方法文章

逆转录病毒扫描：绘制MLV整合位点以界定细胞特异性调控区域

7.8K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/55919

⸱

2017年5月28日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Genome Research, Department of Life Sciences, University of Modena and Reggio Emilia, 2Laboratory of Chromatin and Gene Regulation During Development, Imagine Institute, 3Institute for Biomedical Technologies, CNR, 4Généthon, 5Sorbonne Paris Cité - Université Paris Descartes

本文内容

摘要

本文介绍一种在人类细胞中对基于莫洛尼鼠白血病病毒的逆转录病毒载体整合位点进行全基因组定位的实验方案。

摘要

基于莫洛尼鼠白血病（MLV）病毒的逆转录病毒载体主要整合到乙酰化的增强子和启动子区域。因此，mLV整合位点可作为活性调控元件的功能性标记。本文介绍了一种逆转录病毒扫描工具，可用于全基因组范围内鉴定细胞特异性的增强子和启动子。简言之，用mLV衍生的载体转导目标细胞群体，随后用一种高频切割的限制性内切酶消化基因组DNA。在将基因组片段与相容的DNA接头连接后，通过接头介导的聚合酶链式反应（LM-PCR）扩增病毒与宿主基因组的连接区域。对扩增产物进行高通量测序，以确定mLV全基因组范围的整合图谱。最后，通过定义反复出现的整合簇，识别负责激活细胞类型特异性转录程序的细胞特异性调控区域。

逆转录病毒扫描技术可实现对前瞻性分离的目标细胞群体中细胞特异性启动子和增强子的全基因组范围鉴定。值得注意的是，逆转录病毒扫描是一种关键的技术手段，可用于回溯性鉴定那些缺乏可靠标记物、难以通过前瞻性方法分离的稀有细胞群体（例如 体细胞干细胞）。

引言

细胞身份由特定基因集合的表达决定。顺式调控元件（如启动子和增强子）在激活细胞类型特异性转录程序中起着关键作用。这些调控区域具有特定的染色质特征，例如特殊的组蛋白修饰、转录因子及其共因子的结合以及染色质可及性，这些特征已被广泛用于在多种细胞类型中全基因组水平地鉴定调控元件1,2,3。特别是，组蛋白H3第27位赖氨酸乙酰化（H3K27ac）的全基因组分布常被用于界定活性启动子、增强子以及超级增强子4,5,6。

莫洛尼鼠白血病病毒（MLV）是一种γ-逆转录病毒，广泛用于哺乳动物细胞的基因转移。感染靶细胞后，该逆转录病毒的RNA基因组被逆转录为双链DNA分子，并结合病毒和细胞蛋白，组装成前整合复合物（PIC）。PIC进入细胞核并与宿主细胞染色质结合。在此过程中，作为PIC关键组分的病毒整合酶介导前病毒DNA插入宿主细胞基因组。mLV在基因组DNA中的整合并非随机，而是以细胞类型特异性的方式，偏好发生在启动子和增强子等活跃的顺式调控元件区域7,8,9,10。这种特殊的整合模式由mLV整合酶与细胞内的含溴结构域和额外末端结构域（BET）蛋白之间的直接相互作用所介导11,12,13。BET蛋白（BRD2、BRD3和BRD4）在宿主染色质与mLV前整合复合物之间起桥梁作用：其溴结构域可识别高度乙酰化的顺式调控区域，而额外末端结构域则与mLV整合酶发生相互作用11,12,13。

本文介绍了逆转录病毒扫描技术，这是一种基于小鼠白血病病毒（mLV）整合特性来绘制活性顺式调控区域的新工具。简言之，利用表达增强型绿色荧光蛋白（eGFP）报告基因的mLV来源逆转录病毒载体对细胞进行转导。在提取基因组DNA后，通过连接介导的PCR（LM-PCR）扩增mLV载体3'长末端重复序列（LTR）与基因组DNA之间的连接区域，并进行大规模测序。将mLV整合位点比对至人类基因组，整合位点高度富集的基因组区域被定义为mLV整合位点簇。

