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方法文章

在 Drosophila 幼虫盘上皮中诱导与诊断肿瘤

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DOI：

10.3791/55901

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2017年7月25日

 , 
1Structural Biology Center, National Institute of Genetics and Department of Genetics, School of Life Science, SOKENDAI, 2Graduate School of Media and Governance, Keio University

本文内容

摘要

嵌合克隆分析在 果蝇 成虫盘上皮是研究肿瘤发生遗传与细胞机制的有力模型系统。本文介绍了一种在成虫盘中诱导肿瘤的实验方案 果蝇 利用GAL4-UAS系统标记翅成虫盘，并引入一种用于分类肿瘤表型的诊断方法。

摘要

在癌症早期阶段，发生转化的突变细胞表现出细胞学异常，开始不受控制地过度增殖，并逐渐破坏组织结构。 黑腹果蝇 已成为癌症生物学中研究肿瘤发生遗传和细胞机制的常用实验模型系统。特别是，用于遗传操作的工具 黑腹果蝇 幼虫中的成虫盘（幼虫期的发育上皮组织）能够在正常上皮组织中产生转化的肿瘤前体细胞，这种情况类似于人类癌症的初始阶段。最近一项关于肿瘤发生的研究所 黑腹果蝇 然而，对翅成虫盘的研究表明，肿瘤的启动依赖于组织内在的细胞结构以及局部微环境，提示在评估成虫盘中的肿瘤表型时，需考虑不同区域对致瘤刺激的易感性差异。为便于对成虫盘中肿瘤进展的表型进行分析，本文描述了一种利用GAL4-UAS系统在翅成虫盘中诱导肿瘤性肿瘤的遗传学实验方案。此外，我们还引入了一种诊断方法，用于对成虫盘上皮中诱导产生的克隆病变表型进行分类，因为此前尚未建立能够明确区分肿瘤进展不同阶段（如增生、发育不良或肿瘤性病变）的分类方法。这些方法可能广泛适用于多种器官中肿瘤表型的克隆分析 果蝇.

引言

上皮组织是高度有序的系统，具有显著的稳态能力，能够在发育和细胞更替过程中维持其结构完整性。然而，这种强大的自我组织系统在肿瘤发生过程中会逐渐被破坏。在肿瘤发生的初期，由于癌基因激活或抑癌基因失活，上皮层内会出现单个突变细胞。当这种转化的"促肿瘤细胞"逃避抑制性环境，破坏上皮组织结构并开始不受控制地增殖时，便引发肿瘤形成1。在过去的几十年中，遗传学和分子生物学领域的杰出技术进步极大地推动了癌症研究的发展。特别是近年来利用黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中的遗传镶嵌分析工具，如FLP-FRT（翻转酶重组酶/翻转酶重组靶点）有丝分裂重组系统2和翻出式GAL4-UAS（上游激活序列）系统3，显著增进了人们对肿瘤形成及转移过程中相关遗传机制的理解4,5,6。

对一组保守序列的研究 果蝇 肿瘤抑制基因 致命性巨大幼虫 (lgl), discs large (dlg），以及 涂鸦 (scrib)，强调了上皮组织结构紊乱与肿瘤发生之间的关键关系，因为这些基因在调控上皮组织细胞的顶-基底极性和细胞增殖中发挥重要作用 7。尽管 果蝇 成体盘通常为单层上皮组织，这三个基因中任何一个的纯合突变均会导致细胞失去结构和极性，无法正常分化，过度增殖，最终形成多层无定形团块，并与邻近组织融合 7同样，这些基因在哺乳动物中的失活与恶性肿瘤的发生有关 8,9突变组织所表现出的肿瘤表型使得这三个基因被归类为保守的新生肿瘤抑制基因（nTSGs）。 7,8然而，当利用FLP-FRT介导的有丝分裂重组在发育中的野生型成虫盘中零星产生纯合nTSG突变细胞时，这些突变细胞会通过依赖c-Jun氨基末端激酶（JNK）的细胞凋亡被从组织中清除 10,11,12,13,14，挤出 15,16，或被邻近细胞吞噬和胞吞 17在这些遗传嵌合上皮中，细胞凋亡主要出现在位于克隆边界处的nTSG突变细胞中，表明邻近的正常细胞会诱导nTSG突变细胞发生凋亡 10,11,12,18最近在哺乳动物细胞中的研究证实，这种依赖细胞竞争的促肿瘤细胞清除机制是一种在进化上保守的上皮细胞抗癌症自我防御机制 19,20,21,22,23.

