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方法文章

流感A病毒在感染小鼠模型中的研究

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DOI：

10.3791/55898

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2017年9月7日

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester School of Medicine and Dentistry

本文内容

摘要

甲型流感病毒（IAVs）是重要的人类呼吸道病原体。为了理解IAVs的致病性并进行新型疫苗策略的临床前测试，需要采用模拟人类生理特征的动物模型。本文描述了利用小鼠感染模型评估IAV致病机制、体液免疫应答及疫苗效力的技术方法。

摘要

流感病毒在全球范围内每年导致超过50万人死亡1，仅在美国，考虑到直接的医疗和住院费用以及因病缺勤，每年造成的经济损失达120至140亿美元2。在甲型流感病毒（IAV）研究中，动物模型对于评估病毒致病性、宿主与病原体相互作用、免疫应答以及现有或新型疫苗策略和抗病毒药物的有效性至关重要。小鼠是一种具有优势的小型动物模型，因为其免疫系统在进化上与人类相似，可从商业供应商处获得遗传背景一致的个体，存在多种品系可用于探究感染的遗传基础，且饲养成本相对较低，操作简便。为了通过呼吸道模拟人类IAV感染，需在适当的生物安全防护条件下，先对小鼠进行麻醉，再经鼻内接种具有感染性的IAV。感染后，通过每日监测小鼠的发病情况（体重减轻）和死亡率（存活率）来评估IAV的致病性。此外，还可通过检测感染小鼠上呼吸道（鼻黏膜）或下呼吸道（肺部）中的病毒复制水平来评估病毒致病性。IAV感染后的体液免疫应答可通过无创采血结合次级抗体检测方法快速评估，以检测总抗体或中和抗体的存在。本文描述了经鼻内（i.n.）途径感染小鼠并评估其致病性、体液免疫应答及保护效力的常用方法。

引言

甲型流感病毒（IAVs）属于有包膜病毒，归类于Orthomyxoviridae科3。其基因组由八条单链负链RNA分子组成3。在人类中，当新型病毒传入人群时，IAVs可引起季节性流行，并偶尔导致具有重大影响的全球大流行4。此外，季节性IAVs在人与人之间传播能力强且迅速，每年在全球范围内造成巨大的经济损失2,5。IAVs感染的症状包括咳嗽、鼻塞、发热、不适、头痛、食欲减退和肌痛，但在免疫功能低下患者中，该病毒还可引发更严重的疾病6。事实上，世界卫生组织（WHO）估计，季节性流感病毒每年在全球导致30万至50万人死亡1。目前，美国食品药品监督管理局（FDA）仅批准了两类用于人类流感预防和治疗的药物：神经氨酸酶（NA）抑制剂（例如，奥司他韦）和M2离子通道阻断剂（例如，金刚烷胺）；然而，耐药病毒株的出现日益令人担忧。因此，接种疫苗仍是预防人类IAVs感染的最佳医学手段。截至目前，FDA已批准三种可用于人类的流感疫苗：重组病毒血凝素（HA）蛋白疫苗、灭活流感疫苗（IIV）和减毒活流感疫苗（LAIV）5,7。这三种疫苗的设计均旨在诱导针对病毒HA蛋白的适应性免疫应答，而HA蛋白是抗IAVs中和抗体的主要靶标。

一种经验证的小鼠模型用于研究甲型流感病毒感染 体内

动物模型已被用于研究流感病毒（IAV）的致病机制8,9,10,11、参与疾病发展的病毒因子12和/或病毒传播能力13,14，以及评估新型疫苗或抗病毒药物的有效性9,10,15。小鼠（Mus musculus）是目前IAV研究中应用最广泛的动物模型，原因包括：1）其免疫系统在进化上与人类的免疫系统相似；2）饲养成本低，包括购买、饲养和繁殖费用较低；3）体型小，便于操作和保存；4）宿主个体间差异小，可获得均一的反应和实验结果；5）对小鼠生物学特性已有大量研究积累，包括基因组序列信息；6）有丰富的分子生物学和/或免疫学试剂可供使用；7）存在多种基因敲除（KO）小鼠模型，可用于研究特定宿主蛋白在病毒感染中的作用；8）拥有多种不同的小鼠品系，可用于探究感染的遗传基础。