逆转录病毒扫描技术被用于定义多种人类原代细胞中的细胞特异性活性调控元件14,15。mLV簇与表观遗传学定义的启动子和增强子共定位，其中大多数含有活性组蛋白标记（如H3K27ac），并具有细胞特异性。逆转录病毒扫描能够在前瞻性分离的细胞群体中实现全基因组范围的DNA调控元件鉴定7,14，同时也适用于缺乏有效标记物进行前瞻性分离的回顾性定义细胞群体（如角质形成细胞干细胞）15。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 人类细胞的MLV转导

  1. 分离目标细胞，并使用携带 eGFP 报告基因且伪型化为水疱性口炎病毒G蛋白（VSV-G）或兼嗜性包膜糖蛋白的mLV来源逆转录病毒载体进行转导16.
    1. 将未转导的细胞作为后续分析的阴性对照。由于基于mLV的逆转录病毒载体可高效转导正在分裂的细胞，因此需将靶细胞群体培养在能够刺激细胞分裂的条件下。每种研究细胞类型的转导条件均需单独优化。有关人造血祖细胞、T细胞和表皮细胞的细胞生长与转导条件详见参考文献7、14、15和17。
  2. 转导48小时后，将100,000个细胞重悬于 300 μL 含2%胎牛血清的磷酸盐缓冲液（PBS）中，通过流式细胞术分析（488 nm激发激光）检测eGFP表达。以未转导细胞作为阴性对照。为获得最佳整合位点回收效果，分选GFP阳性细胞+ 通过荧光激活细胞分选（FACS）对细胞进行分选。
  3. 收集0.5至500万个细胞用于基因组DNA制备。延长培养时间（>7 天）更有利于稀释未整合的前病毒，在分析长期子代时尤为必要 真正有效的 干细胞（参见 讨论部分 和参考文献15). 细胞沉淀可进行速冻，并于 -80 °C 直至使用。