然而，最近一项关于果蝇（Drosophila）成虫盘的研究表明，在翅成虫盘的特定区域，镶嵌型核肿瘤抑制基因（nTSG）敲低克隆可诱导形成肿瘤性肿瘤16。肿瘤的初始形成始终出现在翅盘上皮的外周“铰链”（"hinge"）区域，而从未在中央“囊区”（"pouch"）区域中观察到，这表明nTSG敲低细胞的致瘤潜能依赖于局部微环境。中央囊区发挥着“肿瘤冷区”（"tumor coldspot"）的作用，其中促肿瘤细胞不会表现出发育异常性过度增殖；而外周铰链区则表现为“肿瘤热区”（"tumor hotspot"）16。在“冷区”（"coldspot"）囊区，nTSG敲低细胞从基底侧脱离并发生凋亡。相反，由于“热区”（"hotspot"）铰链细胞在基底侧具有坚固的细胞骨架结构网络，nTSG敲低细胞则从上皮的顶端侧脱离，并启动致瘤性过度增殖16。因此，对成虫盘中肿瘤表型的分析必须仔细考虑不同区域对致瘤刺激的特异性易感性。

本文介绍了一种利用GAL4-UAS-RNAi系统在Drosophila翅成虫盘中诱导肿瘤形成的实验方案，该方法可在正常的翅成虫盘上皮组织中产生肿瘤抑制基因（nTSG）敲低的细胞。尽管此类实验体系可用于研究癌症的早期阶段，但此前尚未明确建立一套清晰的分类方法，用以评估成虫盘上皮组织中肿瘤进展的各个阶段。因此，我们还提出了一种诊断方法，将翅成虫盘上皮中诱导产生的促肿瘤克隆表型分为三类：增生（表现为形态正常的细胞数量异常增多且增殖增强）、发育不良（由形态异常细胞构成的癌前病变组织）和肿瘤形成（由形态异常且增殖模式异常的细胞组成的良性或恶性肿瘤）。

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方案

1. 果蝇杂交与克隆诱导

  1. 在收集 virgin 果蝇前 12 小时，移除小瓶中的所有果蝇。
  2. 通过注入 CO2 气体使小瓶中的果蝇麻醉，并将果蝇转移至 CO2 麻醉板上。
  3. 从 CO2 麻醉板上转移 10 - 20 只 virgin 雌蝇和 10 只雄蝇至一个新鲜小瓶中，在 25 °C 下培养 1 天。
  4. 将这些果蝇转移至一个新的小瓶中，在 25 °C 下继续培养 12 小时。
    注意：丢弃第一个小瓶，因为 virgin 雌蝇在第一天产卵量不足。
  5. 对于 enhancer-GAL4 品系，移除成年果蝇，并将小瓶在 25 °C 下继续培养至解剖阶段。
  6. 对于通过 flip-out-GAL4 诱导嵌合克隆的实验，移除成年果蝇，并将小瓶在 25 °C 下培养 2 - 4 天。热激前的培养时间取决于实验目的：在产卵后 2 天（AED）进行热激，可在未成熟的二龄幼虫成虫盘上皮中产生嵌合克隆；在产卵后 3 或 4 天进行热激，则可在已分化的早期至中期三龄幼虫成虫盘上皮中产生嵌合克隆。
    注意：重要的是要考察不同热激时间对肿瘤表型的影响。
  7. 对于通过 flip-out-GAL4 诱导嵌合克隆的实验，将小瓶浸入 37 °C 水浴中进行 10 - 45 分钟的热激处理，随后在 25 °C 下培养 2 - 3 天。
    注意：各实验中的热激时长、时机及培养时间信息详见图注。

2. 幼虫解剖

  1. 使用木棒或钝头镊子收集游走期三龄幼虫，在荧光体视显微镜下通过适当的荧光标记（例如，EGFP）鉴定其基因型，并将其放入含有PBS（磷酸盐缓冲液）的解剖皿中。
  2. 用2 mL塑料移液管吸取PBS清洗幼虫。
  3. 用一把镊子夹住幼虫中部，用另一把镊子将虫体撕成两半。
  4. 用一把镊子夹住前半段的口钩，用另一把镊子将口部推向虫体，使虫体外翻。
  5. 用镊子去除唾液腺或脂肪体等不需要的组织。

