本文展示了一种利用高分辨率谱域光学相干断层扫描（HR-SD-OCT）将基因治疗药物递送至视网膜下腔、评估其分布范围并表征光感受器活性的新方法。
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本文内容
摘要
摘要
HR-SD-OCT 被用于监测活体小鼠模型中光感受器变性的进展，评估治疗剂向视网膜下腔的递送情况，并评价其毒性和疗效 体内HR-SD-OCT 采用近红外光（800–880 nm），其光学系统专为小鼠眼球的独特光学特性设计，轴向分辨率优于 2 微米。对视网膜外层（光感受器）变性的转基因小鼠模型及对照组进行成像，以评估疾病进展。使用拉制的玻璃微针进行视网膜下注射，递送腺相关病毒（AAV）或纳米颗粒（NP）。 通过 经巩膜和经脉络膜入路。在进行校准压力注射前，需谨慎将针头定位至视网膜下腔，以将液体注入视网膜下间隙。手术过程中利用视网膜成像系统（RIS）实时监测视网膜下操作。高分辨率谱域光学相干断层扫描（HR-SD-OCT）显示，由于表达毒性突变人源视紫红质（P347S），导致进行性均匀的视网膜变性。RHOP347S) 转基因小鼠。高分辨率谱域光学相干断层扫描（HR-SD-OCT）可对所有视网膜层进行严格量化。外界核层（ONL）厚度和光感受器外节长度（OSL）的测量值与光感受器的活力、变性或挽救情况相关。RIS递送系统可实现对新生期（~P10-14）或成年小鼠视网膜下注射的实时可视化，HR-SD-OCT可立即判断递送是否成功并绘制递送区域范围。HR-SD-OCT是一种强大工具，可用于评估小鼠视网膜下手术的成功程度，并测量光感受器的活力。 体内高分辨率谱域光学相干断层扫描（HR-SD-OCT）还可用于鉴定具有均一特征的动物群组，以评估临床前基因治疗研究中视网膜变性的程度、毒性反应及治疗干预的挽救效果。
引言
研究人员正在开发针对多种视网膜及视网膜变性疾病基因疗法，希望将新型治疗手段转化为人类疾病的治疗方法1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11。时域或谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）已被用于研究特定小鼠疾病模型中外层视网膜变性的特征12,13,14。然而，高分辨率谱域光学相干断层扫描（HR-SD-OCT）尚未被广泛应用于优化小鼠模型的评估，以确定视网膜变性的速率和空间均匀性，也未充分用于基因治疗药物的临床前....
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方案
动物实验方案已通过美国纽约州西部退伍军人健康护理系统（VA WNY HCS）和纽约州立大学布法罗分校机构动物护理与使用委员会的审查和批准。动物的使用遵循视觉与眼科研究协会（ARVO）以及《赫尔辛基宣言》的规定。
1. 小鼠模型
- 确定待评估的小鼠模型，包括对照组。
注意：成像实验使用了C57BL/6(J)、hC1/hC1//mWT/mWT小鼠，这是一种部分人源化的小鼠视网膜变性模型，其基因型为野生型（WT）小鼠RHO+/+背景下纯合携带人突变RHOP347S hC1等位基因26,27；还使用了hC1 x BL/6(J)小鼠，这是一种部分人源化模型，在WT小鼠RHO+/+背景下携带单拷贝人突变RHOP347S hC1等位基因（hC1/-//mWT/mWT），通过将hC1/hC1//mWT/mWT小鼠与C57BL/6(J)小鼠杂交获得。上述常染色体显性遗传性视网膜色素变性（adRP）模型均建立在C57BL/6(J)遗传背景上。此外，还使用了一种在小鼠RHO基因敲除背景下纯合携带两个人源野生型RHO基因拷....