目前有多种小鼠品系可用于研究甲型流感病毒（IAV） 体内年龄、免疫状态、性别、遗传背景和小鼠品系，以及感染途径、剂量和病毒株，均会影响小鼠感染甲型流感病毒（IAV）后的结果。IAV 研究中最常用的小鼠品系为 C57BL/6、BALB/c，以及近年来更易感 IAV 疾病的 DBA.2 小鼠，其易感性高于前两种品系。16,17,18,19,20重要的是，免疫反应也可能因小鼠品系的不同而有所差异18,19,20因此，为了选择最适合待开展实验的方案，获取有关小鼠和IAV毒株的所有可用信息至关重要。

尽管小鼠是感染研究的良好动物模型 体内 在使用小鼠进行甲型流感病毒（IAV）研究时，存在若干局限性，这些局限性在实验设计中需要予以考虑。例如，使用小鼠的一个主要局限性在于 体内 研究的一个问题是，IAVs 在小鼠之间不会传播。因此，对于传播研究，更被接受的动物模型（例如，雪貂或豚鼠）被使用16,17,21此外，小鼠与人类感染甲型流感病毒（IAV）后的表现存在若干差异。与人类不同，小鼠在感染IAV后不会出现发热，反而表现为体温过低。16,17在小鼠中，甲型流感病毒（IAV）的复制主要集中于下呼吸道（肺部），而非上呼吸道。因此，IAV在小鼠中的毒力并不总是与在人类中的表现相关。总体而言，由于优势超过局限性，小鼠成为评估流感病毒致病机制、免疫原性以及疫苗和抗病毒药物保护效果的首选动物模型。此外，在缺乏小动物模型中IAV感染的前期证据时，使用大型动物模型开展IAV相关研究在伦理上是不可接受的。本文中，我们描述了如何通过鼻内途径（i.n.）感染小鼠，如何监测病毒感染的严重程度和进展过程，以及如何开展评估体液免疫反应和保护效力所需的实验。

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方案

本文所述所有动物实验方案均经罗切斯特大学医学院和牙科学院的机构动物照护与使用委员会（IACUC）以及机构生物安全委员会（IBC）批准，并符合美国国家研究委员会《实验动物照护与使用指南》22 中的建议。医学院和牙科学院的动物实验中心及实验动物医学部的设施与项目已获得国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC International）认证，并符合州法律、联邦法规以及美国国立卫生研究院（NIH）政策的要求。各机构在实施本论文所述动物实验方案时，均应遵循类似的规范要求。

1. 小型脊椎动物的使用

注意：操作小鼠时需要配备适当的个人防护装备（PPE）。最低要求包括一次性防护服、鞋套、头罩、口罩和手套。

  1. 根据IACUC方案，每笼最多放置5只小鼠。遵循IACUC方案，采用两种安乐死方法（第二种必须为物理方法）处死小鼠，以确保动物死亡。
    注意：在评估流感病毒（IAV）致病性和死亡率的实验中，体重下降达到初始体重20%的小鼠被视为已达到实验终点，应使用CO2安乐死后，再以颈椎脱位作为物理性二次确认方法。该体重下降百分比在其他机构可能有所不同。在需要采集小鼠肺组织和鼻黏膜以进行IAV感染后分析的实验中，小鼠通过腹腔注射致死剂量的2,2,2-三溴乙醇（TBE）实施安乐死，并以切断肝静脉作为物理性二次确认方法。实验所用6至8周龄雌性C57BL/6小鼠购自供应商，并饲养于罗切斯特大学医学院和牙科学院动物实验中心，在特定无病原体条件下维持饲养。

2. 生物安全

注意：本报告中用于感染小鼠的流感病毒（IAVs）为常用的适应小鼠的实验室毒株甲型流感病毒 A/Puerto Rico/8/34 H1N1（PR8 WT）22,23 以及一种温度敏感型LAIV变异株PR8 LAIV8. 进行所有涉及IAV感染的操作（体外 或 体内），细胞培养物和生物样本，均须在生物安全二级（BSL-2）条件下于生物安全柜中操作。若使用高致病性IAV毒株，应采用其他BSL防护服或相应的 containment 条件。

  1. 在执行本文所述所有实验操作前后，使用二氧化氯消毒剂清洁生物安全柜。根据机构生物安全委员会（IBC）的正确建议，在使用前后对所有解剖器械（剪刀、手术刀和解剖镊）以及Dounce匀浆器进行灭菌处理。按照机构生物安全委员会（IBC）和机构动物护理与使用委员会（IACUC）的正确指南，丢弃实验过程中产生的所有材料。