2. 通过连接介导的PCR（LM-PCR）扩增mLV整合位点

  1. 基因组DNA（gDNA）的制备
    1. 使用基于柱的DNA提取试剂盒，按照制造商提供的说明书中的培养细胞操作步骤提取gDNA。
  2. 限制性内切酶消化
    1. 在1.5 mL离心管中为每个样本设置4个限制性内切酶消化反应。在每个反应管中加入0.1至1 μg gDNA、1 µL Tru9I（10U）和1 µL Buffer M，最终体积为10 µL。在65 °C孵育6小时或过夜。
    2. 向每个反应中加入1 µL PstI（10U）、1 µL Buffer H和8 µL水。在37 °C孵育6小时或过夜。样品可于-20 °C保存至后续使用。
  3. 接头连接
    1. 在1.5 mL离心管中通过混合正链与负链寡核苷酸制备100 μM Tru9I接头储备液，使两种寡核苷酸终浓度均为100 μM。将离心管置于100 °C水浴中，随后在室温下自然冷却。Tru9I接头储备液可于-20 °C保存至后续使用。
    2. 在1.5 mL离心管中设置8个接头连接反应。每个反应中向10 µL限制性内切酶消化产物加入以下组分：1.4 µL 10X T4 DNA连接酶反应缓冲液、1 µL 10 μM Tru9I接头、1 µL（2,000U）T4 DNA连接酶和0.6 µL水。在16 °C孵育3至6小时。样品可于-20 °C保存至后续使用。
  4. 第一轮PCR
    1. 在0.2 mL离心管中设置48个PCR反应（每个连接反应管取6个反应）。每个PCR反应中向2 µL连接产物加入以下试剂：5 µL 10X PCR缓冲液、2 µL 50 mM硫酸镁、1 µL 10 mM脱氧核苷三磷酸（dNTP）混合物、1 µL 10 μM接头引物、1 µL 10 μM mLV-3' LTR引物、0.3 µL（1.5U）Taq DNA聚合酶和37.7 µL水。引物序列见表1。
    2. 在带加热盖的PCR仪中进行PCR扩增，程序如下：95 °C预变性2分钟；25个循环（95 °C变性15秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸1分钟）；72 °C最终延伸5分钟；4 °C保存。样品可于-20 °C保存至后续使用。
  5. 第二轮PCR
    1. 在0.2 mL离心管中设置48个PCR反应（每个“第一轮PCR”管取1个反应）。每个PCR反应中向2 µL第一轮PCR产物加入以下组分：5 µL 10X PCR缓冲液、2 µL 50 mM硫酸镁、1 µL 10 mM dNTP混合物、1 µL 10 μM嵌套接头引物、1 µL 10 μM mLV-3' LTR嵌套引物、0.3 µL Taq DNA聚合酶（1.5 U）和37.7 µL水。使用针对所选高通量测序平台设计的嵌套引物：（i）适用于Illumina平台的嵌套接头引物和mLV-3' LTR嵌套引物；（ii）适用于Roche平台的嵌套接头引物和mLV-3' LTR嵌套引物。引物序列列于表1中。
    2. 在带加热盖的PCR仪中进行PCR扩增，程序如下：95 °C预变性2分钟；25个循环（95 °C变性15秒，58 °C退火30秒，72 °C延伸1分钟）；72 °C最终延伸5分钟；4 °C保存。样品可于-20 °C保存至后续使用。
    3. 将48个嵌套PCR反应产物汇集至一个15 mL离心管中（最终体积约2.4 mL）。样品可于-20 °C保存至后续使用。
  6. 通过琼脂糖凝胶电泳检测LM-PCR产物的存在及其大小。
    1. 向20 µL LM-PCR产物中加入4 µL上样缓冲液，与100 bp DNA标记物一同上样至1%琼脂糖凝胶。以5 V/cm电压电泳30至60分钟，通过溴化乙锭染色观察PCR产物。
    2. 以未转导样本的LM-PCR反应作为阴性对照进行电泳。
  7. 向扩增产物中加入0.1倍体积的醋酸钠溶液（3 M；pH 5.2）和2.5倍体积的100%乙醇进行沉淀。混匀后于-80 °C冷冻20分钟。
    1. 在4 °C下以标准微量离心机最大转速离心20分钟。弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀。在4 °C下再次以最大转速离心5分钟。
    2. 弃去上清液，将沉淀在空气中干燥。加入200 µL PCR级水重悬DNA。样品可于-20 °C保存至后续使用。
  8. 向100 µL LM-PCR产物中加入20 μL上样缓冲液，与100 bp DNA标记物一同上样至1%琼脂糖凝胶。
    1. 以5 V/cm电压电泳30至60分钟，切下含有150至500 bp扩增片段的凝胶区域。
    2. 使用基于柱的凝胶回收试剂盒纯化LM-PCR产物，并用紫外分光光度计测定浓度。
  9. 取1 µL文库，按照制造商说明书使用生物分析仪检测LM-PCR产物的长度。
  10. 扩增片段的鸟枪法克隆
    1. 取20 ng纯化的LM-PCR产物，按照制造商说明书将其克隆至pCR2.1-TOPO载体中。
    2. 使用M13通用引物进行测序反应，随后对所得序列进行基因组定位分析，以检测>50%克隆中是否存在病毒-基因组连接区（包括mLV-3' LTR嵌套引物），从而筛选适合进行高通量测序的样本。病毒-基因组连接区示例如下：
      彩色编码的遗传序列DNA序列分析，文本表示。
      MLV-3' LTR嵌套引物454和接头嵌套引物454（表1）以粗体标出，病毒LTR的3'端以斜体标出。人类基因组序列以红色文本高亮（chr10:6439408-6439509, hg19）。

3. mLV整合位点的大规模测序

注意：LM-PCR 产物可通过商业测序平台进行测序（在第二次 PCR 反应中选择合适的巢式引物对，参见第 2.5.1 小节）。若使用 Roche GS-FLX 焦磷酸测序平台进行测序，请参考先前的研究文献7,14,15。本节将介绍一种新优化的适用于 Illumina 测序平台的实验方案。