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结果
评估模型外层视网膜变性的存在性、发生速率及均一性
使用仪器软件提供的卡尺工具，从外丛状层（OPL）到外界膜（ELM）测量外核层（ONL）的厚度，以界定ONL的范围。研究目的是描绘部分人源化常染色体显性视网膜色素变性（adRP）小鼠模型中外层视网膜变性的进展过程。与对照组C57BL/6(J)小鼠以及表达两份突变人源视杆细胞视紫红质（RHOP347S）基因的hC1/hC1//mWT/mWT小鼠模型的可比图像显示，前者呈现正常视网膜结构，而后者则表现出严重且快速进展的视网膜变性特征。3周龄的adRP（hC1 × BL/6(J)）动物仅携带一份突变人源RHOP347S基因和两份小鼠野生型RHO基因，其ONL厚度接近正常。然而，在10周和37周时进行的随访性高分辨率谱域光学相干断层扫描（HR-SD-OCT）显示，视网膜变性在时间上呈进行性发展，在空间上具有高度均一性，导致在此期间约60%的光感受器细胞丢失，表现为ONL显著变薄。在hC1 × B.......
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讨论
HR-SD-OCT 为表征潜在的人类疾病动物模型提供了一种简便方法，以确定其在测试潜在治疗药物中的实用性。快速且可靠地表征潜在人类疾病动物模型的能力，对于治疗性药物研发过程至关重要。例如，替代基因治疗，核酶或shRNA敲低基因治疗，联合基因治疗）。HR-SD-OCT提供了一种简单、快速且非侵入性的方法，用于评估视网膜健康状况，可对几乎所有小鼠模型中的视网膜变性进展进行表征和监测。OCT图像可用于测量视网膜任意或全部各层的厚度，从而对随时间推移的外层视网膜（光感受器）变性情况，或治疗干预对变性程度及动力学进程的影响进行详细评估。HR-SD-OCT还可用于评估递送载体或材料的毒性。该技术对光感受器视网膜变性研究项目最重要的贡献在于，能够在活体动物中对ONL（外核层）进行随时间变化的精细测量。研究者可绘制视网膜变性的时间进程曲线，并从中提取时间常数，这是在同一动物模型中、在治疗时间窗内评估候选治疗手段疗效与毒性的关键第一步。此外，相较于传统的终点组织学方法，该技术能够显著节省宝贵的资源（动物和时间），使研究者在正式实验开始前即可识别动物群体中的异常个体，并剔除不符合实验标准的动物例如，成功的视网膜下输送）。.......
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披露
利益关系：MCB：无；JMS：无。本研究中使用的视网膜成像系统（RIS）23 是一种新型设备，对于任何希望在小鼠、啮齿类动物或其他小型动物中开展基因治疗递送研究的团队均具有重要应用价值。尽管作者目前就该设备无任何利益冲突需要声明，但纽约州立大学布法罗分校和退伍军人事务部拥有该知识产权的相关权益，并可能在未来寻求对该仪器进行商业化。
致谢
本材料部分基于美国退伍军人事务部（VA）退伍军人健康管理局研究与发展办公室（生物医学实验室研究与发展）资助的研究工作（VA 优秀奖 1I01BX000669）。JMS 部分受雇于 VA WNY，担任眼科主治医师-科学家；MCB 部分受雇于 VA WNY。本研究在退伍军人事务部西纽约医疗保健系统（纽约州布法罗市）进行，并获得其部分支持。文中内容不代表美国退伍军人事务部或美国政府的观点。本研究还主要获得了美国国立卫生研究院/国立眼科研究所（NIH/NEI）R01 基金 EY013433（项目负责人：JMS）、NIH/NEI R24 基金 EY016662（UB 视觉基础设施中心，项目负责人：M Slaughter，生物光子学模块负责人：JMS）、防盲研究组织（纽约州纽约市）向布法罗大学眼科系/大学提供的无限制资助，以及奥谢基金会（纽约州布法罗市）资助的支持。我们感谢 Janis Lem 博士（塔夫茨大学新英格兰医学中心，马萨诸塞州波士顿市）惠赠 hC1 转基因 RHOP347S 小鼠品系及外显子 1 敲除小鼠 RHO 模型，以及 G. Jane Farrar 博士和 Peter Humphries 博士（都柏林圣三一学院，爱尔兰）惠赠的在小鼠 RHO 外显子 2 敲除背景下杂合状态的 NHR-E 转基因模型。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| C57BL6 (J) | 杰克逊实验室 | 664 | |
| N129R- | 不适用 | 不适用 | |
| 2HRho 1T/1T | 不适用 | 不适用 | |
| Envisu R-2200 眼科光学相干断层扫描仪 (OCT) | Bioptigen | 90-R2200-U1-120. | |
| 视网膜成像系统 (RIS) | 本单位自制 | 不适用 | |
