定量免疫荧光法检测全局限域性翻译

摘要

本文描述了一种用于可视化并定量亚细胞区室中局部翻译事件的方法。该方法仅需基础的共聚焦成像系统及试剂，具有快速、经济高效的特点。

摘要

调控 mRNA 翻译的机制参与多种生物学过程，如生殖系发育、细胞分化和器官发生，同时也涉及多种疾病。大量研究文献已充分证明，特定机制对 mRNA 翻译进行严密调控。随着对翻译介导的蛋白质表达调控日益关注，已催生出多种新型方法用于研究和追踪 从头合成 蛋白质合成 细胞内然而，这些方法大多较为复杂，导致成本高昂，并且通常限制了可研究的mRNA靶标数量。本论文提出了一种仅需基本试剂和共聚焦荧光成像系统即可测量和可视化各种条件下任何细胞系中mRNA翻译变化的方法。该方法最近被用于在短时间内显示贴壁细胞亚细胞结构中的局部翻译现象，从而提供了可视化 从头合成 在多种生物过程中短暂地进行翻译，或验证特定刺激下翻译活性的变化。

引言

不同细胞功能对翻译的调控促使许多研究团队开发出新的工具和方法，以确定mRNA翻译的亚细胞定位以及受调控的蛋白质合成^1,2,3,4。这些近期的技术进步有助于更深入地理解在神经元发育、药物反应和转移等生物过程中，特定mRNA翻译上调或抑制所涉及的机制^5,6,7,8。然而，这些方法大多需要昂贵或有害的试剂以及特定设备，而这些条件可能并非大多数实验室都能具备。因此，研究人员开发了一种经济高效的方法，以快速评估翻译事件，专门克服上述潜在问题。该方法可检测特定细胞过程中发生的急性翻译调控，并可通过共聚焦显微镜实现翻译的定位分析。

本文所述方法用于监测位于细胞亚结构（称为扩散起始中心，SIC）内的局部翻译过程⁵. SICs 是在已接种细胞中发现的瞬态结构，定位于新生黏附复合体的上方。尽管 SICs 与黏附复合体是不同的结构，但它们的命运密切相关。事实上，已知在黏附初始阶段，随着黏着斑复合体成熟为黏附位点，SICs 会逐渐消失。我们发现，一些已知可特异性调控 mRNA 翻译的 RNA 结合蛋白（例如， Sam68、FMRP 和 G3BP1）以及多聚腺苷酸化 RNA 在这些结构中富集⁵. 利用本文所述方法，我们证明了SIC相关mRNA翻译的调控可作为种子细胞巩固细胞黏附的检查点。该方法基于嘌呤霉素掺入，可视为表面翻译感知检测法（SunSET）的一种改进版本。该技术最初通过使用非放射性标记的氨基酸来测定整体蛋白质合成速率，而蛋白质的嘌呤霉素化则为可视化蛋白质合成提供了高效手段 从头合成 蛋白质合成⁹该方法依赖于嘌呤霉素的内在特性，嘌呤霉素是一种通过在核糖体中引发提前链终止而阻断翻译的抗生素¹⁰事实上，嘌呤霉素在结构上与酪氨酰-tRNA相似，因此可通过肽键的形成被掺入正在延伸的肽链中。然而，嘌呤霉素与生长中肽链的结合会阻止其与下一个氨酰-tRNA形成新的肽键，因为嘌呤霉素含有一个不可水解的酰胺键，而tRNA中为可水解的酯键。因此，嘌呤霉素掺入延伸中的多肽链后，会导致大量截短的嘌呤霉素化多肽提前释放，这些多肽对应于正处于活跃翻译状态的mRNA^9,11,12.