  1. 文库制备
    1. 为每个样本在 0.2 mL 管中设置 1 个加接头 PCR 反应。在每管中，向 5 µL（150–170 ng）纯化的 LM-PCR 产物中加入以下试剂：5 µL Index Primer 1、5 µL Index Primer 2、25 µL 2X Master Mix 和 10 µL PCR 级水。每个样本使用不同的接头组合。
    2. 在带有加热盖的 PCR 仪中进行 PCR 反应，程序如下：95 °C 预变性 3 min；8 个循环：95 °C 变性 30 s，55 °C 退火 30 s，72 °C 延伸 30 s；72 °C 延伸 5 min；4 °C 保存。
    3. 使用固相可逆固定（SPRI）磁珠法纯化 PCR 产物：在新的 1.5 mL 管中，向每个样本加入 56 µL 磁珠，按生产商说明书操作。用 25 µL 10 mM Tris-HCl 洗脱。文库可在 -20 °C 保存，直至使用。
  2. 文库检测
    1. 取 1 µL 样本，使用生物分析仪检测文库片段大小。
    2. 取 1 µL 样本，根据生产商说明书，使用基于荧光的实时 PCR 方法定量文库的摩尔浓度。
  3. 文库稀释与测序
    1. 使用 10 mM Tris-HCl 将文库稀释至 10 nM。若需混合多个文库，取每种稀释后文库各 5 µL 加入新的 1.5 mL 管中，再用 10 mM Tris-HCl 将混合文库稀释至 4 nM。
    2. 在新的 1.5 mL 管中，将 5 µL 稀释后的混合文库与 5 µL 0.2 N NaOH 混合，短暂涡旋，离心，室温孵育 5 min 以变性文库。
    3. 将管置于冰上，加入 990 µL 预冷的杂交缓冲液（HT1）。取 300 µL 变性后的混合文库转移至新的 1.5 mL 管，加入 300 µL 预冷的 HT1，得到终浓度为 10 pM 的文库混合液。
    4. 同时，在 1.5 mL 管中将 2 µL PhiX 控制文库（10 nM）与 3 µL 10 mM Tris-HCl 混合。加入 5 µL 0.2 N NaOH，短暂涡旋，离心，室温孵育 5 min 以变性稀释后的 PhiX。将管置于冰上，加入 990 µL 预冷的 HT1。
    5. 取 300 µL 变性后的 PhiX 文库转移至新的 1.5 mL 管，加入 300 µL 预冷的 HT1，得到终浓度为 10 pM 的 PhiX 溶液。
    6. 在新的 1.5 mL 管中，将 510 µL 变性后的文库混合液与 90 µL 变性后的 PhiX 文库混合，最终获得含 15% PhiX 控制的 10 pM 混合文库。
    7. 将上述 600 µL 样品加入已解冻的测序试剂盒的“加载样品”储液槽中，立即启动单端 150 个循环的测序运行。
      注：本实验方案所需的关键试剂与引物序列见表 1。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

