行免疫接种来产生抗 Kirrel2 抗体： CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP
驴抗小鼠 Alexa Fluor 405	Abcam	ab175658
驴抗山羊 Alexa Fluor 488	Jackson ImmunoResearch	705-545-003
驴抗豚鼠 Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A21432
驴抗大鼠 Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	712-605-153
多聚甲醛 （PFA）	Wako	162-16065
MAS 涂层载玻片玻璃	MATSUNAMI	MAS-01
镊子	精细科学工具	11253-27
Vannas 弹簧剪刀	精细科学工具	15000-00
解剖剪刀	精细科学工具	14090-09
荧光显微镜	基恩士	BZ-X700
DAPI 滤光片立方体	基恩士	OP-87762
GFP 滤光片立方体	基恩士	OP-87763
TRITC 滤光片立方体	KEYENCE	OP-87764
Cy5 滤光片立方体	KEYENCE	OP-87766
滤纸	ADVANTEC	00011185
O.C.T 化合物	樱花 Finetek	M71484