利用CRISPR串联体在小鼠小肠类器官中进行多基因敲除的实验方案

摘要

本方案描述了将多个单导向RNA克隆到一个导向RNA串联载体中的步骤，该方法特别适用于利用CRISPR/Cas9技术创建多基因敲除。文中以肠道类器官中双基因敲除的构建为例，展示了该方法的一种可能应用。

摘要

CRISPR/Cas9 技术极大地提高了功能缺失研究的可行性和速度，而这类研究对于理解基因功能至关重要。在高等真核生物中，旁系同源基因可通过补偿某个基因的缺失而掩盖潜在的表型，从而限制了依赖单基因敲除的遗传学研究所能获得的信息。我们开发了一种新型的快速克隆方法，用于将向导 RNA（gRNA）串联体克隆至载体中，从而在小鼠小肠类器官中通过单次转染实现多基因敲除。该策略通过一次 Golden Gate 连接反应，将退火形成的 gRNA 寡核苷酸与预先设计好的逆转录病毒载体组合，即可将最多四个独立的 gRNA 串联插入单一载体中。该方法既可实现最多四个不同基因的同时敲除，也可通过多个 gRNA 靶向同一基因来提高敲除效率。在本实验方案中，我们详细展示了如何高效地将多个 gRNA 克隆至逆转录病毒 CRISPR 串联载体中，并如何在肠道类器官中实现高效的电穿孔转染。作为示例，我们证明了同时敲除两对编码 Wnt 信号通路负调控因子的基因（Axin1/2 和 Rnf43/Znrf3）可使肠道类器官对关键生长因子的撤除产生抗性。

引言

反向遗传学方法是一种广泛用于研究基因功能的技术。特别是功能缺失研究，即基因的破坏导致表型改变，在增进我们对生物过程理解方面发挥着关键作用。CRISPR/Cas9 技术代表了基因组编辑领域的最新进展，彻底改变了细胞和生物体遗传学研究的现状。Cas9 是一种由 RNA 引导的内切核酸酶，可结合与向导 RNA（gRNA）互补的特定 DNA 序列，并产生双链断裂（DSB）。这种双链断裂会招募 DNA 修复机制，在缺乏同源重组所需的 DNA 模板时，细胞将通过易错的非同源末端连接方式重新连接断裂的 DNA 链，从而可能导致核苷酸的插入或缺失，引发移码突变¹。

CRISPR/Cas9 技术具有操作简便和用途广泛的优势，使其成为用于揭示未知基因功能的全基因组规模敲除筛选的极具吸引力的工具^2,3。然而，当存在具有冗余功能的多个旁系同源基因时，单个基因敲除方法的应用将受到限制。因此，由于旁系同源基因可能产生功能补偿，导致表型无明显变化或变化甚微，仅敲除单个基因可能不足以确定该基因的功能⁴。因此，为克服遗传补偿的影响，有必要通过递送靶向不同旁系同源基因的多种 gRNA 载体，同时敲除多个旁系同源基因。

为了将CRISPR/Cas9技术的应用扩展到同源基因的敲除，我们近期开发了一种快速、一步式克隆方法，可将多达四个预先退火的gRNA克隆至单一逆转录病毒载体中⁵。该载体骨架称为CRISPR串联体（CRISPR-concatemer），基于一种MSCV逆转录病毒质粒，包含多个重复的gRNA表达盒。每个表达盒含有两个方向相反的II型限制性内切酶BbsI的识别位点，可通过单管内的Golden Gate置换反应，用具有匹配黏性末端的退火gRNA寡核苷酸片段不可逆地替换这些位点⁶。该克隆方法包含反复的酶切与连接循环，利用BbsI产生的不同黏性末端序列，实现多个DNA片段的同时组装。该酶的独特之处在于能够在其识别序列之外进行不对称切割；因此，每个表达盒可在BbsI核心位点两侧设计不同的序列和定制的黏性末端，从而使得每个gRNA能够以特定的位置和方向插入串联体载体中。