3. 固定与抗体染色

  1. 将解剖得到的幼虫体前半部分（包括翅成虫盘）转移至1.5 mL塑料离心管中，加入1 mL固定液（含4%甲醛的PBS），于室温避光、轻柔旋转条件下固定10分钟。
    注意：甲醛具有毒性并可能致癌。操作时应穿戴防护手套和防护服，避免皮肤接触。
    备注：本部分所有步骤均在室温避光条件下于旋转仪上进行，除非另有说明。
  2. 移除固定液并弃去。用1 mL PBT（含0.3% Triton X-100的PBS）洗涤组织，每次15分钟，共洗涤三次。
  3. 移除PBT，加入1 mL PBTG（含0.2%牛血清白蛋白和5%正常山羊血清的PBT）进行封闭，于室温旋转孵育1小时，或于4 °C孵育过夜。
  4. 移除PBTG，加入用PBTG适当稀释的一抗溶液（参见材料表），于4 °C旋转孵育过夜。
  5. 移除一抗溶液，用1 mL PBT洗涤组织，每次15分钟，共洗涤三次。
  6. 移除PBT，加入用PBTG适当稀释的二抗溶液（1:400）。于室温旋转孵育2小时，或于4 °C孵育过夜。
  7. 移除二抗溶液，用1 mL PBT洗涤组织，每次15分钟，共洗涤两次。
  8. 如需对F-肌动蛋白染色，移除PBT，加入用PBS适当稀释的鬼笔环肽（Phalloidin）溶液（1:40），旋转孵育20分钟。随后移除鬼笔环肽溶液，用1 mL PBT洗涤组织，每次15分钟，共洗涤两次。
  9. 如需对细胞核DNA进行复染，移除PBT，加入DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）溶液（含0.5 µg/mL DAPI的PBS），旋转孵育10分钟。
    注意：DAPI具有潜在致癌性。操作时应穿戴防护手套和防护服，避免皮肤接触。
  10. 移除DAPI溶液，用1 mL PBT洗涤组织，每次15分钟，共洗涤两次。
  11. 用1 mL PBS在室温下漂洗一次，持续10分钟。
  12. 移除PBS，加入500 µL 100%甘油作为预封片介质。

4. 载玻片封片

  1. 使用2 mL塑料移液管将染色的组织置于显微镜载玻片上。
  2. 用镊子将组织转移到另一张载玻片上的封片剂液滴中。
  3. 用一把镊子固定解剖后组织的一端，用另一把镊子轻轻剥离脑组织及眼-触角原基盘。
    注意：保留解剖得到的脑组织，并将其放置在翅成虫盘附近。脑组织可作为支撑平台，防止盖玻片压碎翅成虫盘。
  4. 为分离翅成虫盘，用一把镊子固定解剖后组织的一端，用另一把镊子轻轻刮擦体壁并撕下成虫盘。
    注意：若难以找到翅成虫盘，可从后向前剥离气管，翅成虫盘通常附着于气管上。
  5. 轻柔地用盖玻片覆盖成虫盘，并用指甲油封片；于4 °C保存。

5. 共聚焦显微镜

  1. 使用共聚焦显微镜获取共聚焦图像时，设置图像采集参数，包括发射波长范围、激光强度、增益、偏移量、扫描速度和图像尺寸24。
    注意：有关图像采集设置的详细步骤，请参考各显微镜制造商提供的使用说明书。
  2. 为获取整个翅成虫盘的单个共聚焦光学切片，使用20倍物镜。
  3. 使用40倍或60倍物镜，以0.5 - 1.0 µm的步长进行z轴堆栈扫描，获取三维图像。
    注意：为高分辨率分析细胞表型，图像尺寸应大于512 x 512像素。

6. 使用 ImageJ 进行图像分析

  1. 使用 Fiji（一种专注于生物图像分析的开源 ImageJ 软件，https://fiji.sc/）25 来获取和分析共聚焦 z 轴层析图像。
  2. 为获取垂直切面，在 ImageJ 中打开 z 轴层析图像，并选择菜单项 "Image/Stacks/Reslice"。
    注意：在 Reslice 菜单中可选择 X-Z 轴或 Y-Z 轴。也可通过在 z 轴层析图像上绘制一条直线或矩形，沿任意方向获得垂直切面。

7. 肿瘤表型的诊断

  1. 打开从一组z轴层扫图像获得的垂直切面（X-Z或Y-Z轴），分析形态学表型和抗体染色结果。
  2. 在诊断肿瘤表型时，主要关注以下三点：（1）细胞团块（包括敲低克隆）是否偏离主要上皮层；（2）该细胞团块中连接蛋白的亚细胞定位是否发生改变；（3）该细胞团块的直径是否大于4个细胞。
  3. 根据图1中描述的流程图对肿瘤表型进行分类。