使用该方法，可在较短的时间窗口内评估活跃的翻译过程例如， 在细胞黏附过程中，于不同时间点分别加入抗生素嘌呤霉素作用5分钟，随后使用抗嘌呤霉素特异性抗体对细胞进行检测（作用时间为5分钟）⁵该检测方法的精确性依赖于针对嘌呤霉素化部分的高特异性抗体。通过免疫荧光检测嘌呤霉素化的多肽，可获得新翻译mRNA的总体亚细胞分布情况，也可利用共聚焦成像系统对其进行高精度定量分析。

因此，该方法为大量研究转译调控机制的实验室提供了一种切实可行的选择，这些机制涉及神经元颗粒化^6,13,14,15、形态发生素mRNA在发育过程中的定位与翻译^16,17等过程。该方法也适用于研究快速生物学事件（如细胞迁移、黏附或侵袭）中局部化或区室化的翻译过程，或用于简单评估可能诱导转译变化的药物处理^5,7,18。总体而言，该方法能够以快速、精确且经济的方式实现对局部化或受控翻译事件的可视化。

方案

1. 确定嘌呤霉素标记条件

注意：本技术描述了在MRC-5细胞黏附过程中评估局部翻译的方法⁵由于嘌呤霉素化处理可在任何细胞中进行，因此针对拟使用的特定细胞系优化嘌呤霉素化条件至关重要，因为不同细胞系在嘌呤霉素浓度和所需孵育时间等处理条件上并不相同。为说明这些条件的确定方法，本文以三种示例细胞系（即， HeLa、MRC-5 和 Huh-7 细胞经不同浓度的嘌呤霉素处理，并孵育不同时间图1).

1. 在测试前16小时，将等量细胞接种于24孔板中，每孔加入0.5 mL相应的完全培养基。每孔接种30,000个MRC-5细胞、50,000个HeLa细胞或50,000个HuH-7细胞。确保细胞融合度不超过60–70%（图1A）。
2. 准备6个试管，每管加入1.5 mL完全细胞培养基，并分别添加浓度递增的嘌呤霉素（0、5、10、15、20和30 µg/mL）。于37 °C预热。
3. 针对步骤1.2中配制的每种嘌呤霉素培养基，从各管中取出0.5 mL转移至6个新试管中，并向所有6个新试管中加入环己酰亚胺，使其终浓度为50 µg/mL。于37 °C预热。
4. 将第一行和第二行的培养基更换为0.5 mL完全培养基。第三行则加入0.5 mL含有50 µg/mL环己酰亚胺的完全培养基（图1B）。
   注意：由于环己酰亚胺能够阻断翻译延伸，而嘌呤霉素的掺入依赖于翻译延伸过程，因此环己酰亚胺处理被确立为蛋白质嘌呤霉素化检测的最佳阴性对照，可导致嘌呤霉素化蛋白信号的消失^5,18。
5. 在37 °C（5% CO₂）条件下孵育15分钟。
6. 向第二行各孔中加入0.5 mL步骤1.2中配制的嘌呤霉素培养基，使A至F列的终浓度分别为0、2.5、5、7.5、10和15 µg/mL。同时，向第三行含环己酰亚胺的培养基（步骤1.3）中加入0.5 mL嘌呤霉素（图1C）。
7. 在37 °C（5% CO₂）条件下孵育5分钟。
8. 向第一行各孔中加入0.5 mL步骤1.2中配制的嘌呤霉素培养基，使终浓度分别为0.0、2.5、5、7.5、10和15 µg/mL（图1C）。
9. 在37 °C（5% CO₂）条件下孵育5分钟。
10. 在向第一行各孔加入嘌呤霉素5分钟后，用1 mL预冷的1×磷酸盐缓冲液（PBS）清洗第1至第3行的每个孔（清洗两次）。每孔加入75 µL 1× Laemmli缓冲液（含4%十二烷基硫酸钠（SDS）、4% 2-巯基乙醇、0.120 M Tris HCl pH 6.8、0.004%溴酚蓝和10%甘油），以制备各条件下的全细胞裂解液。
11. 取制备样品的三分之一进行10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），以检测嘌呤霉素的掺入情况。
    1. 使用抗嘌呤霉素抗体（12D10）以1:25,000的比例溶于一抗孵育缓冲液（2%牛血清白蛋白（BSA）、430 mM NaCl、10 mM Tris pH 7.4、0.01%叠氮化钠）中，通过Western blot分析确定嘌呤霉素掺入水平。
       注意：图2展示了按照步骤1所述方法制备的不同细胞系提取物的代表性图像。

2. 活细胞内 局部翻译可视化

注意：此处描述的技术用于在黏附过程中评估 MRC-5 细胞 SICs 内的局部翻译⁵。尽管本实验使用 MRC-5 细胞，但其他细胞系也可采用步骤 2.1 中所述的相同方法进行操作。