作为概念验证，我们通过一轮电穿孔同时破坏Wnt信号通路中两对旁系同源的负调控因子，证明了该策略在小鼠肠道类器官中的应用⁵。

近年来，许多其他研究团队开发了类似的策略，通过使用Golden Gate连接技术构建含多个gRNA的表达载体⁷，在多种模式系统中实现多基因敲除，例如人类细胞系^8,9、斑马鱼¹⁰和Escherichia coli¹¹。在这些方案中，gRNA首先被克隆至各自的中间载体，再共同组装到一个最终载体中。相比之下，我们提出的CRISPR串联体（CRISPR-concatemer）策略的主要优势在于仅需一次BbsI连接和克隆操作，步骤简便。与其他gRNA串联方法类似，本方法既可实现最多四个不同基因的同步敲除，也可通过多个gRNA靶向一个或两个基因，从而提高CRISPR基因敲除效率（图1）。

在本实验方案中，我们详细描述了CRISPR串联载体构建的每一步操作，从gRNA设计、Golden Gate连接反应，到成功克隆的验证。同时，我们还提供了一种高效的方法，通过电穿孔将CRISPR串联体转染至小鼠小肠类器官，并进行后续的生长因子撤除实验。

方案

1. CRISPR-concatemer 载体的 gRNA 设计

注意：本节旨在说明如何选择最佳的靶向策略，以及如何设计含有特定突出端的gRNA，用于CRISPR串联载体。

1. 使用选定的 CRISPR gRNA 设计工具针对目标基因设计 gRNA。参见材料表中的示例。
   注意：当靶向一对旁系同源基因时，尽管可以为每个基因设计一个 gRNA，但建议为每个基因设计两个 gRNA，以提高实现双基因敲除的可能性（图 1）。
2. 使用限制性酶切图谱分析工具确认 gRNA 序列中不含 BbsI 识别位点（参见材料表中的示例）。
3. 按照表 1所示，为每条寡核苷酸添加特定的 CRISPR-串联体载体突出末端。

	引物 1	引物 2	引物 3	引物 4
序列 (5′-3′)	CACCGG[gRNA1]GT	ACCGG[gRNA2]G	CCGG[gRNA3]	ACACCGG[gRNA4]GTT
序列 (5′-3′)	TAAAAC[RC-gRNA1]CC	AAAAC[RC-gRNA2]C	AAAC[RC-gRNA3]	CTAAAAC[RC-gRNA4]CCG