3. 鼻腔感染

  1. 将6至8周龄的雌性C57BL/6小鼠置于特定病原体阴性环境中。根据所使用的病毒及剂量对小鼠笼具进行整理并标记。使用耳缘打孔编码或其他经批准的方法（如尾部涂色）对每笼小鼠进行个体标识。每笼最多放置5只小鼠。
  2. 在无菌条件下，将IAV（荧光形成单位（FFU）/小鼠）稀释至指定总体积 30 µL/mouse，置于冰上。使用以下公式计算病毒稀释液中需加入的IAV量：（每只小鼠X个FFU / 30 µL）× 最终体积）/ 病毒原液滴度。
  3. 使用天平称量小鼠，并记录每只小鼠的体重（第0天）。用食指和拇指捏住小鼠颈背部皮肤，将其固定于背位。用小指将尾巴压在手上以固定。
  4. 通过将针头插入小鼠腹部右侧后2/3区域，以每千克体重240–250 mg的剂量腹腔注射（i.p.）TBE麻醉小鼠。拔针前短暂停留片刻。将小鼠放回笼中，等待5分钟。
  5. 将无菌眼膏涂抹于小鼠眼部，以防止麻醉期间眼睛干涩。通过检查足底回缩反射是否消失来确认小鼠是否已进入麻醉状态。即，脚趾挤压）。如果小鼠未完全麻醉，可能会咳出病毒。
  6. 当小鼠完全麻醉后，将其置于仰卧位。将含有移液器吸头的 30 µL 将病毒接种液滴入小鼠鼻孔，并缓慢而持续地推出溶液。通过观察接种液滴消失来确认小鼠正在吸入该制剂。
  7. 检查小鼠是否正常呼吸，因为TBE可能抑制体温和呼吸频率。将动物放回笼中，使其呈仰卧位。监测小鼠是否有呼吸困难的迹象，若发现异常，应将小鼠垂直握住，通过撞击诱导呼吸24监测小鼠直至其恢复意识（麻醉后30 - 45分钟）。

