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方法文章

从小鼠骨骼肌中分离I型和II型周细胞

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DOI：

10.3791/55904

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2017年5月26日

 ,  , 
1College of Pharmacy, University of Minnesota

本文内容

摘要

本研究描述了一种基于流式细胞术（FACS）的实验方案，可简便、同时地从骨骼肌中分离出I型和II型壁细胞。

摘要

周细胞是血管周围的多能细胞，在不同器官甚至同一组织内均表现出异质性。在骨骼肌中，至少存在两种周细胞亚群（称为I型和II型），它们表达不同的分子标志物，并具有不同的分化能力。利用NG2-DsRed和Nestin-GFP双转基因小鼠，已成功分离出I型（NG2-DsRed+Nestin-GFP-）和II型（NG2-DsRed+Nestin-GFP+）周细胞。然而，这类双转基因小鼠的可获得性限制了该纯化方法的广泛应用。本研究描述了一种替代性实验方案，可从骨骼肌中简便且同时地分离I型和II型周细胞。该方案采用荧光激活细胞分选技术（FACS），以PDGFRβ（而非NG2）联合Nestin-GFP信号作为分选靶标。分离后，I型和II型周细胞表现出不同的形态特征。此外，采用该新方法分离得到的I型和II型周细胞分别具有成脂和成肌分化潜能，这与从双转基因小鼠中分离的周细胞特性一致。这些结果表明，该方案可用于从骨骼肌乃至其他组织中分离周细胞亚群。

引言

肌营养不良症是一种肌肉退行性疾病，目前尚无有效治疗方法。促进组织再生的疗法开发一直备受关注。组织在受损后的再生与修复依赖于组织驻留的干细胞/祖细胞1卫星细胞是参与肌肉再生的成肌前体细胞2,3,4,5,6,7然而，其临床应用受到以下因素的限制：移植后细胞迁移能力有限、存活率低，以及分化能力下降 体外 扩增8,9,10,11除了卫星细胞外，骨骼肌还含有许多其他具有成肌潜能的细胞群体12,13,14,15,16，例如血小板源性生长因子受体-β（PDGFRβ）阳性的间质细胞。有证据表明，肌肉来源的PDGFRβ+ 细胞能够分化为成肌细胞，并改善肌肉病理状态和功能14,17,18,19,20. PDGFRβ 主要标记周细胞21，即具有多向分化潜能的血管周细胞22,23除了PDGFRβ外，还有许多其他标志物（包括Neuron-Glial 2（NG2）和CD146）也用于鉴定周细胞21但需要注意的是，这些标志物中没有一种是周细胞特异性的21近期研究揭示了两种肌肉壁细胞亚型，称为I型和II型，它们表达不同的分子标志物并执行不同的功能19,24,25. 生物化学上，I型周细胞为NG2阳性+Nestin-，而II型周细胞为NG2+Nestin+19,24功能上，I型周细胞可发生脂肪生成分化，促进脂肪积聚和/或纤维化，而II型周细胞则可沿肌源性通路分化，参与肌肉再生。19,24,25这些结果表明：（1）I型周细胞可作为脂肪变性类疾病/纤维化的治疗靶点，（2）II型周细胞在肌营养不良症的治疗中具有巨大的应用潜力。对这两类细胞群体的进一步研究与特征鉴定，需要一种能够以高纯度分离I型和II型周细胞的分离方案。

目前，周细胞亚群的分离依赖于NG2-DsRed和Nestin-GFP双转基因小鼠19,24。由于NG2-DsRed小鼠的可获得性以及大多数NG2抗体的质量限制，该方法的广泛应用受到制约。鉴于在骨骼肌中所有NG2+周细胞均表达PDGFRβ19,20,24，我们假设PDGFRβ可替代NG2用于周细胞及其亚群的分离。本研究描述了一种基于流式细胞术（FACS）的方案，该方案结合PDGFRβ染色与Nestin-GFP信号。该方法对研究人员的要求较低，原因如下：（1）无需使用NG2-DsRed转基因背景小鼠；（2）所用PDGFRβ抗体为商业化产品，且已有充分表征。此外，该方法能够以高纯度同时分离I型和II型周细胞，从而为进一步研究这些周细胞亚群的生物学特性及其治疗潜力提供了可能。分离后的细胞可在体外培养，并观察其形态。本研究还表明，采用该方法分离得到的I型和II型周细胞分别具有成脂和成肌潜能，这与从双转基因小鼠中纯化的周细胞特性一致。