表1：CRISPR-concatemer载体各盒式元件的突出端序列。

2. 将gRNA克隆至CRISPR串联载体

1. 寡核苷酸的磷酸化与退火
   注意：此步骤说明了如何对每个gRNA寡核苷酸的正链和反链进行退火，以及如何在单个反应中对其末端进行磷酸化。
   1. 在冰上按照以下说明配制用于寡核苷酸磷酸化及上下链退火的反应混合液。
      注意：所有寡核苷酸可混合至同一反应体系中；例如，对于含有4个gRNA串联的载体，可将8条寡核苷酸混合。
   2. 对于3个串联体，使用3.0 µL gRNA上链（每种gRNA各1.0 µL；10 µM，每种gRNA 1 µL）、3.0 µL gRNA下链（每种gRNA各1.0 µL；10 µM，每种gRNA 1 µL）、2.0 µL T4 DNA连接酶缓冲液（10×）、1.0 µL T4 PNK，并加入H₂O₂加水至终体积为 20.0 µL。
   3. 用移液器充分混匀，然后在PCR仪中按照以下程序运行：37 °C 30分钟，95 °C 5分钟，以0.3 °C/分钟的速率降温至25 °C，4 °C保存。
2. BbsI 型混排反应
   注意：在本步骤中，通过交替进行消化与连接循环，将预先退火的gRNA寡核苷酸一步插入至串联体载体的相应位置。
   1. 将反应混合物用无 DNase/RNase 水按 1:100 稀释，以制备 3 和 4 号 gRNA-串联载体。
      注意：当克隆2个gRNA串联体时，此步骤为 不 需要。
   2. 组装 Bbs将反应物在冰上混匀，具体操作见下文说明。设置一个仅含载体的阴性对照。
   3. 使用100 ng CRISPR-concatemer载体、10.0 µL寡核苷酸混合物、1.0 µL含BSA的限制性内切酶缓冲液（10x）、1.0 µL DTT（10 mM）、1.0 µL ATP（10 mM）、1.0 µL BbsI，1.0 µL T7连接酶，和H₂加水至终体积为 20.0 µL。
   4. 用移液器充分混匀，并在PCR仪中按照以下程序运行：运行 50 个循环 用于克隆3和4个gRNA串联体 25 个循环 对于2个gRNA串联体，均在37 °C孵育5分钟，21 °C孵育5分钟， 保持在 37 °C 反应 15 分钟，然后 4 °C 保存
3. 外切酶处理
   注意：强烈建议执行此步骤，以去除线性化 DNA 的残留，从而提高克隆效率。
   1. 处理 BbsI 在含有DNA外切酶的反应中进行混匀（参见 材料表如下所示。
   2. 从上一步（2.2.3）中取 11.0 µL 连接混合物，加入 1.5 µL 外切核酸酶缓冲液（10x）、1.5 µL ATP（10 mM）、1.0 µL DNA 外切核酸酶，并用 ddH₂O 补充至总体积为 15.0 µL。在 37 °C 下孵育 30 分钟，随后在 70 °C 下孵育 30 分钟。
      注意：此步骤可去除混合物中残留的线性化DNA，从而提高克隆效率。
   3. 使用 2 µL 反应混合物进行化学感受态细胞的转化 E. coli 热激转化细菌¹².
      注意：或者，反应物可在 -20 °C 下保存长达一周。
4. 限制性酶切
   注意：此步骤的目的是通过限制性酶切来评估克隆实验的成功与否。
   1. 为了确认CRISPR-concatemer载体中gRNA插入片段的存在，用接种环挑选4–8个细菌菌落，将每个克隆在37 °C恒温摇床中于4 mL LB培养基中过夜培养。按照制造商说明书，使用质粒小提试剂盒提取DNA（参见 材料表).
   2. 用10 U酶消化约200 ng DNA EcoRI + 5 U Bgl在细菌培养箱中于37 °C孵育3小时，在10 μL反应体系中进行II。另设一个独立的反应体系，包含相应的原始载体作为阳性对照，用于大小比较。
      注意：由于这两种限制性内切酶可切割出完整的串联体，因此该步骤将确认所有串联体是否均存在。各串联体的预期大小如下：2个gRNA串联体（800 bp）、3个gRNA串联体（1.2 kbp）和4个gRNA串联体（1.6 kbp）。
   3. 在1%琼脂糖凝胶中以90 V电压运行消化反应约20分钟。
   4. 使用紫外透射仪观察凝胶。通过比较克隆的条带模式与原始载体一致，并结合DNA分子量标记判断各片段是否具有预期大小，从而鉴定出插入片段大小正确的克隆。
   5. 用 5 U 的限制性内切酶消化所选克隆 Bbs在37 °C细菌培养箱中孵育3小时。设置一个单独的反应体系，以相应的原始载体作为对照。
      注意：此额外消化步骤旨在确认gRNA已克隆至正确位置，从而确保所有 BbsI 型识别位点已丢失。
   6. 在1%琼脂糖凝胶上以90 V电压电泳约20分钟。仅将未被酶切的载体视为正确 Bbs因为它们仅含有 gRNA。
5. 载体测序
   注意：此步骤的目的是通过限制性消化分析确认正确载体中gRNA序列的存在。
   1. 通过Sanger测序验证阳性串联体载体¹³ 使用以下引物：
      正向：TCAAGCCCTTTGTACACCCTAAG（用于检测第一个gRNA表达盒）
      连接子1_正向：GACTACAAGGACGATGATGACAA（用于检测第二个gRNA表达盒）
      Linker2_反向：GGCGTAGTCGGGCACGTCGTAGGGGT（用于检测第二个gRNA表达盒）
      Linker2_正向：ACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCC（用于检测第三个gRNA表达盒）
      Linker3_反向：TCCTCCTCTGAGATCAGCTTCTGCAT（用于检测第三个gRNA表达盒）
      反向：AGGTGGCGCGAAGGGGCCACCAAAG（用于检测最后一个gRNA表达盒）
   2. 通过在测序读段中搜索gRNA序列来确认所有gRNA的存在。