4. 病毒致病性的表征（图1）

  1. 发病率与死亡率评估（图1 和 图2)
    1. 通过鼻内感染3至4组雌性6至8周龄C57BL/6小鼠（每组至少5只，n = 5），分别给予10倍递增剂量（10, 102, 103 和 104 FFU/小鼠）的 PR8 WT，具体步骤见第 3 节。
    2. 在接下来的14天内，每天大致相同时间使用天平监测并称量小鼠体重，以尽量减少因进食导致的体重波动。若小鼠体重下降达到初始体重的20%，则按照第1节所述实施安乐死。
    3. 14 天后，按照第 1 节所述方法对存活的小鼠实施安乐死。
    4. 计算病毒50%小鼠致死剂量（MLD50）50根据 Reed 和 Muench 方法获得的生存数据25首先，计算比例距离（PD）：
      PD=50% 方程；死亡率分析；毒理学剂量研究示意图；MLD50 概念
      1. 接下来，计算 MLD50 通过以下公式：
        用于药物剂量计算的对数方程，公式：Log(低于MLD50的剂量) = Log(MLD50)。
  2. 肺和鼻黏膜中病毒滴度的评估（图1 和 图2)
    1. 肺和鼻黏膜的回收
      1. 通过鼻内感染6至8周龄雌性C57BL/6小鼠（n = 6），病毒接种剂量为10-104 PR8 WT 的 FFU，如第 3 节所述
      2. 在第2天（n = 3）和第4天（n = 3）采集小鼠肺组织和鼻黏膜。
        1. 以致死剂量的TBE（500 mg/kg，腹腔注射）处死小鼠。将动物置于仰卧位，用70%乙醇对胸部区域的毛发进行消毒。使用手术刀从胸骨处沿中线切开皮肤至腹部基部。用剪刀从切口基部向小鼠两侧各剪出约1 cm的切口。
        2. 用剪刀剪断肝静脉以放血，作为安乐死的辅助方法。将动物置于腹位，静置2分钟，使血液充分流出。此步骤对于减少肺部血液至关重要。
        3. 用解剖镊和剪刀从整个小鼠上部（包括头部）去除皮肤，一直剥离至腹部切口的起始位置。用剪刀剪下头部，放入无菌干燥的培养皿中。
        4. 用剪刀剪断上颌与下颌之间的连接处，并弃去下颌。用剪刀在两侧颧弓末端各做一剪切，移除颧弓。借助解剖镊子摘除眼球。
        5. 用解剖镊夹住颅骨，用手术刀沿矢状缝切开颅骨。用镊子提起带有脑组织的两半颅骨，以观察鼻黏膜。鼻黏膜周围由颅骨的前部骨骼包围，包括鼻骨、上颌骨、腭骨、颧骨和筛骨。
        6. 使用手术刀切除带有脑组织的颅骨部分并弃去。将带有鼻黏膜的另一部分颅骨置于无菌管中。将试管置于冰上保存（4 °C若样本在当天处理，则置于冰上；若稍后处理，则置于干冰上以快速冷冻。
        7. 为避免样本污染，每次采集组织及每只动物解剖之间，均须使用二氧化氯消毒剂清洁并消毒解剖工具。
        8. 将动物置于仰卧位以采集肺脏，用剪刀剪开胸膜。在胸骨两侧各1 cm处剪断肋骨，打开胸腔。使用剪刀从肋笼底部向胸部上方进行剪切。
        9. 用剪刀在肋骨上部的两个切口之间进行横向剪切，移除胸骨板。用镊子夹住肺组织，用剪刀在气管末端（靠近肺之前）剪断，将肺放入无菌管中。将试管置于冰上保存（4 °C若样本在当天处理，则按此条件操作；若稍后处理，则需置于干冰上快速冷冻。
          注意：组织样本应在采集当天进行匀浆处理，并于 -80 °C 用于后续分析病毒滴度。在测定病毒滴度前，应避免样本经历反复冻融循环。或者，可将组织样本保存于 -80 °C 直到它们被处理为止。
    2. 肺和鼻黏膜的匀浆处理
      1. 将肺组织或鼻黏膜放入无菌的Dounce匀浆器中，加入1 mL冷感染培养基。在室温（RT）下上下移动研杵约1分钟，直至肺组织完全破碎。将匀浆后的样品转移至无菌管中并储存于 4 °C每次样本使用新的Dounce匀浆器。
