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基于半自动纵向显微计算机断层扫描的裸鼠骨质疏松相关椎体骨折模型定量结构分析

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DOI：

10.3791/55928

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2017年9月28日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Skeletal Biotech Laboratory, Hebrew University-Hadassah Faculty of Dental Medicine, 2Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 3Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 4Biomedical Imaging Research Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 5Department of Orthopedics, Cedars-Sinai Medical Center

本文内容

摘要

本实验方案旨在建立一种与骨质疏松相关的裸鼠椎体压缩性骨折模型，可用于长期纵向评估 体内 采用基于半自动微计算机断层扫描的定量结构分析方法。

摘要

骨质疏松相关性椎体压缩性骨折（OVCFs）是一种随着全球人口老龄化而日益普遍的常见临床难题，目前尚缺乏有效的治疗手段。动物OVCF模型对于转化性组织工程策略的临床前研究至关重要。尽管目前已存在多种模型，本实验方案描述了一种在单只裸鼠体内诱导多个高度可重复椎体缺损的优化方法。同时，本文还详细阐述了一种基于纵向半自动微计算机断层扫描（µCT）的定量结构分析新方法，用于评估椎体缺损。简而言之，对大鼠在术后多个时间点进行成像。将术后第1天的扫描图像重定向至标准位置，并定义标准感兴趣体积。随后每只大鼠的µCT扫描图像均自动与第1天的扫描图像配准，从而对同一感兴趣体积进行分析，以评估新骨形成情况。这种多功能方法可适用于多种其他模型，尤其适用于需要通过纵向影像分析实现精确三维半自动对齐的研究。综上所述，本方案建立了一种易于量化且高度可重复的骨质疏松与骨组织研究系统。建议的实验流程包括：在裸鼠去卵巢后约4个月诱导骨质疏松，随后根据组织大小和设备条件，耗时2.7至4小时完成两个椎体缺损的制备、成像及分析。

引言

全球有超过2亿人患有骨质疏松症1。其病理基础是骨矿物质密度（BMD）降低以及骨微结构改变，导致骨脆性增加，从而升高骨折的相对风险2。骨质疏松症的患病率极高，且对健康危害严重，世界卫生组织已将其列为重要的公共卫生问题。此外，随着全球人口老龄化趋势加剧，骨质疏松症预计将进一步增多。

骨质疏松性椎体压缩性骨折是最常见的脆性骨折，据估计在美国每年超过75万例。此类骨折与显著的发病率相关，并且死亡率可高达正常人群的9倍3。在临床试验中，目前可用的外科干预措施（如椎体成形术和椎体后凸成形术）被发现并不比假手术治疗更有效4,5，导致这些患者仅能接受疼痛管理。由于目前对OVCF的治疗手段有限，建立一种能够复制该疾病的动物模型显得尤为迫切6,7,8。此类动物模型有助于深入研究现有治疗方法，并推动可转化为临床实践的新型疗法的开发。已有研究通过低钙饮食（LCD）联合卵巢切除术在实验动物中成功诱导并维持骨质疏松状态1,9,10,11,12,13,14,15。为进一步模拟与OVCF相关的骨量丢失，研究人员已在具有免疫活性的骨质疏松大鼠中建立了椎体骨缺损模型16,17,18,19,20,21,22,23,24。本研究提出了一种免疫缺陷大鼠的椎体缺损模型，该模型模拟了骨质疏松状态。这一新型模型可用于评估基于细胞的治疗策略，例如利用不同来源和物种的干细胞修复具有挑战性的骨折（如OVCF）。

骨成像在骨折和骨病评估中具有重要作用。为准确评估骨结构变化及再生策略，已开发出多种先进的成像方法25。其中，µCT成像作为一种非侵入性、操作简便且成本较低的技术，可提供高分辨率的三维图像，已逐渐兴起。在评估骨质疏松症患者方面，µCT成像相较于其他成像方式具有多项优势，因其能够提供可进行定量分析的高分辨率三维骨微结构信息26。后者可用于比较不同治疗方案的疗效。事实上，in vivo µCT成像已被视为椎体缺损再生监测的金标准1,16,27。然而，目前仅有少数研究28,29,30,31采用自动化配准工具，以减少基于µCT成像分析中的人为依赖性、插值偏差和精度误差。近期，我们首次采用配准流程来改进标准化骨缺损中骨再生的分析，具体方法如本方案所述32。