逆转录病毒扫描程序的工作流程

逆转录病毒扫描流程的工作示意图见图1。首先纯化目标细胞群体，并用表达eGFP报告基因的基于mLV的逆转录病毒载体进行转导。该转基因两侧为两个相同的长末端重复序列（5'和3' LTR），可确保病毒基因组的合成、逆转录及其整合到宿主DNA中。通过FACS分析eGFP的表达水平来评估转导效率。选择mLV转导细胞比例较高（>30%）的细胞群体进行扩增，随后裂解细胞以提取包含整合的mLV病毒序列的基因组DNA。基因组DNA经酶切消化后，连接兼容性接头，并通过LM-PCR扩增病毒3' LTR与宿主基因组之间的连接区域。随后，利用Roche或Illumina测序平台对病毒与宿主基因组的连接位点进行高通量测序。最后，将mLV整合位点比对至人类基因组，以确定反复插入位点的基因组簇。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本文描述了一种用于全基因组范围内定位小鼠白血病病毒（mLV）整合位点的实验方案，mLV 是一种靶向染色质区域的逆转录病毒，倾向于整合至表观遗传标记为活性启动子和增强子的区域。该方案的关键步骤和/或局限性包括：（i）mLV 对靶细胞群体的转导；（ii）通过连接介导的PCR（LM-PCR）扩增病毒-宿主连接区域；（iii）高效回收大量整合位点。基于mLV的逆转录病毒载体可高效转导分裂期细胞。然而，其对非分裂细胞（例如有丝分裂后的神经元细胞）转导效率较低，是本技术的一个潜在局限。不过，可通过根据报告基因（例如 eGFP）的表达情况对转导细胞进行分选来克服这一问题。LM-PCR 产生的扩增子长度相对较短（150 至 500 bp），这是必要的，以构建适用于当前高通量测序策略的文库，并实现对 mLV 整合位点的全基因组范围的全面分析。例如，若 LM-PCR 扩增出长度 >500 bp 的产物，可能源于基因组 DNA 的不完全消化，或 Tru9I 酶切后基因组片段的分子内连接，这一点已通过 LM-PCR 扩增子的鸟枪法克隆分析得到验证（数据未显示）。在前一种情况下，可通过进一步优化基因组 DNA 的消化条件来解决；而在后一...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了欧洲研究理事会（ERC-2010-AdG，GT-SKIN）、意大利教育、大学和研究部（FIRB-Futuro in Ricerca 2010-RBFR10OS4G、FIRB-Futuro in Ricerca 2012-RBFR126B8I_003、EPIGEN 表观基因组旗舰项目）、意大利卫生部（2011年青年研究人员项目 GR-2011-02352026）以及巴黎伊马金研究所基金会（法国巴黎）的资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
PBS，pH 7.4ThermoScientific10010031或同类产品
胎牛血清ThermoScientific16000044或同类产品
0.2 ml 离心管通用实验室供应商
1.5 ml 离心管通用实验室供应商
QIAGEN QIAmp DNA mini Kit QIAGEN51306或同类产品
T4 DNA 连接酶 New England BioLabsM0202T
T4 DNA 连接酶反应缓冲液New England BioLabsM0202T
连接子正链寡核苷酸通用实验室供应商5’-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’ （纯化级别：SDS-PAGE）
连接子负链寡核苷酸通用实验室供应商5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’（纯化级别：SDS-PAGE）
Tru9IRoche-Sigma-Aldrich11464825001
SuRE/Cut Buffer MRoche-Sigma-Aldrich11417983001
PstI Roche-Sigma-Aldrich10798991001
SuRE/Cut Buffer HRoche-Sigma-Aldrich11417991001
Platinum Taq DNA 高保真聚合酶 Invitrogen11304011
10 mM dNTP 混合液Invitrogen18427013或同类产品
PCR 级水通用实验室供应商
96 孔热循环仪（带加热盖）通用实验室供应商
连接子引物通用实验室供应商5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’（纯化级别：PCR 级）
MLV-3’ LTR 引物通用实验室供应商5’-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3’（纯化级别：PCR 级）
连接子嵌套引物 454通用实验室供应商5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC]（纯化级别：SDS-PAGE）
MLV-3’ LTR 嵌套引物 454通用实验室供应商5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC]（纯化级别：SDS-PAGE）
连接子嵌套引物 Illumina通用实验室供应商5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC]（纯化级别：SDS-PAGE）
MLV-3’ LTR 嵌套引物 Illumina通用实验室供应商5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC]（纯化级别：SDS-PAGE）
乙酸钠溶液（3 M），pH 5.2通用实验室供应商
分子生物学级无水乙醇Sigma-AldrichE7023或同类产品
Topo TA 克隆试剂盒（含 pCR2.1-TOPO 载体）InvitrogenK4500-01
QIAquick 凝胶回收试剂盒QIAGEN28704
琼脂糖Sigma-AldrichA9539或同类产品
溴化乙锭 Sigma-AldrichE1510或同类产品
100 bp DNA MarkerInvitrogen15628019或同类产品
6x 上样缓冲液ThermoScientificR0611或同类产品
NanoDrop 2000 紫外-可见分光光度计ThermoScientificND-2000
Nextera XT Index 试剂盒IlluminaFC-131-1001 或 FC-131-1002
2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix KAPA BiosystemsKK2601
适用于 2 ml 管的 Dynal 磁力架Invitrogen12321D或同类产品
Agencourt AMPure XP 60 ml 试剂盒Beckman Coulter GenomicsA63881
Tris-HCl 10 mM，pH 8.5通用实验室供应商
Agilent 2200 TapeStation 系统Agilent TechnologiesG2964AA或同类产品
D1000 ScreenTapeAgilent Technologies5067-5582或同类产品
D1000 试剂Agilent Technologies5067-5583或同类产品
KAPA 文库定量试剂盒（适用于 Illumina 平台，ABI Prism）KAPA BiosystemsKK4835
ABI Prism 7900HT 快速实时荧光定量 PCR 系统Applied Biosystems4329003
1.0 N NaOH，分子生物学级通用实验室供应商
HT1（杂交缓冲液）Illumina 包含于 MiSeq 试剂盒中
MiSeq 试剂盒 v3（150 个循环）IlluminaMS-102-3001
MiSeq 系统IlluminaSY-410-1003
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001