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结果

通过实验诱导展示肿瘤的形成 RNA干扰介导的nTSG基因敲低 果蝇 翅成虫盘，使用了三种不同的GAL4驱动器来表达 UAS-RNAi 用于 lgl 或 scrib: (1) sd-GAL4, 在翅囊区域驱动强烈的UAS表达，在铰链区域则表达较弱（图2 和 图3A); (2) upd-GAL4, 包括背侧中褶的两个区域强表达、一个前外侧区域轻度表达以及腹侧后部区域弱表达图2 和 图3C）；以及（3）热激诱导的翻转 GAL4，可产生随机嵌合克隆并表达 UAS-基因（图4 和 图5）。在所有实验中， ...

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讨论

GAL4-UAS 系统是用于靶向基因表达的最强大的遗传工具之一 果蝇 26 并极大地促进了肿瘤细胞的诱导与分析 体内 4该系统能够在野生型上皮组织中产生携带肿瘤抑制基因敲低或癌基因过表达的克隆，这种情况与人类癌症的早期阶段高度相似，即发生转化的促肿瘤细胞被正常上皮细胞所包围。由增强子序列调控的GAL4驱动品系，例如GAL4增强子捕获品系或Janelia GAL4品系 27 具有独特且在时空上受限的表达模式。因此，这些增强子-GAL4品系可用于在成虫盘的特定区域持续诱导肿瘤形成。此外 sd-GAL4 和 upd-GAL4 本研究中，我们证实了 lgl-由其他增强子捕获型GAL4品系诱导的基因敲低包括 engrailed-GAL4 (en-GAL4), hedgehog-GAL4 (hh-GAL4), optomotor-blind...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 J. Vaughen 对手稿的审阅。本研究得到了日本学术振兴会（JSPS）科研费资助项目编号 26891025、15H01500 以及武田科学财团研究基金对 Y.T. 的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
磷酸盐缓冲液（PBS）Wako162-19321
TritonX-100Wako168-11805
甲醛和光064-00406
牛血清白蛋白SigmaA7906
正常山羊血清SigmaG6767
封片剂，VectashieldVector LaboratoriesH-1000
DAPISigmaD9542
鼠抗Dlg 4F3发育研究杂交瘤库4F3 抗 Discs large，RRID:AB_528203在 PBTG 中按 1:40 稀释
小鼠抗MMP1发育研究杂交瘤库3A6B4，RRID:AB_5797803 种抗体等量混合后，用 PBTG 以 1:40 比例稀释
鼠抗MMP1发育研究杂交瘤库3B8D12，RRID:AB_5797813 种抗体等量混合，用 PBTG 按 1:40 稀释
小鼠抗MMP1发育研究杂交瘤库5H7B11，RRID:AB_5797793 种抗体等量混合（1:1:1），用 PBTG 稀释至 1:40
鼠抗-a微管蛋白发育研究杂交瘤库AA4.3，RRID:AB_579793在 PBTG 中按 1:100 稀释
Alexa Fluor 546 鬼笔环肽分子探针A22283用 PBS 稀释，1:40
山羊抗小鼠IgG抗体，Alexa Fluor 546分子探针A11030在 PBTG 中按 1:400 稀释
名称公司目录编号评论
果蝇品系
sd-Gal4布卢明顿果蝇资源中心#8609重组于 UAS-EGFP
upd-Gal4布卢明顿果蝇品系中心#26796重组于 UAS-EGFP
UAS-lgl-RNAi维也纳果蝇RNAi中心#51247
UAS-scrib-RNAi维也纳果蝇RNAi中心#105412
UAS-RasV12布卢明顿果蝇资源中心#64196
UAS-Yki3SA布卢明顿果蝇资源中心#28817
hsFLP布卢明顿果蝇资源中心#6
步骤>CD2>GAL4（翻转-out GAL4）布卢明顿果蝇资源中心#4780重组于 UAS-EGFP
UAS-EGFP布卢明顿果蝇品系中心#5428X染色体
UAS-EGFP布卢明顿果蝇资源中心#6658第三染色体
UAS-Dicer2布卢明顿果蝇品系中心#24650第二染色体
UAS-Dicer2布卢明顿果蝇资源中心#24651第三染色体
vkg-GFPMorin 等，2001GFP蛋白捕获