本文所述方法可用于研究新型细胞疗法对OVCFs的影响，且不受宿主T细胞反应的干扰，从而避免异种或同种异体细胞被排斥。通过卵巢切除术（OVX）联合4个月的低钙饮食（LCD），可在年轻大鼠中诱导骨质疏松症。OVX大鼠的年轻年龄结合LCD处理使我们能够达到较低的峰值骨量，通过导致不可逆的骨量丢失，模拟绝经后骨质疏松症。这在部分程度上可解释为：在LCD期间及约3月龄时，大鼠腰椎部位的骨组织由建模阶段转入重塑阶段33，从而增加了骨质疏松状态长期维持的可能性。使用年轻动物使该模型更具成本效益，因其饲养成本较低。然而，该模型的局限性在于未能固有地反映衰老动物体内的生物学变化。

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方案

所有动物实验均在经西达斯-西奈医学中心机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案下进行（方案编号 #3609）。所有成像和手术操作均在麻醉下进行。所有动物的饲养均遵循经批准的IACUC方案。

注意：本方案的实验设计如图所示 图1购买六周龄、已手术切除卵巢的大鼠，饲喂含0.01%钙和0.77%磷酸盐的低钙饮食（LCD）。在低钙饮食喂养4个月后，在第四和第五腰椎椎体（L4-L5）处钻取临界尺寸的椎体缺损。手术后，在缺损建立后的第1天以及第2、4、8和12周对大鼠进行影像学扫描。在第1天的扫描图像上确定缺损边界，重新调整至标准位置，并定义一个圆柱形感兴趣体积（VOI）。随后自动配准各次µCT扫描即，对每只大鼠第2、4、8和12周的扫描图像，将其配准至对应第1天扫描所定义的标准位置。将第1天预定义的感兴趣体积（VOI）应用于配准后的扫描图像。评估VOI内的骨体积密度和表观密度。

1. 骨质疏松症的诱导

  1. 将六周龄的无胸腺去卵巢大鼠置于低钙饮食（LCD）中饲养4个月，饮食成分为0.01%钙和0.77%磷酸盐。
  2. 换回正常饮食。
    注：此后这些大鼠将被称为"骨质疏松大鼠"。

