嵌合克隆分析在 果蝇 成虫盘上皮是研究肿瘤发生遗传与细胞机制的有力模型系统。本文介绍了一种在成虫盘中诱导肿瘤的实验方案 果蝇 利用GAL4-UAS系统标记翅成虫盘，并引入一种用于分类肿瘤表型的诊断方法。
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本文内容
摘要
摘要
在癌症早期阶段，发生转化的突变细胞表现出细胞学异常，开始不受控制地过度增殖，并逐渐破坏组织结构。 黑腹果蝇 已成为癌症生物学中研究肿瘤发生遗传和细胞机制的常用实验模型系统。特别是，用于遗传操作的工具 黑腹果蝇 幼虫中的成虫盘（幼虫期的发育上皮组织）能够在正常上皮组织中产生转化的肿瘤前体细胞，这种情况类似于人类癌症的初始阶段。最近一项关于肿瘤发生的研究所 黑腹果蝇 然而，对翅成虫盘的研究表明，肿瘤的启动依赖于组织内在的细胞结构以及局部微环境，提示在评估成虫盘中的肿瘤表型时，需考虑不同区域对致瘤刺激的易感性差异。为便于对成虫盘中肿瘤进展的表型进行分析，本文描述了一种利用GAL4-UAS系统在翅成虫盘中诱导肿瘤性肿瘤的遗传学实验方案。此外，我们还引入了一种诊断方法，用于对成虫盘上皮中诱导产生的克隆病变表型进行分类，因为此前尚未建立能够明确区分肿瘤进展不同阶段（如增生、发育不良或肿瘤性病变）的分类方法。这些方法可能广泛适用于多种器官中肿瘤表型的克隆分析 果蝇.
引言
上皮组织是高度有序的系统，具有显著的稳态能力，能够在发育和细胞更替过程中维持其结构完整性。然而，这种强大的自我组织系统在肿瘤发生过程中会逐渐被破坏。在肿瘤发生的初期，由于癌基因激活或抑癌基因失活，上皮层内会出现单个突变细胞。当这种转化的"促肿瘤细胞"逃避抑制性环境，破坏上皮组织结构并开始不受控制地增殖时，便引发肿瘤形成1。在过去的几十年中，遗传学和分子生物学领域的杰出技术进步极大地推动了癌症研究的发展。特别是近年来利用黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中的遗传镶嵌分析工具，如FLP-FRT（翻转酶重组酶/翻转酶重组靶点）有丝分裂重组系统2和翻出式GAL4-UAS（上游激活序列）系统3，显著增进了人们对肿瘤形成及转移过程中相关遗传机制的理解4,5,6。
对一组保守序列的研究 果蝇 肿瘤抑制基因 致命性巨大幼虫 (lgl), discs large (dlg），以及 涂鸦 (scri....
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方案
1. 果蝇杂交与克隆诱导
- 在收集 virgin 果蝇前 12 小时，移除小瓶中的所有果蝇。
- 通过注入 CO2 气体使小瓶中的果蝇麻醉，并将果蝇转移至 CO2 麻醉板上。
- 从 CO2 麻醉板上转移 10 - 20 只 virgin 雌蝇和 10 只雄蝇至一个新鲜小瓶中，在 25 °C 下培养 1 天。
- 将这些果蝇转移至一个新的小瓶中，在 25 °C 下继续培养 12 小时。
注意：丢弃第一个小瓶，因为 virgin 雌蝇在第一天产卵量不足。 - 对于 enhancer-GAL4 品系，移除成年果蝇，并将小瓶在 25 °C 下继续培养至解剖阶段。
- 对于通过 flip-out-GAL4 诱导嵌合克隆的实验，移除成年果蝇，并将小瓶在 25 °C 下培养 2 - 4 天。热激前的培养时间取决于实验目的：在产卵后 2 天（AED）进行热激，可在未成熟的二龄幼虫成虫盘上皮中产生嵌合克隆；在产卵后 3 或 4 天进行热激，则可在已分化的早期至中期三龄幼虫成虫盘上皮中产生嵌合克隆。
注意：重要的是要考察不同热激时间对肿瘤表型的影响。 - 对于通过 flip-out-GAL4 诱导嵌合克隆的实验，将小瓶浸入 37 °C 水浴中进行 10 - 45 分钟的热激处理，随后在 25 °C 下培养 2 - 3 天。
注....
