本文描述了一种用于可视化并定量亚细胞区室中局部翻译事件的方法。该方法仅需基础的共聚焦成像系统及试剂，具有快速、经济高效的特点。
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本文内容
摘要
摘要
调控 mRNA 翻译的机制参与多种生物学过程，如生殖系发育、细胞分化和器官发生，同时也涉及多种疾病。大量研究文献已充分证明，特定机制对 mRNA 翻译进行严密调控。随着对翻译介导的蛋白质表达调控日益关注，已催生出多种新型方法用于研究和追踪 从头合成 蛋白质合成 细胞内然而，这些方法大多较为复杂，导致成本高昂，并且通常限制了可研究的mRNA靶标数量。本论文提出了一种仅需基本试剂和共聚焦荧光成像系统即可测量和可视化各种条件下任何细胞系中mRNA翻译变化的方法。该方法最近被用于在短时间内显示贴壁细胞亚细胞结构中的局部翻译现象，从而提供了可视化 从头合成 在多种生物过程中短暂地进行翻译，或验证特定刺激下翻译活性的变化。
引言
不同细胞功能对翻译的调控促使许多研究团队开发出新的工具和方法，以确定mRNA翻译的亚细胞定位以及受调控的蛋白质合成1,2,3,4。这些近期的技术进步有助于更深入地理解在神经元发育、药物反应和转移等生物过程中，特定mRNA翻译上调或抑制所涉及的机制5,6,7,8。然而，这些方法大多需要昂贵或有害的试剂以及特定设备，而这些条件可能并非大多数实验室都能具备。因此，研究人员开发了一种经济高效的方法，以快速评估翻译事件，专门克服上述潜在问题。该方法可检测特定细胞过程中发生的急性翻译调控，并可通过共聚焦显微镜实现翻译的定位分析。
本文所述方法用于监测位于细胞亚结构（称为扩散起始中心，SIC）内的局部翻译过程5. SICs 是在已接种细胞中发现的瞬态结构，定位于新生黏附复合体的上方。尽管 SICs 与黏附复合体是不同的结构，但它们的命运....
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方案
1. 确定嘌呤霉素标记条件
注意：本技术描述了在MRC-5细胞黏附过程中评估局部翻译的方法5由于嘌呤霉素化处理可在任何细胞中进行，因此针对拟使用的特定细胞系优化嘌呤霉素化条件至关重要，因为不同细胞系在嘌呤霉素浓度和所需孵育时间等处理条件上并不相同。为说明这些条件的确定方法，本文以三种示例细胞系（即， HeLa、MRC-5 和 Huh-7 细胞经不同浓度的嘌呤霉素处理，并孵育不同时间图1).
- 在测试前16小时，将等量细胞接种于24孔板中，每孔加入0.5 mL相应的完全培养基。每孔接种30,000个MRC-5细胞、50,000个HeLa细胞或50,000个HuH-7细胞。确保细胞融合度不超过60–70%（图1A）。
- 准备6个试管，每管加入1.5 mL完全细胞培养基，并分别添加浓度递增的嘌呤霉素（0、5、10、15、20和30 µg/mL）。于37 °C预热。
- 针对步骤1.2中配制的每种嘌呤霉素培养基，从各管中取出0.5 mL转移至6个新试管中，并向所有6个新试管中加入环己酰亚胺，使其终浓度为50 µg/mL。于37 °C预热。
- 将第一行和第二行的培养基更换为0.5 mL完全培养基。第三行则加入0.5 mL含有50 µg/mL环己酰亚胺的完全....
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结果
为了利用嘌呤霉素掺入准确观察翻译事件，必须确定每种细胞系的最佳实验条件，因为不同细胞系的嘌呤霉素掺入动力学存在差异（图1）9,11,12,18。因此，为验证嘌呤霉素的掺入效果，需对目标细胞系采用一系列递增的标准浓度嘌呤霉素（1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 和 15.0 µg/mL）处理不同时间（5 和 10 分钟）。若需评估局部翻译或药物处理的早期反应，则建议采用较短的孵育时间（例如，少于 5 分钟），以便直接检测特定处理后立即发生的翻译事件。理想情况下，嘌呤霉素信号应易于检测，但同时应避免达到饱和（图2）。如图2.......