2. 椎体缺陷模型

注意：每只动物的操作时间为 40 - 50 分钟。

  1. 手术前对所有手术器械进行高压灭菌。
  2. 若需进行多台手术，须对所有手术器械进行灭菌。
    1. 清洗器械后，将其放入超声波清洗机中清洗5分钟。随后将器械置于设定为250 °C的热珠灭菌器中灭菌20秒。让器械冷却5分钟。
  3. 诱导麻醉。
    1. 将骨质疏松大鼠放入连接有中央废气清除系统的麻醉机的诱导室中。使用5%异氟烷（溶于100%氧气）诱导麻醉，并通过鼻罩以2–3%异氟烷维持麻醉。麻醉期间使用兽用眼膏涂抹眼睛，防止角膜干燥。
    2. 施加足趾夹捏刺激，以确认麻醉深度是否足够。若无反应，则可开始手术操作。
  4. 将麻醉后的大鼠仰卧于加热垫（37 °C）上，并使用磁性固定牵开系统固定四肢（图2A）。
    注意：加热垫的温度对于预防低体温至关重要，因为麻醉状态下的大鼠无法自主调节体温。
  5. 使用电动剃刀剃除腹部区域的毛发，随后依次用含碘消毒剂和0.5%葡萄糖酸氯己定擦拭，再用70%乙醇消毒。
  6. 在开始手术前，对大鼠皮下注射卡洛芬（5 mg/kg体重（BW），皮下（SQ））。
  7. 使用无菌手术刀切开皮肤。切口起始于剑突下方1 cm处，沿中线切开约5–8 cm（图2B）。
  8. 使用手术剪沿腹白线切开腱膜，以进入腹腔（图2C）。
  9. 使用牵开器暴露腹腔（图2D）。
  10. 将大鼠的肠管向右侧牵开，以暴露腹主动脉和左肾（图2E）。在暴露前，先触诊腰椎。为避免组织脱水，使用浸有无菌生理盐水的无菌纱布包裹内脏器官。
  11. 使用电热灼器逐层暴露腰椎L4-5椎体的前侧面，并将其与周围结缔组织和肌肉分离（图2F-G）。
    注意：解剖过程中应使用电热灼器控制出血。
  12. 使用浸有无菌生理盐水的无菌棉签清除L4椎体上的血液和残留组织。使用无菌环钻（直径约2 mm）在暴露的椎体前侧面中心钻出一个深5 mm的骨缺损（图2H-I）。
    注意：钻孔时应施加最小压力，仅穿透腹侧皮质骨及下方的松质骨；避免穿透背侧皮质骨。需注意骨质疏松大鼠的椎体极为脆弱。若存在出血，可用棉签清洁缺损区域并施加压力止血。
  13. 在L5椎体上重复步骤2.11，每只大鼠共制造两个骨缺损（图2J）。
  14. 将肠管复位至腹腔内。
  15. 使用合成可吸收缝线Vicryl（3-0未染色Vicryl，27" SH锥形针）连续缝合腱膜（图2K）。
  16. 使用4-0单股尼龙不可吸收缝线，采用间断缝合法关闭皮肤（图2L）。
  17. 在皮肤缝线及其间隙处涂抹100 µL皮肤表面粘合剂，以确保皮肤完全闭合。
  18. 皮下注射温热（37 °C）乳酸林格液（1 mL/100 g体重，皮下）以预防低体温和脱水。
  19. 在手术前及术后每8–12小时根据需要皮下注射布托啡诺（0.5 mg/kg体重，皮下）以缓解术后疼痛。
  20. 在动物未恢复足够意识以维持胸卧位前，不得无人看管。此外，接受手术的动物在完全恢复前不得与其他动物同笼饲养。
  21. 动物在加热垫上恢复后，将其放回笼中。
    注意：术后大鼠应单独饲养（即分别置于不同笼中），以防止相互撕咬缝线和伤口。
  22. 术后数天内，将浸水的饲料置于培养皿中并放置于笼底，以方便大鼠取食。
  23. 术后24小时起，根据需要每24小时皮下注射卡洛芬（5 mg/kg体重，皮下）以缓解疼痛。
  24. 术后10–14天，在2%异氟烷麻醉下拆除皮肤缝线。

3. 显微CT扫描

注意：每只动物的操作时间为 30 - 40 分钟。

  1. 手术后的第二天，将骨质疏松大鼠放入连接至带有中央废气清除系统的麻醉机的诱导室中。使用100%氧气混合5%异氟烷进行麻醉诱导，随后通过鼻罩以2–3%异氟烷维持麻醉。
  2. 使用以下设备扫描大鼠： 体内 µCT 扫描仪。重复扫描以进行骨再生的纵向分析。
    注意：确保所有动物均使用相同的设置进行扫描（即， X射线能量、扫描介质、强度、体素尺寸和图像分辨率）以及相似的取向。例如：X射线能量，55 kVp；电流，145 µA；体素尺寸，35 µm；步进间隔，115 µm；积分时间，200 ms；样品置于磷酸盐缓冲液（PBS）中。参见Bouxstein 等34 有关啮齿类动物微计算机断层扫描（µCT）用于骨微结构评估的进一步解释和注意事项。理想情况下，所有扫描均应采用可获得的最高分辨率；然而，高分辨率扫描需要更长的采集时间，产生庞大的数据集，并使动物暴露于更多的电离辐射。后者可能引发不良影响，包括骨折愈合能力下降。因此，应仔细权衡额外数据获取与扫描时间延长之间的利弊。

4. 椎体分离

注意：每个样品的处理时间为 20 - 30 分钟。

  1. 勾画目标椎体的轮廓，如图3A-I 所示。确保包含椎体的所有部分，同时排除属于相邻椎体的部分。
    1. 点击“µCT evaluation program"，然后从菜单中选择样本。
    2. 使用鼠标逐层勾画轮廓。
    3. 使用"Z" 轴滑块切换至下一层。
  2. 每隔几层点击"文件” → "保存 GOBJ"，将已勾画的椎体另存为独立文件（图3J-K）。

