本文描述了将肽微阵列技术应用于识别组蛋白及其翻译后修饰的抗体特异性分析的方法。
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本文内容
摘要
摘要
组蛋白蛋白的翻译后修饰（PTMs）因其在调控染色质结构和基因表达中的作用而被广泛研究。针对组蛋白PTMs的抗体的大规模生产和分发极大地推动了这些修饰标记的研究。由于组蛋白PTM抗体是许多染色质生物化学应用中的关键试剂，因此对抗体特异性的严格分析对于准确解读数据以及该领域的持续进展至关重要。本实验方案描述了一套整合的流程，用于设计、制备和使用肽段微阵列，以分析组蛋白抗体的特异性。该流程中的设计与分析部分由ArrayNinja软件辅助完成，ArrayNinja是我们近期开发的一种开源、交互式软件工具包，旨在简化微阵列打印格式的定制化操作。该流程已被用于筛选大量市售且广泛使用的组蛋白PTM抗体，相关实验产生的数据可通过一个在线、持续更新的组蛋白抗体特异性数据库免费获取。除组蛋白外，本文所述的通用方法还可广泛应用于其他翻译后修饰特异性抗体的分析。
引言
基因组DNA在真核细胞核内与组蛋白结合，以一种精巧的方式包装形成染色质。染色质的基本重复单位是核小体，由147个碱基对的DNA缠绕在组蛋白八聚体核心（包括H2A、H2B、H3和H4）上构成1。染色质总体上可分为松散包装的常染色质和紧密包装的异染色质区域。染色质压缩程度决定了蛋白质机器对底层DNA的可及性，从而调控DNA复制、转录和修复等以DNA为模板的基本生物学过程的进行。
染色质背景下基因组可及性的关键调控因子是组蛋白蛋白非结构化尾部和核心结构域上的翻译后修饰2,3组蛋白翻译后修饰通过影响染色质结构而直接发挥作用4 并通过招募具有染色质重塑、酶活性和支架功能的阅读蛋白及其相关大分子复合物间接实现5过去二十年对组蛋白PTM功能的研究 overwhelmingly 表明，这些修饰在调控细胞命运、生物体发育以及疾病发生/进展中发挥关键作用。得益于基于质谱的蛋白质组学技术的进步，目前已发现超过80个不同的组蛋白残基上存在20多种独特的组蛋白PTM6值得注意的是，这些修饰通常以组合形式发生，且与之相符的 "组蛋白密码" 假设，大量研究表明，阅读蛋白通过识别组蛋白P....
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方案
1. 安装和运行 ArrayNinja
- 从 www.virtualbox.org 下载并安装 Oracle Virtual Box。
- 从 http://research.vai.org/Tools/arrayninja 下载并解压 ArrayNinja 虚拟机（VM）。
- 打开 Virtual Box，点击“机器”，“添加”，然后从保存 ArrayNinja 虚拟机的文件夹中选择 arrayninja.vbox，以添加 ArrayNinja 虚拟机。
- 在 Virtual Box 中选择 ArrayNinja，然后点击绿色的“启动”箭头以启动程序。
- Virtual Box 将打开一个新窗口，并显示一条消息，提示可通过在浏览器中导航至 localhost:2080 来访问虚拟机。 &....
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结果
本方案已用于设计和构建肽段微阵列平台，以分析组蛋白PTM抗体的特异性。该阵列检测包含300多种独特肽段特征（长度为20至40个残基）的文库，代表了核心组蛋白和变异组蛋白上已知的多种PTM组合38。该流程已成为筛选多种广泛使用且 commercially available 的组蛋白PTM抗体的主要工具，完整数据集可在组蛋白抗体特异性数据库（www.histoneantibodies.com）中获取17。
本流程的核心是ArrayNinja，这是我们近期开发的一款开源软件应用程序，用于整合微阵列实验的实验设计与数据分析环节28。ArrayNinja的分析模块允许用户以交互方式处理原始阵列图像文件。打印的特征标识会自动与图像对齐，通过将鼠标悬停在某个点位上即可显示其标识信息。该集成功能还支持按名称快速搜索目标特征，.......
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讨论
抗体在生物医学研究应用中的可靠性至关重要46,47。这一点在染色质生物化学研究中尤为突出，因为抗体是目前大多数用于表征组蛋白翻译后修饰（PTM）丰度与分布技术中的关键工具。本文所述方案详细介绍了一种经过优化的肽段微阵列设计、制备和应用流程，用于分析组蛋白PTM抗体的特异性。该流程已被用于筛选大量 commercially available 且广泛使用的组蛋白PTM抗体，相关实验产生的数据可通过在线开放且持续更新的组蛋白抗体特异性数据库（www.histoneantibodies.com）免费获取17。
我们的研究以及他人的工作均表明，组蛋白PTM抗体的行为经常存在不利情况，这可能会使利用这些试剂产生的数据解释变得复杂12,15,17.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作部分由范安德尔研究所及美国国立卫生研究院（CA181343）向 S.B.R. 提供的研究资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 打印缓冲液 | ArrayIt | PPB | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Omnipure | 2390 | |
| 链霉亲和素包被的玻璃显微镜载片 | Greiner Bio-one | 439003-25 | |
| 聚丙烯 384 孔板 | Greiner Bio-one | 784201 | |
| 生物素-荧光素 | Sigma | 53608 | |
| 接触式微阵列打印机 | Aushon | 2470 | Aushon 2470 微阵列打印机 |
| 接触式微阵列打印机 | Gene Machines | OmniGrid 100 | OmniGrid 微阵列打印机 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Invitrogen | 14190 | |
| 封闭缓冲液 | ArrayIt | SBB | |
| 疏水性蜡笔 | Vector Labs | H-4000 | ImmEdge 疏水屏障 PAP 笔 |
| 硅胶垫片 | Grace Bio-labs | 622511 | |
| 杂交容器 | Thermo Scientific | 267061 | 或类似容器 |
| 荧光染料标记的二抗 | Life Technologies | A-21244 | Alexa Fluor 647（抗兔） |
| 荧光染料标记的二抗 | Life Technologies | A-21235 | Alexa Fluor 647（抗小鼠） |
| 蜡印仪 | ArrayIt | MSI48 | |
| 吐温-20（Tween-20） | Omnipure | 9490 | |
| 微阵列扫描仪 | Innopsys | InnoScan 1100AL | 或同等性能的微阵列扫描仪 |
| EpiTitan 组蛋白肽微阵列 | Epicypher | 112001 | |
| AbSurance Pro 组蛋白肽微阵列 | Millipore | 16668 | |
| MODified 组蛋白肽阵列 | Active Motif | 13001 | |
| 组蛋白密码肽微阵列 | JPT | His_MA_01 | |
| 蜡 | Royal Oak | GulfWax | 用于蜡印仪 |
| 加湿型微阵列载片杂交室 | VWR | 97000-284 | |
| 高通量显微镜载片洗涤槽 | ArrayIt | HTW | |
| 显微镜载片离心机 | VWR | 93000-204 | |
| 抗体 1 | Abcam | 8898 | |
| 抗体 2 | Millipore | 07-473 | |
| 生物素化组蛋白肽 | EpiCypher | 12-0001 | 示例肽。多种不同修饰的类似肽可从多个商业来源获得。 |
| ImageMagick | https://www.imagemagick.org/script/index.php | ||
| ArrayNinja | https://rothbartlab.vai.org/tools/ |
参考文献
- van Steensel, B. Chromatin: constructing the big picture. EMBO J. 30 (10), 1885-1895 (2011).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
- Rothbart, S. B., Strahl, B. D.
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重印与许可