| Stemi 2000C 显微镜 | 蔡司 | 000000-1106-133 | |
| P-97 Flaming/Brown 微量移液器拉制仪 | Sutter Instrument Co | p-97 | |
| MMN-33 微型操作器 | Narishige USA | MMN-33 | |
| PLI-100 微量注射器 | 哈佛仪器公司 | 64-1736 | |
| 微量移液器支架（旋转式） | 本单位自制 | 不适用 | |
| 微量移液器储存容器 | 世界精密仪器公司 | E210 | |
| 硼硅酸盐玻璃毛细管 1.5-1.8 X 100mm | 哈佛仪器公司 | 30-0053 | |
| 2,2,2-三溴乙醇 | SIGMA Aldrich | T48402-25G | |
| 叔戊醇 | SIGMA Aldrich | 240486-100ML | |
| 硫酸阿托品眼用溶液，USP 1% | Akorn 公司 | NDC 17478-215-05 | |
| Goniovisc | BioVision 有限公司 | NDC 17238-610-15 | |
| 盐酸环戊通眼用溶液，USP 2% | Akorn 公司 | NDC 17478-097-10 | |
| 硫酸庆大霉素软膏 USP，0.1% | Perigo | NDC 45802-046-35 | |
| Systane Ultra | 爱尔康实验室公司 | 9006619-1013 | |
| 盐酸丁卡因 | 博士伦 | NDC 24208-920-64 | |
| 眼用溶液，USP 0.5% | 博士伦 | NDC 24208-920-64 | |
| DPBS | 吉比科生命技术公司 | 14190-136 | |
| 病毒制剂 | ViGene /UNC | 不适用 | |
| 金纳米棒 | NANOPARTz | D12M-850-1.75 | |
| 荧光素硫酸盐 AK-FLUOR 25% | Akorn 公司 | NDC 17478-250-20 | |
| 盖玻片 | 费希尔科技公司 | 12-548-A | |
| 镊子 | Milton | 18-825 | |
| 30 号针头 | 贝克顿·迪金森 | W11604 | |
| 注射器 | 贝克顿·迪金森 | 309659 | |
| Bioptigen 软件包 | Bioptigen | 不适用 | |
| 盐酸丙帕他卡因眼用溶液，USP 0.5% | Akorn 公司 | NDC 17478-263-12 | |
| Windows Excel | 微软 | 不适用 | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| 天平 | 梅特勒 | ||
| 剪刀 | 世界精密仪器公司 | ||
| 耳标打孔器 | Nat’l band | ||
| CL 100 光源 | 韦尔奇·艾伦 | CL100 | |
| 氮气 | 杰克逊焊接供应公司 | 不适用 | |
| 加热水浴锅 | Neslab | RTE-140 | |
| 加热板 | 本单位自制 | 不适用 | |
| 加热垫 | 辛辛那提 Sub Zero | 273 | |
| 黏土小鼠固定器 | Plast.i.clay American Art Clay 公司 | 不适用 | |
| 聚维酮碘 | MedLine | NDC53329-938-06 | |
| 棉签 | 美国健康服务公司 | Ctag | |
| 70% 乙醇 | 费希尔科技公司 | BP2818-100 | |
| 腈类手套 | VWR | 89038-272 | |
| Diagnosys ERG 彩色圆顶仪器 | Diagnosys 公司 | D125 | |
| 隐形眼镜 | 本单位自制 | 不适用 | |
| Diagnosys 软件 | Diagnosys 公司 | 不适用 | |
| Origin 6.1 软件 | OriginLab 公司 | 不适用 | |
| 参考电极 | Ocuscience | F-螺纹电极 (DTL) 24” |
参考文献
- Regus-Leidig, H., et al. In-vivo knockdown of Piccolino disrupts presynaptic ribbon morphology in mouse photoreceptor synapses. Front Cell Neurosci. 8 (259), 1-13 (2014).
- Jiang, L., Frederick, J. M., Baehr, W.
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