流感A病毒在感染小鼠模型中的研究

摘要

甲型流感病毒（IAVs）是重要的人类呼吸道病原体。为了理解IAVs的致病性并进行新型疫苗策略的临床前测试，需要采用模拟人类生理特征的动物模型。本文描述了利用小鼠感染模型评估IAV致病机制、体液免疫应答及疫苗效力的技术方法。

摘要

流感病毒在全球范围内每年导致超过50万人死亡¹，仅在美国，考虑到直接的医疗和住院费用以及因病缺勤，每年造成的经济损失达120至140亿美元²。在甲型流感病毒（IAV）研究中，动物模型对于评估病毒致病性、宿主与病原体相互作用、免疫应答以及现有或新型疫苗策略和抗病毒药物的有效性至关重要。小鼠是一种具有优势的小型动物模型，因为其免疫系统在进化上与人类相似，可从商业供应商处获得遗传背景一致的个体，存在多种品系可用于探究感染的遗传基础，且饲养成本相对较低，操作简便。为了通过呼吸道模拟人类IAV感染，需在适当的生物安全防护条件下，先对小鼠进行麻醉，再经鼻内接种具有感染性的IAV。感染后，通过每日监测小鼠的发病情况（体重减轻）和死亡率（存活率）来评估IAV的致病性。此外，还可通过检测感染小鼠上呼吸道（鼻黏膜）或下呼吸道（肺部）中的病毒复制水平来评估病毒致病性。IAV感染后的体液免疫应答可通过无创采血结合次级抗体检测方法快速评估，以检测总抗体或中和抗体的存在。本文描述了经鼻内（i.n.）途径感染小鼠并评估其致病性、体液免疫应答及保护效力的常用方法。

引言

甲型流感病毒（IAVs）属于有包膜病毒，归类于Orthomyxoviridae科³。其基因组由八条单链负链RNA分子组成³。在人类中，当新型病毒传入人群时，IAVs可引起季节性流行，并偶尔导致具有重大影响的全球大流行⁴。此外，季节性IAVs在人与人之间传播能力强且迅速，每年在全球范围内造成巨大的经济损失^2,5。IAVs感染的症状包括咳嗽、鼻塞、发热、不适、头痛、食欲减退和肌痛，但在免疫功能低下患者中，该病毒还可引发更严重的疾病⁶。事实上，世界卫生组织（WHO）估计，季节性流感病毒每年在全球导致30万至50万人死亡¹。目前，美国食品药品监督管理局（FDA）仅批准了两类用于人类流感预防和治疗的药物：神经氨酸酶（NA）抑制剂（例如，奥司他韦）和M2离子通道阻断剂（例如，金刚烷胺）；然而，耐药病毒株的出现日益令人担忧。因此，接种疫苗仍是预防人类IAVs感染的最佳医学手段。截至目前，FDA已批准三种可用于人类的流感疫苗：重组病毒血凝素（HA）蛋白疫苗、灭活流感疫苗（IIV）和减毒活流感疫苗（LAIV）^....

方案

本文所述所有动物实验方案均经罗切斯特大学医学院和牙科学院的机构动物照护与使用委员会（IACUC）以及机构生物安全委员会（IBC）批准，并符合美国国家研究委员会《实验动物照护与使用指南》22 中的建议。医学院和牙科学院的动物实验中心及实验动物医学部的设施与项目已获得国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC International）认证，并符合州法律、联邦法规以及美国国立卫生研究院（NIH）政策的要求。各机构在实施本论文所述动物实验方案时，均应遵循类似的规范要求。

1. 小型脊椎动物的使用

注意：操作小鼠时需要配备适当的个人防护装备（PPE）。最低要求包括一次性防护服、鞋套、头罩、口罩和手套。

1. 根据IACUC方案，每笼最多放置5只小鼠。遵循IACUC方案，采用两种安乐死方法（第二种必须为物理方法）处死小鼠，以确保动物死亡。
   注意：在评估流感病毒（IAV）致病性和死亡率的实验中，体重下降达到初始体重20%的小鼠被视为已达到实验终点，应使用CO₂安乐死后，再以颈椎脱位作为物理性二次确认方法。该体重下降百分比在其他机构可能有所不同。在需要采集小鼠肺组织和鼻黏膜以进行IAV感染后分析的实验中，小鼠通过腹腔注射致死剂量的2,2,2-三溴乙醇（TBE）实施安乐死，并以切断肝静脉作为物理性二次确认方法。实验所用6至8周龄雌性C57BL/6小鼠购自供应商，并饲养于罗切斯特大学医学....