3. 通过电穿孔法转染肠道类器官

注意：本实验步骤基于Fujii et al. 于2015年发表的实验方案，并针对小鼠小肠类器官培养进行了适当优化¹⁴。

1. 电穿孔前处理
   注意：本节描述了如何在电穿孔前通过去除培养基中的所有抗生素和条件培养基来准备小鼠肠道类器官，以防止电穿孔过程中可能产生的毒性作用。
   1. 转染程序的第0天，以1:2的比例传代类器官。
      注意：可通过按照先前建立的方案进行隐窝分离获得肠道类器官培养物¹⁵。所有培养基成分请参见表2。
      1. 用于电穿孔的类器官传代时，每项转染至少接种6个48孔板的孔。
      2. 将类器官接种于20 μL基底膜基质液滴中，并在WENR + Nic培养基（Wnt + EGF + Noggin + R-spondin + 烟酰胺）中于37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中培养（如先前所述¹⁵）。
   2. 第2天，将培养基更换为250 µL不含抗生素的EN（EGF + Noggin）+ CHIR99021（糖原合成酶激酶-3抑制剂）+ Y-27632（ROCK抑制剂）（见表2）。
      注意：在所有步骤中，向48孔板每个孔添加的培养基体积均为250 µL。
   3. 第3天，将类器官培养基更换为不含抗生素的EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1.25% v/v二甲基亚砜（DMSO）。
2. 细胞准备
   注意：此处描述了如何通过机械和化学解离将类器官分解为小的细胞簇。这些步骤对实验成功至关重要。
   1. 第4天，使用1 mL移液枪头破坏基底膜基质圆顶结构，并将类器官转移至1.5 mL离心管中。将48孔板中四个孔的内容物汇集至同一管中。
   2. 使用P200移液器反复吹打约200次，将类器官机械性打碎成小片段。室温下以600 × g离心5分钟。
   3. 弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL细胞培养级重组蛋白酶溶液中（见材料表）。37 °C孵育最多5分钟，随后取50 µL样品滴于倒置光学显微镜下，使用4倍物镜观察。
      注意：理想的细胞簇大小为10–15个细胞，这有助于提高电穿孔后的细胞存活率。
   4. 将细胞悬液转移至低吸附性15 mL离心管中，并加入9 mL不含抗生素的基础培养基终止解离反应（见表2）。室温下以600 × g离心5分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL低血清培养基中（见材料表）。
   5. 使用Bürker计数板对细胞进行计数，每项电穿孔反应至少使用1 × 10⁵个细胞。向15 mL管中加入9 mL低血清培养基，室温下以400 × g离心3分钟。
3. 电穿孔
   注意：以下部分提供了电穿孔操作及后续类器官恢复的步骤说明。
   1. 完全弃去上清液，将沉淀重悬于电穿孔溶液中（见材料表）。向细胞悬液中加入总量为10 µg的DNA，并加入电穿孔溶液至终体积为100 µL，将细胞-DNA混合物置于冰上保存。CRISPR串联载体应与Cas9表达质粒（例如 Addgene #41815）按1:1比例联合使用。
      注意：所加DNA总体积应不超过总反应体积的10%。
   2. 另设一组单独的转染混合物，包含GFP质粒以评估转染效率（例如 pCMV-GFP，Addgene #11153，或其他通用GFP表达质粒）。
   3. 将细胞-DNA混合物加入电穿孔比色皿中，并将其放入电穿孔仪腔室。按下电穿孔仪上的相应按钮测量阻抗，确保其值在0.030–0.055 kΩ范围内。根据表3所示参数进行电穿孔。
      注意：若阻抗值超出允许范围，需调整比色皿中溶液的体积。
   4. 向比色皿中加入400 µL电穿孔缓冲液 + Y-27632，然后全部转移至1.5 mL离心管中。室温孵育30分钟以使细胞恢复，随后室温下以400 × g离心3分钟。
   5. 弃去上清液，将沉淀重悬于20 μL/孔的基底膜基质中。将约1 × 10⁴至1 × 10⁵个细胞接种至48孔板的每个孔中，并加入EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1.25% v/v DMSO培养基。37 °C孵育。
   6. 第5天，更换为EN + CHIR99021 + Y-27632培养基，并通过观察GFP表达情况评估转染效率（图2）。将类器官保持在37 °C，并在2天后更换新鲜的EN + CHIR99021 + Y-27632培养基。
   7. 第9天，更换为WENR + Nic + Y-27632培养基，并在37 °C孵育。
      注意：Y-27632可在7–10天后（第16–19天）去除。