      2. 在室温下以 300 x g 离心 5 - 10 分钟。将上清液收集至新的无菌离心管中。将上清液保存于 4 °C 如果在同一天进行病毒滴定，则弃去沉淀。或者，将沉淀冷冻（-80 °C) 留取匀浆样品的上清液，用于后续病毒滴度的测定。
    3. 通过间接免疫荧光法进行病毒滴定
      1. 滴定前一天，将Madin-Darby犬肾（MDCK）上皮细胞以每孔4 x 10⁴个细胞的密度接种于96孔板中4细胞/孔），在组织培养基中培养至约80–90%汇合度。将细胞置于 37 °C 5% CO₂ 培养箱2病毒滴定当天，需在显微镜下检查细胞，确认形成单层后再开始病毒感染。
      2. 在96孔板中，用感染培养基将匀浆样本（肺或鼻黏膜）的上清液稀释至1:10。进行病毒滴度测定，每个样本设三个复孔，以准确测定病毒滴度。
        1. 添加 90 µL 向96孔板的每个孔中加入感染培养基。添加 10 µL 将均质化样品上清液各100 μL分别加入A1、A2和A3孔，每份样品设三个复孔，用于检测病毒滴度。加入 10 µL 将另一份均质样品的上清液分别加入 A4、A5 和 A6 孔。其余样品依次进行相同稀释。
        2. 加入样本上清液至A排后，使用多通道移液器通过反复吹打进行混匀。转移 10 µL 从 A 行到 B 行。每次稀释之间更换枪头并充分混匀。重复此操作，直至最后一行（H）。
      3. 使用真空抽吸多通道适配器从96孔板中的MDCK细胞中移除组织培养基（步骤4.2.3.1），并用PBS洗涤两次 100 µL/well 1× PBS 溶液
      4. 转移 50 µL/well 将梯度稀释的匀浆样本上清液加入含MDCK细胞的96孔板中。从高稀释度（H行）开始向低稀释度（A行）依次转移。此过程中无需在不同行之间更换枪头。
      5. 将96孔板置于室温下摇床上孵育1小时，以使病毒吸附。病毒吸附后，使用真空抽吸仪-多通道适配器移除接种物，并加入 100 µL/well 感染后培养基。将感染的细胞在37°C、5% CO₂培养箱中孵育8小时。 33 °C 或 37 °C 5% CO₂ 培养箱2继续进行固定、染色、成像和病毒滴度计算，具体步骤如4.2.3.6–4.2.3.12所述。
      6. 使用真空吸液器-多通道适配器从96孔板中移除细胞培养基。用固定剂和通透剂处理细胞以固定并通透细胞 100 µL/well 室温下用固定/透化溶液处理 20 分钟。
        警告：使用固定/透化溶液时应在通风橱中操作，以避免接触甲醛。
      7. 使用真空抽吸多通道适配器移除固定/通透溶液，用1×PBS洗涤，并在室温下用封闭液孵育固定后的细胞1小时。将细胞置于封闭液中保存于 4 °C 或进入下一步。
      8. 移除封闭液。加入 50 µL/well 的 1 µg/mL 单克隆抗体（mAb）抗NP HB-65，用抗体稀释液稀释，37℃孵育1小时 37 °C可使用不同的抗PR8单克隆抗体或抗PR8多克隆抗体（pAb）。
      9. 同时，用抗体稀释液将异硫氰酸荧光素（FITC）标记的二抗（抗小鼠）按1:200稀释。室温下以1,700 × g离心5–10分钟。也可使用其他荧光染料标记的二抗。
      10. 除去一抗，用缓冲液洗涤3次 100 µL/well 1× PBS。加入 50 µL/well 二抗稀释液中孵育30 - 45分钟 37 °C. 去除二抗，用缓冲液洗涤3次 100 µL/well 加入1×PBS，最后一次洗涤后将液体留在孔板中。
      11. 在荧光显微镜下观察细胞，确定呈阳性染色（绿色）的细胞数量。通过计数每毫升蚀斑形成单位（FFU/mL）计算病毒滴度。使用含有30–50个阳性染色细胞的稀释液，根据公式：((n1 + n2 + n3) / 3) × 20 × 1/稀释倍数，计算以FFU/mL表示的病毒滴度。