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方案

野生型和Nestin-GFP转基因小鼠饲养于明尼苏达大学的动物实验中心。所有实验程序均经明尼苏达大学机构动物护理和使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》的规定。

1. 肌肉解剖与单细胞分离

  1. 使用三溴乙醇（250 mg/kg，腹腔注射）处死成年小鼠（6–10 周龄，雄性和雌性），并用 70% 乙醇消毒其腹部皮肤。
    注意：此处使用三溴乙醇而非氯胺酮进行麻醉/安乐死，因为已知氯胺酮会与NMDA受体相互作用，可能对研究结果产生影响。
  2. 将小鼠置于仰卧位，使用手术刀在腹部皮肤上做一水平切口。用手向相反方向撕开皮肤，暴露后肢肌肉。
  3. 使用镊子和剪刀采集双侧后肢肌肉，置于含1%青霉素-链霉素（P/S）的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，冰上保存。
  4. 用含1%青霉素-链霉素的冰冻PBS洗涤分离的后肢肌肉两次，然后转移至无菌的10 cm培养皿中。
  5. 在2倍放大倍数的解剖显微镜下，使用镊子和剪刀仔细分离肌肉中的神经、血管和结缔组织。
  6. 将肌肉精细切碎成小块（1-2 mm）3使用无菌剪刀和刀片进行操作。如有必要，加入少量杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），以确保肌肉组织不被干燥。
  7. 使用10 mL血清移液管反复吹打组织10次，以机械方式将其解离。
  8. 加入新配制的消化液（DMEM 添加 0.2% II 型胶原酶）至混合物中。在 37 °C 下孵育 2 小时，同时以 35 转/分钟轻轻振荡。
  9. 使用18号针头吹打以混匀混合物。随后在500 × g离心5分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于0.25%胰蛋白酶/EDTA中。在37 °C孵育10分钟。重复离心步骤两次。
  10. 加入10 mL添加了20%胎牛血清（FBS）的DMEM，混匀后于500 × g离心5分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于红细胞裂解缓冲液（155 mM NH₄Cl）中。4Cl, 10 mM KHCO₃3，以及 0.1 mM EDTA。
  11. 在 500 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于分选缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.0；1 mM EDTA；1% BSA，含 Ca/Mg）中2+无PBS，pH 7.0）。通过40 µm细胞滤网过滤混合物，以获得单细胞悬液。
  12. 500 × g 离心 5 分钟。弃上清，将沉淀重悬于 1 mL 分选缓冲液中。
  13. 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将单细胞悬液稀释至5 × 106/mL，置于分选缓冲液中。