	电穿孔脉冲	转移脉冲
电压	175V	20V
脉冲时长	5 msec	50msec
脉冲间隔	50msec	50msec
脉冲次数	2	5
衰减率	10%	40%
极性	+	+/-

表3：电穿孔设置。

4. 生长因子撤除

注意：此处以在肠道类器官中敲除Wnt信号通路的负调控因子时进行生长因子撤除实验为例进行说明。

1. 电穿孔后10-14天，按照上述步骤（3.2.1 - 3.2.2），以1:3的比例将类器官分种至48孔板中。
2. 将类器官沉淀重悬于20 µL基底膜基质中，在37 °C下孵育10分钟使其凝固。随后加入250 µL无生长因子培养基（例如 EN），以检测目标基因是否成功敲除⁵。
3. 在无生长因子条件下对类器官进行至少2-3次传代，以观察野生型（WT）对照类器官与突变型类器官在存活能力上的差异^5,15。
   注：野生型类器官在连续两次传代过程中应无法在无生长因子培养基中存活，而突变型细胞系则应能够生长。

结果

为了确认串联体载体中插入了正确数量的gRNA片段，需使用位于所有gRNA表达盒侧翼的限制性内切酶（EcoRI + BglII）进行酶切鉴定（每个表达盒大小约为400 bp，图1）。例如，在构建含4个gRNA的串联体载体时，琼脂糖凝胶电泳中预期下方条带的大小约为1.6 Kbp；若出现比该条带更小的条带，则表明并非所有4个gRNA表达盒均已成功插入载体中（图2A）。此外，建议始终检查所有BbsI识别位点是否均已丢失，且该酶不能对载体进行切割（图2B）。

一旦确认构建体正确，即可通过电穿孔将其递送至小鼠肠道类器官，以实现最佳转染效率（高达70%），GFP对照结果如（图3）所示。

最后，为了功能上验证该策略的效率，将转染了Cas9和针对Axin1/2及Rnf43/Znrf3的串联载体的肠类器官分别培养在EN培养基（撤除R-spondin）以及EN + IWP2培养基（同时撤除R-spondin和Wnt，IWP2：Porcupine抑制剂，2.5 μM）中，至少连续传代3次（图4）。未转染的野生型（WT）类器官在两种条件下均死亡，而Axin1/2基因敲除的类器官由于Wnt通路的下游激活，在两种条件下均能存活；此外，Rnf43/Znrf3突变型类器官在缺乏R-spondin时仍可存活，但在IWP2存在时无法存活，因为IWP2会导致激活该通路所需的Wnt被耗尽。综上所述，这些结果表明，通过产生预期的类器官表型，可成功实现对这些旁系同源基因对的敲除。这些结果的详细信息已发表于Developmental Biology⁵。

图 1：含 4 个盒式结构的 CRISPR-串联体示意图。 4 个 gRNA-串联体载体的示意图，每个 400 bp 的盒式结构依次包含 U6 启动子、两段反向重复的 BbsI 位点（也标记为 BB）以及 gRNA 支架结构。在重排反应过程中，BbsI 位点被具有匹配突出端的 gRNA 片段取代，因而丢失。用于检测 gRNA 寡核苷酸正确插入的测序引物结合位点由蓝色箭头表示。Fwd = 正向引物，Rev = 反向引物，Link 1/2/3 = 连接区 1/2/3。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：串联体载体的代表性酶切图谱。（A）3个和4个gRNA串联体载体经EcoRI与BglII双酶切的结果。正确的酶切图谱以绿色对勾标记，仅含有1个或2个gRNA插入片段的载体则以红色叉号标记。第1泳道为作为阳性对照的4个gRNA串联体亲本载体的酶切结果（标记为“+”）；同样，第5泳道为3个gRNA串联体亲本载体的酶切结果，标记为“+”。（B）经BbsI酶切的结果，显示未被切割的串联体载体的正确大小（由绿色对勾指示）。含有gRNA且已丢失BbsI酶切位点的串联体载体作为阳性对照，标记为“+”。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：成功电穿孔肠类器官的代表性图像。转染GFP质粒有助于评估转染效率。电穿孔后约24小时，已可见含有少量细胞的类器官，若电穿孔操作成功，其中多达70%的类器官呈现绿色荧光。BF = 明场，GFP = 绿色荧光蛋白。比例尺 = 2,000 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：突变型肠类器官的代表性图像。 敲除Wnt信号通路的负调控因子Axin1和Rnf43及其同源物后，肠类器官对生长因子剥夺具有抗性。具体而言，Axin1/2基因敲除类器官（Axin1/2 KO）在缺乏R-spondin（EN：EGF + Noggin）和Wnt（EN + IWP2：EN + Porcupine抑制剂）的条件下仍能生长，而Rnf43/Znrf3突变类器官（R&Z KO）仅能在缺乏R-spondin（EN）的条件下存活。相比之下，野生型（WT）类器官仅能在对照培养条件（WENR + Nic：Wnt + EGF + Noggin + R-spondin + Nicotinamide）下存活。比例尺 = 1,000 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