结果

小鼠中病毒致病机制的表征

流感病毒（IAV）的致病机制与其感染引起的发病率和死亡率相关。这两个参数可在小鼠中轻松评估：IAV的发病率与感染小鼠的体重下降相关，而存活率百分比则反映死亡率（图1）。通常在感染后至少两周内每天监测IAV感染小鼠的体重变化和存活情况^8,9,10,29。所获得的存活数据可用于确定采用Reed和Muench方法计算的半数致死剂量（MLD₅₀）²⁵。另一个与IAV致病性相关的指标是病毒在下呼吸道（肺）和上呼吸道（鼻黏膜）的复制情况（

讨论

IAV 的小鼠模型被广泛用于 IAV 致病性、免疫原性和保护效力的 体内 研究。与其他动物模型（如雪貂或豚鼠）相比，小鼠体型小，易于操作和饲养。此外，由于其动物成本低、饲养方便且繁殖能力强，适合用于需要大量动物的临床前疫苗试验。值得注意的是，由于小鼠已被广泛应用于多个研究领域，目前已有多样化的分子与免疫学小鼠试剂可供使用，从而促进其在 IAV 研究中的应用。此外，小鼠宿主变异程度低，且其免疫系统在进化上与人类免疫系统具有相似性，使其成为研究 IAV 的可靠小型动物模型。最后，通过使用基因敲除（KO）小鼠，目前可实现对宿主-病毒蛋白相互作用及其在病毒致病过程中作用的研究。然而，尽管小鼠在 IAV 研究中具有多种优势，却不适用于 IAV 传播研究。因此，雪貂或豚鼠是研究 IAV 传播更为合适的动物模型。感染 IAV 的小鼠通常在感染后 2 至 3 天出现临床症状，但具体时间可能因小鼠年龄、免疫状态、性别、遗传背景和品系，以及所用病毒株和剂量的不同而有所差异。症状包括厌食、嗜睡、蜷缩、毛发竖立、体重下降和死亡^{16,17<.......}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Madin-Darby 犬肾（MDCK）上皮细胞	ATCC	CCL-34
6至8周龄雌性C57BL/6小鼠	美国国家癌症研究所（NCI）	01XBE
火鸡红细胞	Biolink 公司		4°C 保存 °C
杜尔贝科’s 改良的 Eagle’DMEM培养基	Corning Cellgro	15-013-CV	4°C 保存 °C
胎牛血清（FBS）	Seradigm	1500-050	储存于 -20 °C
青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺（PSG）100倍浓缩液	康宁	30-009-CI	-20℃保存 °C
青霉素/链霉素（PS）100倍浓缩液	康宁	30-00-CI	-20℃保存 °C
牛血清白蛋白溶液（BA）	Sigma-Aldrich	A7409	4°C 下保存 °C
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A9647	4°C 保存 °C
经甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK）处理的胰蛋白酶	Sigma-Aldrich	T8802	-20℃保存 °C
10% 中性缓冲福尔马林	EMD	65346-85	室温保存
Triton X-100	J.T.Baker	X198-07	室温保存
单克隆抗体抗甲型流感病毒NP HB-65	ATTC	H16-L10-4R5	-20℃保存 °C
多克隆兔抗小鼠免疫球蛋白/FITC	Dako	F0261	4°C 下保存 °C
ECL 抗小鼠 IgG，辣根过氧化物酶标记的完整抗体	GE Healthcare	LNA931V/AG	4°C 保存 °C
TMB底物试剂盒	BioLegend	421101	4°C 下保存 °C
Vmax 动力学酶标仪	Molecular Devices
邓斯组织研磨器	Thomas Scientific	7722-7
受体破坏酶，RDE（II）	Denka Seiken Co.	370013	-20℃保存 °C
结晶紫	Fisher Scientific	C581-100	室温保存
96孔细胞培养板	Greiner Bio-one	655-180
100 mm 细胞培养皿	Greiner Bio-one	664-160
Nunc MicroWell 96孔微孔板	赛默飞世尔科技	269620
Nunc 96孔聚苯乙烯锥底微孔板	赛默飞世尔科技	249570
Puralub Vet 软膏	德克拉	9N-76855
荧光显微镜	Olympus	奥林巴斯 IX81