5. 纵向定量评估中感兴趣体积（VOI）的定义

注意：以下步骤取决于扫描是在术后第1天（参考椎体）还是在后续时间点（目标椎体）进行的。

  1. 参考椎体。
    注意：每个样本所需时间为 20 - 30 分钟。
    1. 对于 Z 轴旋转，使用缺陷中心处的 XY 切片测量边缘的角度（图 4A-B）。
      1. 在 Z 平面上，定位到缺陷最清晰的椎体区域，并截取该椎体的图像。
      2. 在演示软件中，准备一个可嵌入缺陷区域的矩形对象。
      3. 旋转椎体图像，使缺陷朝上，且缺陷边缘与矩形的边平行。
      4. 测量旋转角度（右键单击图像 → "设置图片格式" → "大小"）。
      5. 使用测得的角度对椎体进行旋转（图 4C）。
        1. 打开一个新的 DECterm 窗口（"会话管理器" → "应用程序" → "DECterm"）。
        2. 运行 "ipl"：
        3. Ipl> turn3d
        4. -input [in]>
        5. -output [out]>
        6. -turnaxis_angles [0.000 90.000 90.000]> 90 90 0
        7. -turnangle [0.000]> 测得的角度
        8. -img_interpol_option [1]>
    2. 对于 X 轴旋转，使用缺陷中心处的 YZ 切片测量边缘的角度（图 4D-E）。使用测得的角度对椎体进行旋转（图 4F）。
      1. 在 "uCT 评估程序" 中点击 "YZ"，并重复步骤 5.1.1.1–5.1.1.5.2。
      2. Ipl> isq
      3. -aim_name [in]>
      4. -isq_filename [default_file_name]> 输入 ISQ 文件目录（例如，"DK0:[MICROCT.DATA.GAZIT.MAXIM.80.DAY1]Z2102970.ISQ"）
      5. -pos [0 0 0]>
      6. -dim [-1 -1 -1]>
    3. 通过将 XY 平面更改为 ZX 平面，翻转已旋转的椎体。
      1. 打开一个新的 DECterm 窗口（"会话管理器" → "应用程序" → "DECterm"）。
      2. 运行 "ipl"：
      3. Ipl> flip
      4. -input [in] > out
      5. -input [out] > out2
      6. -new_xydir [yz] > zx
    4. 定义感兴趣体积（VOI）。
      1. 在 "uCT 评估程序" 中选择圆形轮廓图标，使用缺陷中心处的切片绘制缺陷的圆形轮廓（图 6A）。复制该轮廓并将其粘贴到缺陷的所有切片上（图 6B）。
        注意：由于所有缺陷均采用相同方法制备，因此应对所有样本分析相同数量的切片，进而获得总体积（TV）。
  2. 目标椎体。
    注意：每个样本所需时间为 10 - 20 分钟。
    1. 将目标椎体和参考椎体的 DICOM 文件加载至图像分析软件的主窗口。
      注意：为避免灰度值变化，在加载菜单中将输出数据类型设置为与原始 DICOM 文件相同。
    2. 与参考椎体进行配准。
      1. 启动 "3-D 体素配准" 模块，将参考椎体设为 "基准体积"，目标椎体设为 "匹配体积"。点击 "配准" 以完成椎体配准（图 5）。
    3. 使用相同的数据类型保存配准后的文件，并将其导入 µCT 环境。
    4. 应用 VOI。
      1. 通过点击 "uCT 评估程序" → "文件" → "加载 GOBJ"，选择先前创建的 GOBJ 文件，将为参考椎体定义的 VOI 应用于已配准的目标椎体。检查 VOI 与缺陷是否同心。

6. 微计算机断层扫描（MicroCT）分析

注意：每个样品的处理时间为 10 - 20 分钟。

  1. 使用 µCT 评估程序发送感兴趣体积（VOI）进行评估（图6）。
    注意：分析所有感兴趣体积时，必须使用相同的参数。确保阈值设置得足够高，以消除背景噪声，同时尽量减少骨组织的丢失。如果使用了放射性显影生物材料，可采用多种策略来分析骨形成。如果生物材料与骨组织之间存在密度差异，可将生物材料分割出去35,36。否则，研究人员可对实验组之间的骨形成差异进行定性评估。

7. 安乐死

  1. 将骨质疏松大鼠放入连接麻醉机的诱导室中，使用100%氧气混合5%异氟烷进行麻醉诱导。
  2. 通过鼻罩维持麻醉，并通过切开胸腔造成双侧气胸实施安乐死37。