基础培养基		备注
4 °C 保存 4 周
细胞培养基	500 mL	参见材料表
L-谷氨酰胺 100x	5 mL
缓冲剂 1 M	5 mL	参见材料表
青霉素-链霉素 100x	5 mL
WENR + Nic（Wnt + EGF + Noggin + R-spondin + 尼克酰胺）
4 °C 保存 2 周
基础培养基	至多 50 mL
神经细胞无血清添加剂（50x）	1 mL	参见材料表
神经细胞无血清添加剂（100x）	500 μL	参见材料表
N-乙酰半胱氨酸（500 mM）	125 μL
小鼠 EGF（100 μg/mL）	25 μL
小鼠 Noggin（100 μg/mL）	50 μL
R-Spondin 条件培养基	5 mL
Wnt3a 条件培养基	25 mL
尼克酰胺（1 M）	250 μL
EN + CHIR + Y-27632（EGF + Noggin + CHIR + Y-27632）
4 °C 保存 2 周
不含青霉素-链霉素的基础培养基	至多 20 mL
神经细胞无血清添加剂（50x）	400 μL	参见材料表
神经细胞无血清添加剂（100x）	200 μL	参见材料表
N-乙酰半胱氨酸（500 mM）	50 μL
小鼠 EGF（100 μg/mL）	10 μL
小鼠 Noggin（100 μg/mL）	20 μL
Y-27632（10 μM）	20 μL
CHIR99021（8 μM）	10 μL
EN（EGF + Noggin）
4 °C 保存 4 周
基础培养基	至多 50 mL
神经细胞无血清添加剂（50x）	1 mL	参见材料表
神经细胞无血清添加剂（100x）	500 μL	参见材料表
N-乙酰半胱氨酸（500 mM）	125 μL
小鼠 EGF（100 μg/mL）	25 μL
小鼠 Noggin（100 μg/mL）	50 μL

表2：类器官培养基成分。

讨论

在本实验方案中，我们详细阐述了生成CRISPR串联体（CRISPR-concatemers）并将其应用于小鼠肠道类器官以同时敲除多个基因的全部步骤。如前所述，该策略具有多项优势，例如操作快速、效率高且成本效益好。

为了成功完成整个实验流程，需要考虑几个关键因素。首先，所有 gRNA 寡核苷酸必须正确退火并磷酸化，因为它们是 BbsI 克隆反应的起始材料，而该克隆反应本身效率很高。其次，在对类器官进行电穿孔时，每个条件所使用的细胞数量越多，可能达到的最大转染效率就越高。此外，在细胞解离后，应以小细胞团簇为主，而非单个细胞。

然而，在首次尝试克隆或转染时，可能会遇到技术问题；如果在gRNA克隆过程中出现问题，建议重新核对gRNA寡核苷酸序列，若序列正确，则应选择更多的细菌菌落进行限制性酶切筛选。如果电穿孔后转染效率低且细胞存活率差，则建议重复实验，增加每种条件下使用的细胞数量，并将细胞解离时间缩短至3分钟。

尽管CRISPR串联体的构建相对廉价且简便，但在类器官中进行大规模遗传筛选却并非如此，因为其规模受限于类器官培养的成本及其劳动密集型特性。在此需要指出的是，CRISPR串联体方法也可用于细胞系，例如HEK293细胞和小鼠胚胎干细胞。

无论采用何种细胞体系，当旨在同时敲除三个或四个不同基因时，该策略的另一个潜在缺点可能会显现。例如，每条gRNA的靶向效率各不相同，同时成功靶向所有基因的概率可能相对较低；因此，建议采用串联体系统，以引导多条gRNA针对同一基因。