5. 体液免疫应答的评估（图3）

  1. 通过鼻内感染3组雌性6至8周龄C57BL/6小鼠（每组n = 5），分别给予不同剂量（102, 103，和104 每只小鼠接种 PR8 LAIV 病毒剂量为 FFU/小鼠，并设一组（n = 5）以 1×无菌 PBS 进行模拟感染作为阴性对照。按照第 3 节所述方法进行小鼠经鼻感染。
    1. 小鼠下颌下穿刺采血
      1. 免疫后14天，使用4 mm采血针通过下颌下出血法采集小鼠血液26，或采用其他经IACUC批准的方法。
        1. 用食指和拇指捏住小鼠颈背部的皮肤以固定小鼠，同时用小指将尾巴压在手掌上，以限制其活动。
        2. 将小鼠置于侧卧位以暴露面颊。在眶后静脉与下颌静脉汇入颈静脉的交界处进行穿刺。插入4 mm采血针，并用无菌试管收集血液（每只小鼠可采集约0.2–0.4 mL）。用无菌纱布对穿刺部位按压数秒钟。将小鼠放回笼中。
      2. 将试管放置1 - 2小时 37 °C 然后在室温下以700 × g离心30分钟，以分离血清与血液。用移液器将含有血清的上层液体转移至新的无菌管中。弃去红细胞（RBCs）沉淀。将血清储存在-20 °C.
  2. 病毒蛋白总抗体分析
    1. 感染MDCK细胞提取物的制备
      1. 感染前一天，将4 - 5 x 10⁶个细胞接种于一个100 mm培养皿中。6 MDCK 细胞（用组织培养基培养至次日达到约 80 - 90% 汇合度）。将细胞置于培养箱中 37 °C 5% CO₂ 培养箱2病毒感染当天，需在显微镜下检查细胞，以确认形成单层后方可开始病毒感染。
      2. 用感染培养基制备总终体积为 4 mL、低感染复数（MOI 0.001）的 PR8 WT 病毒稀释液。根据公式（X MOI × n°（细胞数）× 最终体积 / 病毒原液滴度
      3. 吸弃 MDCK 细胞培养板中的组织培养基，用 4 mL 1× PBS 洗涤两次。加入病毒接种物（4 mL），将培养板置于室温下的摇床上孵育 1 小时，以促进病毒吸附。用真空泵吸除病毒接种物，随后加入 8–10 mL 含有 1 µg/mL TPCK处理的胰蛋白酶。将感染的细胞在37°C、5% CO2培养箱中孵育48–72小时。 33 °C 或 37 °C 5% CO₂ 培养箱2.
      4. 使用细胞刮刀将细胞刮下，并用移液器将细胞和组织培养基收集至15 mL离心管中。在室温下以400 × g离心5–10分钟。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL RIPA裂解缓冲液中，转移至1.5 mL无菌离心管。冰上孵育20–30分钟。
      5. 在1,300 × g下离心20–30分钟，温度为 4 °C小心地回收上清液。将细胞提取物储存于 100 µL -80°C 分装保存20 °C.
      6. 按照酶联免疫吸附测定法（ELISA）所述方法对细胞提取物进行滴定，然后检测其中是否存在抗体9,10,11,27加入未感染的MDCK细胞提取物（按上述方法制备）作为阴性对照。
    2. ELISA（酶联免疫吸附测定）图4)
      1. 用适当稀释度的感染性MDCK细胞提取物（通常为1:200至1:1,000）在1x PBS中包被聚苯乙烯96孔板。另设一孔板以相同稀释度的模拟感染MDCK细胞提取物包被，作为阴性对照。4℃过夜孵育（O/N） 4 °C.
      2. 使用真空抽吸仪-多通道适配器去除上清液，并用 100 µL/well 用多通道移液器加入1× PBS。通过添加试剂阻断非特异性结合 100 µL/well 室温下用封闭液孵育1小时。
      3. 同时，在96孔板中，用抗体稀释液对步骤5.1中每只感染小鼠的血清进行2倍系列稀释（起始稀释度为1:50）。
      4. 使用真空吸液多通道适配器从聚苯乙烯96孔板中移除封闭液。加入 50 µL 每只小鼠血清稀释液加入相应孔中，37°C孵育1小时 37 °C.
      5. 用真空吸液器-多通道适配器移除小鼠血清。使用多通道移液器用蒸馏水洗涤孔板3次。加入 50 µL/well 辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗小鼠二抗，用抗体稀释液按1:2,000比例稀释后孵育1小时 37 °C.
      6. 用真空抽吸多通道适配器移除二抗。使用多通道移液器用蒸馏水洗涤孔板3次。通过将溶液A与溶液B按1:1比例混合配制四甲基联苯胺（TMB）底物溶液。加入 100 µL/well 加入底物，于室温避光孵育5 - 10分钟。
      7. 通过添加终止反应 100 µL/well 0.2 N H2SO4在酶标仪上于450 nm处读取吸光度。
      8. 从MDCK细胞感染的96孔板中测得的各稀释度数值中减去MDCK细胞模拟感染的96孔板中相应稀释度测得的数值。计算不同血清在各稀释度下的平均值，并绘制包含标准差（SD）的图表。
  3. 中和抗体分析