1. 细胞制备。
   1. 使用含0.25%胰蛋白酶/2.21 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的Hank's平衡盐溶液（HBSS）消化MRC-5细胞。将细胞在15 mL圆锥形离心管中离心（200 × g，5分钟）形成沉淀，计数后用添加10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）重悬，调整细胞密度至40,000个细胞/mL。
   2. 将悬浮细胞置于试管旋转仪中，37 °C 轻柔旋转孵育 20 分钟，以维持细胞悬浮状态。
      注意：此步骤对于实现黏着斑复合物的完全解离至关重要。
   3. 将2 mL悬浮的MRC-5细胞（40,000个细胞/mL）接种至两个35 mm玻璃底培养皿中。第一个35 mm玻璃底培养皿用于嘌呤霉素化检测（见步骤2.1.5），第二个作为阴性对照（见步骤2.1.6）。
   4. 将细胞置于37 °C（5% CO₂）条件下培养₂孵育55分钟，以促进细胞黏附和SIC形成。
   5. 向35 mm玻璃底培养皿（检测用）中的培养基加入之前在第1部分中确定浓度的嘌呤霉素。处理MRC-5细胞时，在37 °C条件下使用10 µg/mL嘌呤霉素处理5分钟（5% CO₂）₂).
   6. 作为阴性对照，在细胞接种后40分钟，向第二个35 mm玻璃底培养皿中加入环己酰亚胺，以50 µg/mL环己酰亚胺预处理细胞图2B）。然后，在加入环己酰亚胺15分钟后，按照与步骤2.1.5相同的浓度和孵育时间，将嘌呤霉素加入培养基中（例如， 使用10 µg/mL嘌呤霉素在37 °C（5% CO₂）条件下孵育5分钟₂) 用于 MRC-5。
   7. 每孔用 2 mL 冰冷的 1× PBS 洗涤两次，加入 1 mL 4% 多聚甲醛（溶于 1× PBS）室温（RT）固定 15 分钟。
      注意：多聚甲醛必须严格在化学通风橱中使用。
2. 免疫染色
   1. 经多聚甲醛固定后，用2 mL 1×PBS洗涤3次，随后在500 µL含0.5% Triton X-100的PBS中室温孵育20 min，以通透细胞。
   2. 为防止非特异性抗体结合，用500 µL PBS – BSA（1%）在室温下封闭样本20分钟。
   3. 用 2 mL PBS-Tween20（0.1%）洗涤三次，然后加入 300 µL 抗嘌呤霉素抗体（12D10），用 1×PBS 将抗体稀释至 1:12,500，室温孵育 1 小时。
   4. 用 2 mL PBS-Tween20（0.1%）洗涤 3 次，然后加入 300 µL 用 PBS 稀释的荧光染料标记的抗小鼠 IgG 抗体（此处为 488 nm）以显示嘌呤霉素标记的多肽，同时加入另一种荧光染料标记的鬼笔环肽（此处为 555 nm）以显示 F-actin。室温孵育 1 小时。
   5. 用 2 mL PBS-Tween20（0.1%）洗涤三次，然后在含 1 µg/mL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的 300 µL PBS-Tween20（0.1%）中室温孵育 5 分钟。
   6. 用 2 mL PBS-Tween20（0.1%）洗涤三次，然后用 2 mL 1×PBS 洗涤。成像过程中保持样本中含有 2 mL 1×PBS，以防止细胞干燥。

3. 免疫荧光图像采集

注意：以下方法可与任何市售的共聚焦成像系统配合使用。

1. 为每种荧光染料确定适当的设置，以最大化定量分析的动态范围。
   注意：只有避免像素饱和并正确调整信号阈值，才能获得具有代表性的定量结果。可通过仔细调节激光功率、高压（HV）、增益和偏移来实现这些设置。
   1. 调节放大倍数（5倍）和像素数量（512 × 512），以优化像素尺寸。
      注意：根据奈奎斯特采样定理，像素尺寸应至少小于光学分辨率的2.3倍。
   2. 降低扫描速度（12.5–20 µs/像素），并根据上述设置进行多次平均（2–3次），以提高信噪比。
2. 沿Z轴手动确定合适的上下焦平面，并采用最佳步进尺寸（0.4 µm/层）。
   注意：根据奈奎斯特采样定理，步进尺寸应为轴向分辨率除以2.3。通常需要20–25层才能覆盖贴壁细胞的整个细胞厚度。
3. 使用60倍平场复消色差油浸物镜（数值孔径1.42）获取单个完整细胞的共聚焦图像。