参考文献

  1. Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
  2. Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions. Nat Rev Genet. 15 (4), 272-286 (2014).
  3. Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  4. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  5. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  6. Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
  7. Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites identifies active regulatory elements in human multipotent hematopoietic progenitors. Blood. 116 (25), 5507-5517 (2010).
  8. Biasco, L., et al. Integration profile of retroviral vector in gene therapy treated patients is cell-specific according to gene expression and chromatin conformation of target cell. EMBO Mol Med. 3 (2), 89-101 (2011).
  9. De Ravin, S. S., et al. Enhancers are major targets for murine leukemia virus vector integration. J Virol. 88 (8), 4504-4513 (2014).
  10. LaFave, M. C., et al. mLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters. Nucleic Acids Res. 42 (7), 4257-4269 (2014).
  11. Gupta, S. S., et al. Bromo- and extraterminal domain chromatin regulators serve as cofactors for murine leukemia virus integration. J Virol. 87 (23), 12721-12736 (2013).
  12. Sharma, A., et al. BET proteins promote efficient murine leukemia virus integration at transcription start sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 12036-12041 (2013).
  13. De Rijck, J., et al. The BET family of proteins targets moloney murine leukemia virus integration near transcription start sites. Cell reports. 5 (4), 886-894 (2013).
  14. Romano, O., et al. Transcriptional, epigenetic and retroviral signatures identify regulatory regions involved in hematopoietic lineage commitment. Sci Rep. 6, 24724(2016).
  15. Cavazza, A., et al. Dynamic Transcriptional and Epigenetic Regulation of Human Epidermal Keratinocyte Differentiation. Stem Cell Reports. 6 (4), 618-632 (2016).
  16. Miller, A. D., Law, M. F., Verma, I. M. Generation of helper-free amphotropic retroviruses that transduce a dominant-acting, methotrexate-resistant dihydrofolate reductase gene. Mol Cell Biol. 5 (3), 431-437 (1985).
  17. Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites defines the fate of allogeneic T cells after donor lymphocyte infusion. PLoS One. 5 (12), e15688(2010).
  18. Aiuti, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151(2013).
  19. Biffi, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy benefits metachromatic leukodystrophy. Science. 341 (6148), 1233158(2013).
  20. Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
  21. Gillet, N. A., et al. The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infected T-cell clones. Blood. 117 (11), 3113-3122 (2011).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

PCR DNA

相关文章