从小鼠骨骼肌中分离I型和II型周细胞

摘要

本研究描述了一种基于流式细胞术（FACS）的实验方案，可简便、同时地从骨骼肌中分离出I型和II型壁细胞。

摘要

周细胞是血管周围的多能细胞，在不同器官甚至同一组织内均表现出异质性。在骨骼肌中，至少存在两种周细胞亚群（称为I型和II型），它们表达不同的分子标志物，并具有不同的分化能力。利用NG2-DsRed和Nestin-GFP双转基因小鼠，已成功分离出I型（NG2-DsRed⁺Nestin-GFP^-）和II型（NG2-DsRed⁺Nestin-GFP⁺）周细胞。然而，这类双转基因小鼠的可获得性限制了该纯化方法的广泛应用。本研究描述了一种替代性实验方案，可从骨骼肌中简便且同时地分离I型和II型周细胞。该方案采用荧光激活细胞分选技术（FACS），以PDGFRβ（而非NG2）联合Nestin-GFP信号作为分选靶标。分离后，I型和II型周细胞表现出不同的形态特征。此外，采用该新方法分离得到的I型和II型周细胞分别具有成脂和成肌分化潜能，这与从双转基因小鼠中分离的周细胞特性一致。这些结果表明，该方案可用于从骨骼肌乃至其他组织中分离周细胞亚群。

引言

肌营养不良症是一种肌肉退行性疾病，目前尚无有效治疗方法。促进组织再生的疗法开发一直备受关注。组织在受损后的再生与修复依赖于组织驻留的干细胞/祖细胞¹卫星细胞是参与肌肉再生的成肌前体细胞^2,3,4,5,6,7然而，其临床应用受到以下因素的限制：移植后细胞迁移能力有限、存活率低，以及分化能力下降 体外 扩增^8,9,10,11除了卫星细胞外，骨骼肌还含有许多其他具有成肌潜能的细胞群体^12,13,14,

方案

野生型和Nestin-GFP转基因小鼠饲养于明尼苏达大学的动物实验中心。所有实验程序均经明尼苏达大学机构动物护理和使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》的规定。

1. 肌肉解剖与单细胞分离

1. 使用三溴乙醇（250 mg/kg，腹腔注射）处死成年小鼠（6–10 周龄，雄性和雌性），并用 70% 乙醇消毒其腹部皮肤。
   注意：此处使用三溴乙醇而非氯胺酮进行麻醉/安乐死，因为已知氯胺酮会与NMDA受体相互作用，可能对研究结果产生影响。
2. 将小鼠置于仰卧位，使用手术刀在腹部皮肤上做一水平切口。用手向相反方向撕开皮肤，暴露后肢肌肉。
3. 使用镊子和剪刀采集双侧后肢肌肉，置于含1%青霉素-链霉素（P/S）的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，冰上保存。
4. 用含1%青霉素-链霉素的冰冻PBS洗涤分离的后肢肌肉两次，然后转移至无菌的10 cm培养皿中。
5. 在2倍放大倍数的解剖显微镜下，使用镊子和剪刀仔细分离肌肉中的神经、血管和结缔组织。
6. 将肌肉精细切碎成小块（1-2 mm）³使用无菌剪刀和刀片进行操作。如有必要，加入少量杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），以确保肌肉组织不被干燥。
7. 使用10 mL血清移液管反复吹打组织10次，以机械方式将其解离。
8. 加入新配制的消化液（DMEM 添加....

结果

基于未染色对照和单色对照的结果，校正FACS参数，包括激光强度和通道补偿。使用PDGFRβ-PE-FMO对照设定PDGFRβ-PE⁺细胞群的设门（图1A）。在PDGFRβ-PE^-细胞中，Nestin-GFP⁺和Nestin-GFP^-两个细胞群可被明显区分（图1A）。PDGFRβ-PE⁺Nestin-GFP⁺和PDGFRβ-PE⁺Nestin-GFP^-细胞群的设门边界根据PDGFRβ-PE⁺与Nestin-GFP⁺的设门结果确定（图1A）。这些设门边界用于从样本中定义并分选PDGFRβ-PE⁺Nestin-GFP⁺（II型周细胞）和PDG.......

讨论

周细胞是多能的血管周细胞^22,23 位于毛细血管的远腔面^21,26在骨骼肌中，周细胞能够沿脂肪生成和/或肌生成途径分化^19,20,24近期研究揭示了两种周细胞亚群，它们具有不同的标志物表达特征和独特的分化潜能^19,24,25I型（NG2）⁺Nestin^-) 周细胞具有脂肪生成潜能，而II型（NG2⁺Nestin⁺) 周细胞具有肌源性。分离这些亚群以 .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞分选仪	Sony	SH800
自动校准微珠	Sony	LE-B3001
DMEM	Gibco	11995
Avertin	Sigma	T48402
周细胞生长培养基	ScienCell	1201
MSC基础培养基（小鼠）	Stemcell Technologies	5501
成脂诱导补充剂（小鼠）	Stemcell Technologies	5503
胎牛血清	Gibco	16000
马血清	Sigma	H1270
胶原酶II型	Worthington	LS004176
0.25%胰蛋白酶/EDTA	Gibco	25200
青霉素/链霉素	Gibco	15140
多聚赖氨酸（PDL）	Sigma	P6407
PDGFRβ-PE抗体	eBioscience	12-1402
Perilipin抗体	Sigma	P1998
S-肌球蛋白抗体	DSHB	MF-20
Alexa 555-抗兔抗体	ThermoFisher Scientific	A-31572
Alexa 555-抗小鼠抗体	ThermoFisher Scientific	A-31570
含DAPI的封片剂	Vector Laboratories	H-1200
DAPI	ThermoFisher Scientific	D1306
HEPES	Gibco	15630
EDTA	Fisher	BP120
BSA	Sigma	A2058
NH4Cl	Fisher Scientific	A661
KHCO3	Fisher Scientific	P184
PBS	Gibco	14190
18 G针头	BD	305196
10 mL血清移液管	BD	357551
OneComp eBeads	eBioscience	01-1111