4. 免疫荧光图像定量分析

1. 富集度的测定
   1. 使用ImageJ软件（可从http://fiji.sc获取的免费软件）打开从已获取的细胞数据文件中对应于目标z平面层的图像。
   2. 使用线条绘制工具（工具栏 → 直线）在需要定量分析的细胞区域划一条线。通过双击线条来调整线条宽度 "直的" 线条宽度（设定为8）范围内的强度值将进行平均 图3).
      注意：建议使用较细的线以避免来自不同结构的信号重叠。
   3. 线条正确设置后，沿确定的轴分析信号密度（菜单栏 → 分析 → 绘制轮廓）。
      注意：将打开一个新窗口，显示所选z平面部分沿该线条上每个像素对应通道（特定荧光染料）的信号强度分布曲线。
      1. 对每种所用的荧光染料对应的通道重复该过程（即， 一个用于488，一个用于568，一个用于405。
         注意：信号强度值的排列顺序始终与所绘制线条的方向一致。
   4. 为获得与所选 z 平面层定量结果相对应的轮廓图中每个像素的数值灰度值，复制轮廓数据（图像窗口菜单栏 → 复制），并粘贴至任意电子表格软件中。
   5. 对所获取的共聚焦图像的每个z平面部分以及需要进行定量分析的每个通道，重复步骤4.1.1–4.1.4。
      注意：可通过合并不同z平面层的定量数据，对信号的空间富集情况进行总体评估，即计算每条线上每个z平面层各像素的总和值。此类合并分析仅在所绘制的线条在所有纳入平均值计算的z平面层中完全相同时方可实现。
   6. 作为一种用于对具有大量层的不同通道进行全细胞定量的替代方法，使用名为 StackprofileData 的宏（参见 补充文件).
      注意：此宏可在 https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt 免费获取，并可按如下方式使用：
      1. 将宏粘贴到文本文件中并保存。
      2. 打开包含细胞所有共聚焦层的图像文件。
      3. 按照步骤4.1.2所述画一条线，打开一个新窗口以导入宏（菜单栏 → Plugins → Macros → Run），选择之前保存的对应于StackprofileData宏的文本文件，然后单击 "开放。"
         注意：宏导入后，将出现一个名为 "结果" 将打开并列出图像文件中每个z平面层和通道沿已确定轴的所有定量数据。
      4. 复制每个通道的数据（菜单栏 → 编辑 → 复制），以获得与信号定量结果相对应的图形化轮廓。将其粘贴至任意电子表格软件中。针对每条线在每个 z 平面层上的每个像素，计算各通道的总和值。利用这些数值创建一个与文中所示相似的图形化表示。 图3.
2. 在指定的细胞区域或体积内对信号进行定量。
   1. 使用 ImageJ 软件打开图像文件。
   2. 使用几何形状工具（工具栏 →“矩形”）绘制一个区域，以标示感兴趣区域。" "卵形" 或 "多边形").
      注意：定量值将根据所绘制区域的面积确定。
   3. 调整阈值以避免任何背景信号（菜单栏 → 图像调整 → 阈值）；此时将弹出一个以直方图形式显示像素强度的新窗口。通过滑块调节数值，以确定在定量分析中包含或排除的像素。选择一个能够消除细胞外红色像素的阈值，因为以红色高亮显示的像素将被纳入定量分析。
   4. 定义测量参数以量化选定区域内无背景信号的像素信号（菜单栏 → Analyze → Set Measurements），并确保勾选 "阈值限制" 以及 "积分密度" 盒子
   5. 测量选定区域的定量值（菜单栏 → 分析 → 测量）。
      注意：信号强度的定量结果将在新窗口中显示 "IntDen" 鉴定，表示所选区域内像素的平均灰度值与像素数量的乘积。
   6. 使用几何形状（工具栏 →“矩形”）绘制包含整个细胞的区域" "卵形的，" 或 "多边形"）并继续执行步骤 4.2.3–4.2.5，以获得对应于总信号的数值。计算所选区域内的信号与总信号的比值，从而得到感兴趣区域内信号所占的百分比。
   7. 重复步骤 4.2.2–4.2.6，以获得每个 z 平面的细胞体积定量结果。根据需要调整几何形状。
   8. 复制/粘贴从实验中获得的数据 "结果" 将每个z平面层的窗口数据导入电子表格，用于图形化展示并计算平均值。