2. 细胞染色与分选

  1. 按照所述方法准备对照和样本 表1将单细胞悬液在冰上用相应的抗体染色30分钟，具体操作如前所述。 表1.
  2. 在500 × g下离心5分钟，并用分选缓冲液将沉淀洗涤两次。
  3. 根据表1所示，向单细胞悬液中加入DAPI。DAPI单色对照使用5 µg/mL（终浓度）的DAPI，PDGFRβ-PE-FMO对照和样品使用1 µg/mL的DAPI。实验全程将所有离心管置于冰上。
  4. 打开分选仪及软件。当系统提示时，扫描并插入100 µm分选芯片。
  5. 执行自动设置（即， 芯片对齐、液滴校准、侧流校准和分选延迟校准）在提示时加载自动设置微珠完成。
  6. 自动设置完成后，转到 "实验" 标签，点击 "新方法，" 并选择 "空白模板" 从 "公共模板。"
  7. 在“测量设置”中，将“FL1”设为“DAPI”，“FL2”设为“Nestin-GFP”，“FL3”设为“PDGFRβ”。取消勾选“FL4”至“FL6”的复选框。
  8. 勾选复选框以激活 405、488 和 561 激光器，然后单击 "创建新实验"
  9. 选择 "启动补偿向导" 选项并按照 "补偿向导" 软件提示设置补偿。
    1. 加载未染色对照并点击 "开始。" 点击 "检测器 & 阈值设置" 调整FSC和BSC检测器的传感器增益，使细胞群位于量程范围内。
    2. 调整FL1-FL3荧光通道的增益水平，使阴性群体位于直方图的左侧。点击 "记录" 按钮以记录数据。
    3. 根据提示依次加载单色对照。点击 "开始并记录" 记录数据。调整直方图上阳性群体的门控。单击 "下一步。"
    4. 前往 "计算矩阵" 在 "补偿" 标签并单击 "计算" 在 "计算补偿设置" 面板以进行补偿。单击 "完成" 退出 "补偿向导"
  10. 加载PDGFRβ-PE-FMO对照并点击 "开始。" 在感兴趣的细胞周围绘制一个多边形门（门A） "所有活动" 图。
  11. 双击门A内部以创建子图。将Y轴更改为DAPI，并围绕活细胞（DAPI阴性）绘制一个多边形门（门B）。低) 细胞。双击门B内区域以创建子图，将X轴改为FSC-H，Y轴改为FSC-W，围绕单细胞绘制多边形门（门C），以去除双联体。
  12. 双击 Gate C 内部以创建子图。将 X 轴更改为 Nestin-GFP，Y 轴更改为 PDGFRβ-PE。点击“Record”按钮以记录数据。
  13. 上样并重复步骤 2.11–2.12。记录完成后，点击 "暂停" 以保存样品。
  14. 定义 PDGFRβ 的门控边界+ 和 Nestin-GFP+ 基于 PDGFRβ-PE-FMO 对照的细胞。绘制 PDGFRβ 的设门+Nestin-GFP- 和 PDGFRβ+Nestin-GFP+ 种群。
  15. 在“分选方法”下选择“2向试管”，并指定“PDGFRβ”+Nestin-GFP-”和“PDGFRβ+Nestin-GFP+将细胞分别收集到左右两侧的收集管中。将装有分选缓冲液的15 mL收集管安装到收集架上，然后点击“Load Collection”按钮。".
  16. 点击 "简历" 按钮以保持样本运行。单击 "开始排序" 收集 PDGFRβ+Nestin-GFP- （I型周细胞）和PDGFRβ+Nestin-GFP+ （II 型周细胞）细胞。

3. 分选后分析

  1. 将分选后的细胞在 500 × g 条件下离心 5 分钟，用 1 mL 周细胞培养基（见材料表）重悬沉淀，并使用血细胞计数板计数细胞密度。
  2. 将 I 型和 II 型周细胞以约 1 × 104 个/cm2 的密度接种于聚-D-赖氨酸（PDL）包被的盖玻片上。在 37 °C、5% CO2 条件下，使用周细胞培养基培养 3 天。
  3. 第 3 天，使用荧光显微镜（激发激光：488 nm，激发滤光片：470/40 nm，发射滤光片：515/30 nm）在相差显微镜下观察周细胞形态及内源性 Nestin-GFP 表达情况。使用 20X 物镜（0.45 NA）拍摄图像。
  4. 将周细胞培养基更换为成脂诱导培养基（小鼠 MSC 基础培养基 + 成脂刺激添加剂）和成肌诱导培养基（DMEM + 2% 马血清），分别启动成脂和成肌分化，具体操作如先前所述20。每 2–3 天更换一次培养基。
  5. 在第 17 天（成脂/成肌分化后 14 天），用 4% 多聚甲醛（PFA）在室温下固定细胞 20 分钟。
    注意：PFA 为致癌物，请谨慎操作。
  6. 按照先前发表的研究方法19,20，对脂滴包被蛋白（perilipin，脂肪细胞标志物）和 S-肌球蛋白（S-myosin，成熟肌管/肌纤维标志物）进行免疫细胞化学染色。
    1. 用 PBS 在室温下洗涤固定后的细胞 3 次，每次 10 分钟。
    2. 加入封闭液（含 5% 驴血清、3% BSA 和 0.3% Triton X-100 的 PBS），室温孵育 1 小时。
    3. 加入抗-perilipin 抗体（2 µg/mL）和/或抗-S-myosin 抗体（2 µg/mL），4 °C 过夜孵育。
    4. 用 PBS 在室温下洗涤细胞 3 次，每次 10 分钟。
    5. 加入 Alexa 555 标记的驴抗兔抗体（4 µg/mL）和/或 Alexa555 标记的驴抗小鼠抗体（4 µg/mL），室温孵育 1 小时。
    6. 用 PBS 在室温下洗涤细胞 3 次，每次 10 分钟。
    7. 使用含 DAPI 的封片剂封片（见材料表）。利用荧光显微镜（激发激光：543 nm；激发滤光片：540/45 nm，发射滤光片：600/50 nm）检测 perilipin 和 S-myosin 的表达，并在 40X 物镜（0.60 NA）下采集图像。