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结果
通过实验诱导展示肿瘤的形成 RNA干扰介导的nTSG基因敲低 果蝇 翅成虫盘，使用了三种不同的GAL4驱动器来表达 UAS-RNAi 用于 lgl 或 scrib: (1) sd-GAL4, 在翅囊区域驱动强烈的UAS表达，在铰链区域则表达较弱（图2 和 图3A); (2) upd-GAL4, 包括背侧中褶的两个区域强表达、一个前外侧区域轻度表达以及腹侧后部区域弱表达图2 和 图3C）；以及（3）热激诱导的翻转 GAL4，可产生随机嵌合克隆并表达 UAS-基因（图4 和 图5）。在所有实验中， .......
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讨论
GAL4-UAS 系统是用于靶向基因表达的最强大的遗传工具之一 果蝇 26 并极大地促进了肿瘤细胞的诱导与分析 体内 4该系统能够在野生型上皮组织中产生携带肿瘤抑制基因敲低或癌基因过表达的克隆，这种情况与人类癌症的早期阶段高度相似，即发生转化的促肿瘤细胞被正常上皮细胞所包围。由增强子序列调控的GAL4驱动品系，例如GAL4增强子捕获品系或Janelia GAL4品系 27 具有独特且在时空上受限的表达模式。因此，这些增强子-GAL4品系可用于在成虫盘的特定区域持续诱导肿瘤形成。此外 sd-GAL4 和 upd-GAL4 本研究中，我们证实了 lgl-由其他增强子捕获型GAL4品系诱导的基因敲低包括 engrailed-GAL4 (en-GAL4), hedgehog-GAL4 (hh-GAL4), optomotor-blind.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 J. Vaughen 对手稿的审阅。本研究得到了日本学术振兴会（JSPS）科研费资助项目编号 26891025、15H01500 以及武田科学财团研究基金对 Y.T. 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Wako | 162-19321 | |
| TritonX-100 | Wako | 168-11805 | |
| 甲醛 | 和光 | 064-00406 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A7906 | |
| 正常山羊血清 | Sigma | G6767 | |
| 封片剂，Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| 鼠抗Dlg 4F3 | 发育研究杂交瘤库 | 4F3 抗 Discs large，RRID:AB_528203 | 在 PBTG 中按 1:40 稀释 |
| 小鼠抗MMP1 | 发育研究杂交瘤库 | 3A6B4，RRID:AB_579780 | 3 种抗体等量混合后，用 PBTG 以 1:40 比例稀释 |
| 鼠抗MMP1 | 发育研究杂交瘤库 | 3B8D12，RRID:AB_579781 | 3 种抗体等量混合，用 PBTG 按 1:40 稀释 |
| 小鼠抗MMP1 | 发育研究杂交瘤库 | 5H7B11，RRID:AB_579779 | 3 种抗体等量混合（1:1:1），用 PBTG 稀释至 1:40 |
| 鼠抗-a微管蛋白 | 发育研究杂交瘤库 | AA4.3，RRID:AB_579793 | 在 PBTG 中按 1:100 稀释 |
| Alexa Fluor 546 鬼笔环肽 | 分子探针 | A22283 | 用 PBS 稀释，1:40 |
| 山羊抗小鼠IgG抗体，Alexa Fluor 546 | 分子探针 | A11030 | 在 PBTG 中按 1:400 稀释 |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
| 果蝇品系 | |||
| sd-Gal4 | 布卢明顿果蝇资源中心 | #8609 | 重组于 UAS-EGFP |
| upd-Gal4 | 布卢明顿果蝇品系中心 | #26796 | 重组于 UAS-EGFP |
| UAS-lgl-RNAi | 维也纳果蝇RNAi中心 | #51247 | |
| UAS-scrib-RNAi | 维也纳果蝇RNAi中心 | #105412 | |
| UAS-RasV12 | 布卢明顿果蝇资源中心 | #64196 | |
| UAS-Yki3SA | 布卢明顿果蝇资源中心 | #28817 | |
| hsFLP | 布卢明顿果蝇资源中心 | #6 | |
| 步骤>CD2>GAL4（翻转-out GAL4） | 布卢明顿果蝇资源中心 | #4780 | 重组于 UAS-EGFP |
| UAS-EGFP | 布卢明顿果蝇品系中心 | #5428 | X染色体 |
| UAS-EGFP | 布卢明顿果蝇资源中心 | #6658 | 第三染色体 |
| UAS-Dicer2 | 布卢明顿果蝇品系中心 | #24650 | 第二染色体 |
| UAS-Dicer2 | 布卢明顿果蝇资源中心 | #24651 | 第三染色体 |
| vkg-GFP | Morin 等，2001 | GFP蛋白捕获 |
参考文献
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Struhl, G., Basler, K.
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重印与许可