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结果

采用本方案，可在不同时间点对 n = 8 个模拟骨质疏松性椎体缺损的再生情况进行成像和定量分析。通过配准程序获得的解剖结构匹配，使得在所有时间点均可对同一感兴趣体积（VOI）进行分析。即使原始缺损边缘已无法辨认，该方法仍可实现高度精确的纵向三维组织形态计量分析。我们以五个时间点（第1天、第2周、第4周、第8周和第12周）为例，展示骨再生的纵向评估过程（图7）。骨再生情况既可通过二维横截面和三维图像的定性评估（如 图7A 所示），也可通过骨量（BVD）和骨质（AD）的定量比较进行评估（图7B）。可测定新形成骨的以下形态计量指标：（i）总体积（TV），包括骨和软组织体积（TV，mm3）；（ii）矿化组织体积（BV，mm3）；（iii）骨体积密度（BV/TV）；以及（iv）骨矿物密度（BMD，mg 羟基磷灰石/cm3）。具体而言，在建立...

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讨论

骨质疏松症是由于脊柱负荷增加导致椎体压缩性骨折的最常见原因，进而引起椎体塌陷。然而，在啮齿类动物中几乎不可能制造出真正模拟类似椎体塌陷的损伤模型。因此，研究人员通常在椎体中心创建一个圆柱形缺损，以模拟骨质疏松性椎体压缩骨折（OVCFs）16,17,18,19,20,21,24,38,39。由于文献中对缺损大小尚无统一标准，本研究将临界尺寸缺损定义为术后3个月内未经干预无法自行完全愈合的缺损16...

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披露

本研究由加州再生医学研究所（CIRM）资助（项目编号：TR2-01780）。

致谢

本研究获得了加州再生医学研究所（CIRM）（TR2-01780）资助项目的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
异氟烷MWI动物健康，帕萨迪纳，加利福尼亚州501017
聚维酮碘溶液MWI动物健康，帕萨迪纳，加利福尼亚州4677
氯己定葡萄糖酸盐 2% 洗剂MWI动物健康，帕萨迪纳，加利福尼亚州510083
70%异丙醇-夸脱MWI动物健康，加利福尼亚州帕萨迪纳501044
卡洛芬MWI动物健康，帕萨迪纳，加利福尼亚州26357
布托啡诺 0.3 mg/mLMWI动物健康，帕萨迪纳，加利福尼亚州56163
卵巢切除的无胸腺裸鼠Harlan Laboratories，印第安纳波利斯，印第安纳州Hsd:RH-Foxn1 rnu
低钙食物Newco Distributors, Inc., CA1814948（5AV8 AIN-93M 含低钙）
磷酸盐缓冲液Life Technologies Corporation14190250
DermabondJ AND J ETHICONDHVM12
麻醉机Patterson ScientificTEC 3EX
滑动式顶部诱导室Patterson Scientific78917833
ProStation 加热工作站Patterson Scientific78914731
手术巾HALYARD HEALTH INC89101
磁性固定器牵开系统Fine Science Tools, Inc.，加利福尼亚州18200-50
解剖剪，10 cm，弯型，不锈钢世界精密仪器公司，佛罗里达州14394
虹膜剪，11.5 cm，45° °角形，锯齿状，尖端/双面锋利世界精密仪器公司，佛罗里达州503225
5号镊子世界精密仪器公司，佛罗里达州555048FT
微型蚊式止血钳世界精密仪器公司，佛罗里达州503360
无菌棉纱布美敦力，明尼阿波利斯，明尼苏达州9024
吸收矛——带支架/无菌Fine Science Tools，加利福尼亚州18105-01
1 mL注射器TERUMO TERUMO MEDSS-01T
25号针头BD MED SYS 注射系统305127
层流罩贝克SterilGARD e3-Class II Type A2 生物安全柜
热灼器世界精密仪器公司，佛罗里达州501292
Micro-Drill OmniDrill115/230V世界精密仪器公司，佛罗里达州503598
用于微型钻头的环钻，直径2 mmFine Science Tools，加利福尼亚州18004-20
3-0 未染色Vicryl 27” SH锥度J AND J ETHICON1663G
4-0 Ethilon 黑色 18” PC3 传统切割J AND J ETHICON1954G
锥束活体微计算机断层扫描（vivaCT 40）Scanco MedicalvivaCT 40
SCANCO Medical 微计算机断层扫描系统软件套件Scanco MedicalvivaCT 40
分析软件生物医学成像，梅奥诊所，明尼苏达州罗切斯特分析 12图像分析软件
兽医用眼膏

参考文献

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