结果

为了利用嘌呤霉素掺入准确观察翻译事件，必须确定每种细胞系的最佳实验条件，因为不同细胞系的嘌呤霉素掺入动力学存在差异（图1）^9,11,12,18。因此，为验证嘌呤霉素的掺入效果，需对目标细胞系采用一系列递增的标准浓度嘌呤霉素（1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 和 15.0 µg/mL）处理不同时间（5 和 10 分钟）。若要评估局部翻译或药物处理的早期反应，建议采用较短的孵育时间（例如，少于 5 分钟），以便直接检测特定处理后立即发生的翻译事件。理想情况下，嘌呤霉素信号应易于检测，同时避免达到饱和（图2）。如图2（左图...

讨论

近年来的技术进步使得人们对生物学过程中特定mRNA翻译上调或抑制所涉及的机制有了更深入的理解，例如神经元发育、药物反应和转移。本文所述的低成本方法能够可视化细胞中的翻译事件，以研究RNA结合蛋白如何调控细胞黏附、迁移和侵袭等转移过程。

尽管已有多种方法可用于评估 从头合成 蛋白质翻译技术已经得到发展，但这些方法均采用相同的策略，即在延伸的多肽链中掺入带有可检测基团标记的修饰氨基酸。第一种方法依赖于 ³⁵S标记的放射性精氨酸掺入新合成的蛋白质中。尽管该方法在比较特定条件下总体翻译速率方面效率较高，但由于使用了放射性标记的氨基酸，大多数研究团队对此方法兴趣不大。因此，采用非放射性标记的新型方法（如SunSET、Click-it或TRICK技术）的发展为评估和观察 体内 翻译事件。尽管这些方法设计巧妙，但大多数仅允许在药物处理或特定细胞事件后，利用特定靶标的特异性外源cDNA构建体来评估翻译事件，从而将实验限制于已被识别的靶标。TRICK方法亦是如此。⁴，可用于评估单个外源表达的 m...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	wisent	319-005-CL
胰蛋白酶（Trypsine）	wisent	325-043 EL
胎牛血清（FBS）	Thermo Fisher Scientific	12483020
嘌呤霉素抗体 12D10（Puroycin antibody 12D10）	EMD millipore	MABE343	Western blot 稀释比例 1:25,000 免疫荧光稀释比例 1:10,000
抗小鼠 IgG HRP 标记抗体（Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody）	cell signaling technology	7076	Western blot 稀释比例 1:8,000
Western Lightning Plus-ECL	Perkin Elmer	NEL104001EA
抗小鼠 IgG (H+L)，F(ab')2 片段（Alexa Fluor 488 标记）	cell signaling technology	4408	免疫荧光稀释比例 1:400
CF568 鬼笔环肽（CF568 Phalloidin）	biotium	00044	免疫荧光稀释比例 1:400
环己酰亚胺（Cyclohexmide）	Sigma	C1988-1G	终浓度 50µg/ml
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐）（DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)）	Invitrogen	D1306	终浓度 1µg/ml
嘌呤霉素（Puromycin）	bio-Basic	PJ593	2.5µg/ml 至 10µg/ml
Ibidi µ-Dish 35 mm，高壁，ibiTreat	Ibidi	81156
MRC-5 细胞	ATCC	CCL-171
HeLa 细胞	ATCC	CCL-2
Huh-7 细胞	来自 Dr. Mazroui（Université Laval）
Fv1000	olympus		共聚焦成像系统
Fiji 软件			http://fiji.sc
PBS（磷酸盐缓冲液）（PBS (Phosphate BuffeRed Saline)）	bio-Basic	PD8117
甲醛 37% 溶液（Formaldehyde 37% Solution）	bio-Basic	C5300-1
Triton X-100	bio-Basic	TB0198
牛血清白蛋白（BSA）	Fisher Bioreagents	BP9702-100
Tween20	Fisher Bioreagents	BP337-500