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结果

基于未染色对照和单色对照的结果，校正FACS参数，包括激光强度和通道补偿。使用PDGFRβ-PE-FMO对照设定PDGFRβ-PE+细胞群的设门（图1A）。在PDGFRβ-PE-细胞中，Nestin-GFP+和Nestin-GFP-两个细胞群可被明显区分（图1A）。PDGFRβ-PE+Nestin-GFP+和PDGFRβ-PE+Nestin-GFP-细胞群的设门边界根据PDGFRβ-PE+与Nestin-GFP+的设门结果确定（图1A）。这些设门边界用于从样本中定义并分选PDGFRβ-PE+Nestin-GFP+（II型周细胞）和PDG...

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讨论

周细胞是多能的血管周细胞22,23 位于毛细血管的远腔面21,26在骨骼肌中，周细胞能够沿脂肪生成和/或肌生成途径分化19,20,24近期研究揭示了两种周细胞亚群，它们具有不同的标志物表达特征和独特的分化潜能19,24,25I型（NG2）+Nestin-) 周细胞具有脂肪生成潜能，而II型（NG2+Nestin+) 周细胞具有肌源性。分离这些亚群以 ...

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披露

所有作者均无利益冲突需要披露。

致谢

本工作部分得到了强直性肌营养不良症基金会 Fund-A-Fellow 项目（MDF-FF-2014-0013）以及美国心脏协会科学家发展奖（16SDG29320001）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细胞分选仪SonySH800
自动校准微珠SonyLE-B3001
DMEMGibco11995
Avertin SigmaT48402
周细胞生长培养基ScienCell1201
MSC基础培养基（小鼠）Stemcell Technologies5501
成脂诱导补充剂（小鼠）Stemcell Technologies5503
胎牛血清Gibco16000
马血清SigmaH1270
胶原酶II型WorthingtonLS004176
0.25%胰蛋白酶/EDTA Gibco25200
青霉素/链霉素Gibco15140
多聚赖氨酸（PDL）SigmaP6407
PDGFRβ-PE抗体eBioscience12-1402
Perilipin抗体SigmaP1998
S-肌球蛋白抗体DSHBMF-20
Alexa 555-抗兔抗体 ThermoFisher ScientificA-31572
Alexa 555-抗小鼠抗体ThermoFisher ScientificA-31570
含DAPI的封片剂Vector LaboratoriesH-1200
DAPIThermoFisher ScientificD1306
HEPESGibco15630
EDTAFisherBP120
BSASigmaA2058
NH4ClFisher ScientificA661
KHCO3Fisher ScientificP184
PBSGibco14190
18 G针头BD305196
10 mL血清移液管BD357551
OneComp eBeadseBioscience01-1111

参考文献

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