    1. 血凝抑制（HAI）实验（图5)
      1. 在进行血凝抑制（HAI）试验前，需用受体破坏酶（RDE）处理小鼠血清，以消除血清中存在的所有非特异性抑制物。将1体积的小鼠血清加入4体积的RDE工作稀释液中（此时血清稀释度为1:5）。于37 °C孵育过夜（12–18 h） 37 °C 水浴锅
      2. 加热血清样品 56 °C 孵育30分钟以灭活RDE。
      3. 通过标准血凝试验预先测定PR8 WT的血凝活性（HAU）28. 一旦确定病毒的 HAU，将病毒原液稀释至每 8 HAU 50 µL 在1x PBS中。
      4. 在96孔V型底板中，对经RDE处理的血清进行2倍系列稀释（共12个稀释度）。每份血清样本使用一整行例如，A1 至 A12。
        1. 添加 25 µL 从 A1 到 A12 孔加入 1x PBS。每行检测一个血清样本。添加 25 µL RDE处理的血清（1:5） 25 µL 在A1孔中加入1x PBS。第一份血清稀释度为1:10。
        2. 将所有经RDE处理的血清加入第一列后，例如，A1，B1，C1）中，使用多通道移液器通过反复吹打混匀血清与1×PBS。转移 25 µL 从第一列到第二列的稀释血清例如，从 A1 到 A2）。每次稀释之间更换枪头并混匀。
        3. 重复步骤 5.3.1.4.2，直至到达最后一列（例如，A12，B12，C12）。弃去 25 µL 从最后一列开始，保持所有孔中的体积一致（25 µL）。包含一排仅含 25 µL 以不含任何血清的1×PBS作为阴性对照。
      5. 添加 25 µL 8 HAU/的稀释IAV50 µL 向96孔V型底板中含血清的各孔分别加入；每孔终体积为 50 µL，含4 HAU病毒。用移液器反复吹打混匀内容物，在室温下孵育1小时。
      6. 添加 50 µL 加入0.5%火鸡红细胞至各孔中，通过反复吹打混匀孔内液体。将酶标板置于冰上孵育30至45分钟。当对照孔（1×PBS）中的红细胞形成红色沉淀时，肉眼观察血凝抑制（HAI）试验结果即，沉淀物位于孔底。
        注意：也可使用其他物种的红细胞，如鸡、豚鼠或马的红细胞。
      7. 通过确定红细胞形成红色沉淀且未发生血凝的最后一个孔，计算HAI滴度。
        注意：该稀释度的倒数即为血凝抑制（HAI）滴度。该倒数需乘以20的校正因子，以校正第一排血清1:20的稀释。
    2. 病毒微量中和试验（VNA）(图6)
      1. 前一日准备VNA实验时，按照步骤5.2.1.1所述，在96孔板中接种MDCK细胞，使其于次日达到80–90%汇合度。用感染培养基配制PR8 WT病毒的稀释液，使其浓度为200 FFU/25 µL.
      2. 灭活小鼠血清 56 °C 孵育1小时。使用96孔板，每份小鼠血清样品做3个复孔，进行2倍系列稀释（共12个稀释度）。
        1. 添加 40 µL 血清至 160 µL 第一行第一孔中的感染培养基，(例如，A1）（血清稀释度1:5）。用移液器吹打混匀。添加 100 µL 将感染培养基加入其他孔（A2 至 H12）。
        2. 转移 100 µL 从第一行到第二行进行1:2稀释（例如，从 A1 到 A2）。每次稀释时更换吸头，并通过移液混匀。重复此操作直至最后一行（例如，A12）。弃去 100 µL 从最后一行开始，保持所有孔中的体积一致（100 µL).
      3. 添加 100 µL 将IAV稀释液加入所有孔中，在室温下孵育1小时。与此同时，使用真空吸液多通道适配器从96孔板中的MDCK细胞中移除组织培养基，并用缓冲液洗涤两次 100 µL/well 1× PBS 溶液
      4. 在每块96孔MDCK细胞板中，预留两行用于对照。其中一行为阴性对照（不含病毒和血清的细胞），另一行为感染阳性对照（仅含病毒但不含血清，或加入来自假感染小鼠的血清）。
      5. 转移 50 µL/well 从病毒-抗体板转移到含有MDCK细胞的96孔板。将板置于摇床上，室温孵育1小时，以促进病毒吸附。
      6. 使用真空抽吸器-多通道适配器移除病毒-抗体接种液，并加入 100 µL/well 含有感染后培养基的 1 µg/mL 经TPCK处理的胰蛋白酶
      7. 将细胞孵育约 3 - 4 天 33 °C 或 37 °C 5% CO₂ 培养箱2 直到阳性对照（未加血清或加入对照血清的感染细胞）中观察到细胞病变效应（CPE）。
      8. 使用真空抽吸器-多通道适配器移除组织培养基，并加入 100 µL/well 0.1% 结晶紫溶液中孵育1小时，室温。使用真空抽滤多通道适配器移除结晶紫溶液。用蒸馏水洗涤孔板3次。室温下干燥板子。
      9. 通过确定仍能保持MDCK细胞单层汇合的最高稀释度来计算VNA滴度。
        注意：该对应稀释度的倒数即为中和抗体滴度。将该倒数乘以10的校正因子，以校正血清在每行第一孔中1:10的初始稀释倍数。