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讨论
近年来的技术进步使得人们对生物学过程中特定mRNA翻译上调或抑制所涉及的机制有了更深入的理解，例如神经元发育、药物反应和转移。本文所述的低成本方法能够可视化细胞中的翻译事件，以研究RNA结合蛋白如何调控细胞黏附、迁移和侵袭等转移过程。
尽管已有多种方法可用于评估 从头合成 蛋白质翻译技术已经得到发展，但这些方法均采用相同的策略，即在延伸的多肽链中掺入带有可检测基团标记的修饰氨基酸。第一种方法依赖于 35S标记的放射性精氨酸掺入新合成的蛋白质中。尽管该方法在比较特定条件下总体翻译速率方面效率较高，但由于使用了放射性标记的氨基酸，大多数研究团队对此方法兴趣不大。因此，采用非放射性标记的新型方法（如SunSET、Click-it或TRICK技术）的发展为评估和观察 体内 翻译事件。尽管这些方法设计巧妙，但大多数仅允许在药物处理或特定细胞事件后，利用特定靶标的特异性外源cDNA构建体来评估翻译事件，从而将实验限制于已被识别的靶标。TRICK方法亦是如此。4，可用于评估单个外源表达的 m.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢加拿大魁北克省拉瓦尔大学的Rachid Mazroui博士对本文稿的审阅。感谢研究中心细胞成像单元提供的技术协助。M.-É. Huot是魁北克健康研究基金会（FRQ-S）的初级1级研究学者。本研究由加拿大卫生研究院（CIHR，资助号MOP-286437，授予M.-É. Huot）提供资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | wisent | 319-005-CL | |
| 胰蛋白酶（Trypsine） | wisent | 325-043 EL | |
| 胎牛血清（FBS） | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| 嘌呤霉素抗体 12D10（Puroycin antibody 12D10） | EMD millipore | MABE343 | Western blot 稀释比例 1:25,000 免疫荧光稀释比例 1:10,000 |
| 抗小鼠 IgG HRP 标记抗体（Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody） | cell signaling technology | 7076 | Western blot 稀释比例 1:8,000 |
| Western Lightning Plus-ECL | Perkin Elmer | NEL104001EA | |
| 抗小鼠 IgG (H+L)，F(ab')2 片段（Alexa Fluor 488 标记） | cell signaling technology | 4408 | 免疫荧光稀释比例 1:400 |
| CF568 鬼笔环肽（CF568 Phalloidin） | biotium | 00044 | 免疫荧光稀释比例 1:400 |
| 环己酰亚胺（Cyclohexmide） | Sigma | C1988-1G | 终浓度 50µg/ml |
| DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐）（DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)） | Invitrogen | D1306 | 终浓度 1µg/ml |
| 嘌呤霉素（Puromycin） | bio-Basic | PJ593 | 2.5µg/ml 至 10µg/ml |
| Ibidi µ-Dish 35 mm，高壁，ibiTreat | Ibidi | 81156 | |
| MRC-5 细胞 | ATCC | CCL-171 | |
| HeLa 细胞 | ATCC | CCL-2 | |
| Huh-7 细胞 | 来自 Dr. Mazroui（Université Laval） | ||
| Fv1000 | olympus | 共聚焦成像系统 | |
| Fiji 软件 | http://fiji.sc | ||
| PBS（磷酸盐缓冲液）（PBS (Phosphate BuffeRed Saline)） | bio-Basic | PD8117 | |
| 甲醛 37% 溶液（Formaldehyde 37% Solution） | bio-Basic | C5300-1 | |
| Triton X-100 | bio-Basic | TB0198 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Fisher Bioreagents | BP9702-100 | |
| Tween20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 |
参考文献
- Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
- Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (....
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重印与许可
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