近年来，已提出多种基于Golden Gate片段重排的替代策略，用于构建多重gRNA载体^7,8。然而，在我们的方法中，可在一轮克隆过程中将多个gRNA直接组装到单个逆转录病毒载体中，因此适用于构建靶向同源基因的gRNA文库。

我们的CRISPR串联体构建在MSCV逆转录病毒载体骨架中。因此，含有gRNA串联体的逆转录病毒可用于建立稳定过表达gRNA的细胞系。当与可诱导的Cas9系统联合使用时，可利用该系统实现可诱导的同源基因敲除。

总之，本文介绍了如何在一步反应中将多达四种不同的gRNA克隆至同一载体中，并阐述了如何将该策略应用于类器官培养，实现高效转染。此外，我们还提供了若干实用建议，以最大限度地提高整个实验流程的成功几率。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
优化的CRISPR设计工具	Feng Zhang团队		CRISPR gRNA设计工具；http://crispr.mit.edu/
Webcutter 2.0			限制性酶切图谱分析工具；http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/
T4 PNK（多核苷酸激酶）	新英格兰生物实验室	M0201L
T4 DNA连接酶缓冲液	新英格兰生物实验室	M0202S
T7 DNA连接酶	新英格兰生物实验室	M0318L
DTT（二硫苏糖醇）	Promega	P1171
ATP（三磷酸腺苷）	新英格兰生物实验室	P0756S
FastDigest BbsI (BpiI)	赛默飞世尔科技	FD1014
Tango缓冲液（含BSA的限制性内切酶缓冲液）	赛默飞世尔科技	BY5
BglII	新英格兰生物实验室	R0144
EcoRI	新英格兰生物实验室	R0101
质粒安全外切酶	Cambio	E3101K
热循环仪	应用生物系统	4359659
10G感受态大肠杆菌	剑桥生物科技	60108-1
质粒小提试剂盒	Qiagen	12125
台式微量离心机	Eppendorf	UY-02580-01
接种环	Microspec	PLS5
细菌培养箱	三洋	MIR-262
LB液体培养基（Luria-Bertani肉汤）	Sigma-Aldrich	L3522
琼脂糖	Sigma-Aldrich	A4718
琼脂糖凝胶电泳装置	Bioneer	A-7020
高级DMEM/F12（细胞培养基）	Invitrogen	12634-034
Glutamax（L-谷氨酰胺）100倍	Invitrogen	35050-068
HEPES 1 M（缓冲剂）	Invitrogen	15630-056
青霉素-链霉素 100倍	Invitrogen	15140-122
B27添加剂（神经元细胞无血清添加剂）50倍	Invitrogen	17504-044
N2添加剂（神经元细胞无血清添加剂）100倍	Invitrogen	17502-048
N-乙酰半胱氨酸 500 mM	Sigma-Aldrich	A9165-5G
小鼠EGF 500 µg/mL	Invitrogen Biosource	PMG8043
小鼠Noggin 100 µg/mL	Peprotech	250-38
烟酰胺 1 M	Sigma	N0636
R-Spondin条件培养基	n.a.	n.a.	由HEK293细胞自行制备，详情参见Sato和Clevers 2013
Wnt条件培养基	n.a.	n.a.	由HEK293细胞自行制备，详情参见Sato和Clevers 2013
Y-27632 10 µM	Sigma-Aldrich	Y0503-1MG
标准BD Matrigel基质	BD Biosciences	356231
48孔板	Greiner Bio One	677980
CHIR99021	Sigma-Aldrich	A3734-1MG
IWP-2	Cell Guidance Systems	SM39-10
TrypLE（重组蛋白酶）	Invitrogen	12605-010
Opti-MEM（低血清培养基）	Life technologies	51985-034
电穿孔比色皿（2 mm间隙）	NepaGene	EC-002S
低吸附15 mL离心管	Sigma-Aldrich	CLS430791
Bürker’s计数室	Sigma-Aldrich	BR719520-1EA
NEPA21超级电穿孔仪	NepaGene	联系供应商
Protein LoBind低吸附管	赛默飞世尔科技	10708704
BTXpress电穿孔缓冲液	哈佛仪器	45-0805
DMSO（二甲基亚砜）	AppliChem	A3672