6. 疫苗保护效力的评估（图3）

  1. 对一组6至8周龄的雌性C57BL/6小鼠（n = 11）进行鼻内接种，使用待测剂量的PR8 LAIV（FFU/小鼠），同时用1x无菌PBS对另一组小鼠（n = 11）进行模拟接种。小鼠鼻内免疫操作按第3节所述方法进行。
  2. 接种后第14天，采血并收集小鼠血清，操作方法见第3节。按照第5.1.1节所述方法，检测针对PR8 WT的总抗体和中和抗体的存在情况。
  3. 接种后第15天，测量并记录小鼠体重（第0天）。随后按第3节所述方法，对小鼠进行鼻内攻击，使用致死剂量的PR8 WT病毒（同源攻击）。
  4. 攻击后连续14天监测小鼠体重变化和存活情况（每组n = 5），以评估接种小鼠在PR8 WT攻击下产生的发病程度和死亡率（见第4.1节）。
  5. 在PR8 WT攻击后第2天和第4天，分别采集小鼠肺组织和鼻黏膜组织（每天n = 3）。按照第4.2节所述方法，对肺组织和鼻黏膜进行匀浆处理并分析，以评估PR8 WT在接种小鼠体内的病毒复制水平。

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结果

小鼠中病毒致病机制的表征

流感病毒（IAV）的致病机制与其感染引起的发病率和死亡率相关。这两个参数可在小鼠中轻松评估：IAV的发病率与感染小鼠的体重下降相关，而存活率百分比则反映死亡率（图1）。通常在感染后至少两周内每天监测IAV感染小鼠的体重变化和存活情况8,9,10,29。所获得的存活数据可用于确定采用Reed和Muench方法计算的半数致死剂量（MLD50）25。另一个与IAV致病性相关的指标是病毒在下呼吸道（肺）和上呼吸道（鼻黏膜）的复制情况（

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讨论

IAV 的小鼠模型被广泛用于 IAV 致病性、免疫原性和保护效力的 体内 研究。与其他动物模型（如雪貂或豚鼠）相比，小鼠体型小，易于操作和饲养。此外，由于其动物成本低、饲养方便且繁殖能力强，适合用于需要大量动物的临床前疫苗试验。值得注意的是，由于小鼠已被广泛应用于多个研究领域，目前已有多样化的分子与免疫学小鼠试剂可供使用，从而促进其在 IAV 研究中的应用。此外，小鼠宿主变异程度低，且其免疫系统在进化上与人类免疫系统具有相似性，使其成为研究 IAV 的可靠小型动物模型。最后，通过使用基因敲除（KO）小鼠，目前可实现对宿主-病毒蛋白相互作用及其在病毒致病过程中作用的研究。然而，尽管小鼠在 IAV 研究中具有多种优势，却不适用于 IAV 传播研究。因此，雪貂或豚鼠是研究 IAV 传播更为合适的动物模型。感染 IAV 的小鼠通常在感染后 2 至 3 天出现临床症状，但具体时间可能因小鼠年龄、免疫状态、性别、遗传背景和品系，以及所用病毒株和剂量的不同而有所差异。症状包括厌食、嗜睡、蜷缩、毛发竖立、体重下降和死亡16,17<...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

LM-S 实验室的流感病毒研究部分由纽约流感卓越中心（NYICE）资助，该中心是美国国家过敏与传染病研究所流感研究与监测卓越中心（CEIRS）的成员。我们感谢 Wendy Bates 在稿件修改过程中提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Madin-Darby 犬肾（MDCK）上皮细胞ATCCCCL-34
6至8周龄雌性C57BL/6小鼠美国国家癌症研究所（NCI）01XBE
火鸡红细胞Biolink 公司4°C 保存 °C
杜尔贝科’s 改良的 Eagle’DMEM培养基Corning Cellgro15-013-CV4°C 保存 °C
胎牛血清（FBS）Seradigm1500-050储存于 -20 °C
青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺（PSG）100倍浓缩液康宁30-009-CI-20℃保存 °C
青霉素/链霉素（PS）100倍浓缩液康宁30-00-CI-20℃保存 °C
牛血清白蛋白溶液（BA）Sigma-AldrichA74094°C 下保存 °C
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-AldrichA96474°C 保存 °C
经甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK）处理的胰蛋白酶Sigma-AldrichT8802-20℃保存 °C
10% 中性缓冲福尔马林EMD65346-85室温保存
Triton X-100J.T.BakerX198-07室温保存
单克隆抗体抗甲型流感病毒NP HB-65ATTCH16-L10-4R5-20℃保存 °C
多克隆兔抗小鼠免疫球蛋白/FITCDakoF02614°C 下保存 °C
ECL 抗小鼠 IgG，辣根过氧化物酶标记的完整抗体GE HealthcareLNA931V/AG4°C 保存 °C
TMB底物试剂盒BioLegend4211014°C 下保存 °C
Vmax 动力学酶标仪Molecular Devices
邓斯组织研磨器Thomas Scientific7722-7
受体破坏酶，RDE（II）Denka Seiken Co.370013-20℃保存 °C
结晶紫Fisher ScientificC581-100室温保存
96孔细胞培养板Greiner Bio-one655-180
100 mm 细胞培养皿Greiner Bio-one664-160
Nunc MicroWell 96孔微孔板赛默飞世尔科技269620
Nunc 96孔聚苯乙烯锥底微孔板赛默飞世尔科技249570
Puralub Vet 软膏德克拉9N-76855
荧光显微镜Olympus奥林巴斯 IX81

参考文献

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