参考文献

  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
  2. Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
  3. Struhl, G., Basler, K. Organizing activity of wingless protein in Drosophila. Cell. 72 (4), 527-540 (1993).
  4. Potter, C. J., Turenchalk, G. S., Xu, T. Drosophila in cancer research. An expanding role. Trends Genet. 16 (1), 33-39 (2000).
  5. Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).
  6. Tipping, M., Perrimon, N. Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis. J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2013).
  7. Bilder, D. Epithelial polarity and proliferation control: links from the Drosophila neoplastic tumor suppressors. Genes Dev. 18 (16), 1909-1925 (2004).
  8. Humbert, P. O., et al. Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module. Oncogene. 27 (55), 6888-6907 (2008).
  9. Huang, L., Muthuswamy, S. K. Polarity protein alterations in carcinoma: a focus on emerging roles for polarity regulators. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 41-50 (2010).
  10. Brumby, A. M., Richardson, H. E. scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila. EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).
  11. Igaki, T., Pastor-Pareja, J. C., Aonuma, H., Miura, M., Xu, T. Intrinsic tumor suppression and epithelial maintenance by endocytic activation of Eiger/TNF signaling in Drosophila. Dev Cell. 16 (3), 458-465 (2009).
  12. Tamori, Y., et al. Involvement of Lgl and Mahjong/VprBP in cell competition. PLoS Biol. 8 (7), e1000422(2010).
  13. Cordero, J. B., et al. Oncogenic Ras diverts a host TNF tumor suppressor activity into tumor promoter. Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).
  14. Yamamoto, M., Ohsawa, S., Kunimasa, K., Igaki, T. The ligand Sas and its receptor PTP10D drive tumour-suppressive cell competition. Nature. 542 (7640), 246-250 (2017).
  15. Vaughen, J., Igaki, T. Slit-Robo Repulsive Signaling Extrudes Tumorigenic Cells from Epithelia. Dev Cell. 39 (6), 683-695 (2016).
  16. Tamori, Y., Suzuki, E., Deng, W. -M. Epithelial Tumors Originate in Tumor Hotspots, a Tissue-Intrinsic Microenvironment. PLoS Biol. 14 (9), e1002537(2016).
  17. Ohsawa, S., et al. Elimination of oncogenic neighbors by JNK-mediated engulfment in Drosophila. Dev Cell. 20 (3), 315-328 (2011).
  18. Menéndez, J., Pérez-Garijo, A., Calleja, M., Morata, G. A tumor-suppressing mechanism in Drosophila involving cell competition and the Hippo pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14651-14656 (2010).
  19. Hogan, C., et al. Characterization of the interface between normal and transformed epithelial cells. Nat Cell Biol. 11 (4), 460-467 (2009).
  20. Kajita, M., et al. Interaction with surrounding normal epithelial cells influences signalling pathways and behaviour of Src-transformed cells. J Cell Sci. 123 (Pt 2), 171-180 (2010).
  21. Norman, M., et al. Loss of Scribble causes cell competition in mammalian cells. J Cell Sci. 125 (1), 59-66 (2012).
  22. Wagstaff, L., et al. Mechanical cell competition kills cells via induction of lethal p53 levels. Nat Commun. 7, 1-14 (2016).
  23. Kajita, M., Fujita, Y. EDAC: Epithelial defence against cancer-cell competition between normal and transformed epithelial cells in mammals. J Biochem. 158 (1), 15-23 (2015).
  24. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  27. Jory, A., et al. A survey of 6,300 genomic fragments for cis-regulatory activity in the imaginal discs of Drosophila melanogaster. Cell Rep. 2 (4), 1014-1024 (2012).
  28. McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila. Science. 302 (5651), 1765-1768 (2003).
  29. Rodrigues, A. B., et al. Activated STAT regulates growth and induces competitive interactions independently of Myc, Yorkie, Wingless and ribosome biogenesis. Development. 139 (21), 4051-4061 (2012).
  30. Khan, S. J., et al. Epithelial neoplasia in Drosophila entails switch to primitive cell states. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), E2163-E2172 (2013).
  31. Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science. 302 (5648), 1227-1231 (2003).
  32. Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).
  33. Patel, P. H., Edgar, B. A. Tissue design: how Drosophila tumors remodel their neighborhood. Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).
  34. Nakajima, Y. -I., Meyer, E. J., Kroesen, A., McKinney, S. A., Gibson, M. C. Epithelial junctions maintain tissue architecture by directing planar spindle orientation. Nature. 500 (7462), 359-362 (2013).
  35. Colombani, J., Andersen, D. S., Léopold, P. Secreted peptide Dilp8 coordinates Drosophila tissue growth with developmental timing. Science. 336 (6081), 582-585 (2012).
  36. Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation. Science. 336 (6081), 579-582 (2012).

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