半自动纵 Microcomputed Tomography-based 裸鼠骨质疏松症相关椎体骨折模型的定量结构分析

Summary

该协议的目的是产生一个裸鼠骨质疏松症相关的椎体压缩骨折模型, 可以纵向评价在体内使用半自动 microcomputed tomography-based 定量结构分析。

Abstract

与骨质疏松相关的椎体压缩骨折 (OVCFs) 是一种常见的和临床未满足的需要随着世界人口年龄的增加而患病率。动物 OVCF 模型对转化组织工程策略的临床前发展至关重要。虽然目前有许多模型存在, 该协议描述了一个优化的方法, 诱导多高度重现性脊柱缺损在一个单一的裸鼠。本文还详细介绍了一种基于纵向半自动 microcomputed 断层扫描 (µCT) 的椎体缺损定量结构分析方法。简单地, 老鼠在术后多时间点被成像。1天扫描被重新定向到标准位置, 定义了标准的兴趣量。随后对每只老鼠的µCT 扫描自动登记到1天扫描, 因此, 同样的兴趣量被分析, 以评估新的骨骼形成。这种通用的方法可以适应各种其他模型, 纵向 imaging-based 分析可以受益于精确的3D 半自动对准。在一起, 本议定书描述了一个容易量化和容易重现的系统骨质疏松和骨骼研究。建议的协议需要4月来诱导裸卵巢大鼠和2.7 和 4 h 之间的骨质疏松症的产生, 图像, 并分析两个椎体缺损, 取决于组织大小和设备。

Introduction

全世界有超过2亿人患有骨质疏松症¹。骨密度 (BMD) 和改变的骨微结构的潜在病理降低增加了骨脆性, 因此, 骨折的相对风险为²。骨质疏松症是如此普遍和有害健康, 世界卫生组织已确定它是一个重大的公共卫生问题。此外, 随着世界人口的老龄化, 骨质疏松症有望变得更加普遍。

骨质疏松性椎体压缩骨折是最常见的脆性骨折, 估计在美国每年超过75万。它们与显著的发病率和九倍高的死亡率³有关。在临床试验中, 目前可获得的手术干预, 如椎体成形术和成形, 被发现没有比假治疗更有效^4,5, 只留下疼痛管理可供这些患者使用。由于目前的 OVCF 治疗是有限的, 所以必须开发一种能够复制紊乱的动物模型^6,7,8。这种动物模型可以促进对目前治疗方法的研究和新疗法的发展, 将转化为临床实践。骨质疏松症已诱导和持续的模型动物通过管理的低饮食 (LCD) 与卵巢切除联合^{1,9,10,11,12,13,14,15}. 为进一步模型骨质疏松与 OVCFs, 椎体骨缺损建立了免疫大鼠的骨骼损伤 ^16,17,18,^{19, 20,21,22,23,24}。在这项工作中, 一个模型的免疫损伤大鼠骨质疏松症提出。这种新的模型可以用来评估细胞疗法涉及干细胞从各种来源和物种的修复有挑战性的骨折, 如 OVCFs。

骨显像是评价骨折和骨骼疾病的重要组成部分。为了准确评估结构骨的变化和再生策略, 开发了先进的成像方法²⁵。其中, µCT 成像已经成为一种非侵入性的、易用的、廉价的提供高分辨率3D 图像的方法。µCT 成像在评估骨质疏松症患者方面优于其他模式, 因为它提供高分辨率的3D 骨微体系结构²⁶ , 然后可以对其进行定量分析。后者可以用来比较治疗效果的建议治疗。事实上,在体内µCT 成像是一个金标准的脊椎缺损再生监测^1,16,27。但是, 很少有出版物^{28、29、30、31}使用了自动注册工具来最小化µCT 的用户依赖性、插值偏差和精度错误imaging-based 分析。最近, 我们是第一个使用注册程序, 以改善骨再生的标准化骨空洞的分析, 如本协议³²中所述。

本文所描述的方法可以用来研究新的细胞治疗 OVCFs 的效果, 不受宿主 T 细胞的反应, 可能拒绝异种或同种异体细胞。通过卵巢切除 (卵巢) 和4月的液晶显示器, 诱导幼鼠骨质疏松。年轻的卵巢鼠, 结合 LCD, 我们可以达到一个低峰值骨量, 模仿绝经后骨质疏松, 导致不可逆转的骨质流失。这可以解释部分原因是, 在 LCD 和大约3月的年龄, 大鼠从骨骼模型过渡到重建腰椎椎体的阶段³³, 从而增加了维持骨质疏松症的可能性时间.使用幼兽使这种模型更具成本效益, 因为它们成本更低。然而, 它是有限的内在不核算的生物变化的衰老动物。

Protocol

所有动物实验都是根据由雪松-西奈医疗中心的机构动物保育和使用委员会 (IACUC) 批准的协议执行的 (3609 号议定书)。麻醉是为所有的成像和手术程序。所有动物都按照批准的 IACUC 协议安置.

注意: 该协议的实验设计如图 1 所示。购买六周大的老鼠与他们的卵巢手术切除和饲料他们的 LCD 包括0.01% 钙和0.77% 磷酸盐。经过4月的 LCD, 钻 critical-size 脊椎缺损在第四和第五腰椎椎体 (L4-L5)。术后, 在1和周 2, 4, 8, 和12在缺损建立后, 图像的老鼠。在1天扫描中定位缺陷边距, 重新定向到标准位置, 并定义圆柱体的兴趣 (VOI)。自动注册后续和 #181; CT 扫描 ( 即 , 2、4、8和 12) 每只老鼠的标准位置为相应的天1扫描定义。将天1预定义的 VOI 应用于已注册的扫描。评估 VOIs 的骨量密度和表观密度.

1. 骨质疏松症的诱导

1. 将六周大的裸去势大鼠放在4月的 LCD 上, 由0.01% 钙和0.77% 磷酸酯组成.
2. 切换回正常饮食.
   注意: 这些老鼠将被称为和 #34; 骨质疏松大鼠和 #34; 以后.

2。椎体缺损模型

注意: 时间是每只动物的 40-50 分钟.

1. 在手术前使用所有手术工具.
2. 在多次手术的情况下, 对所有手术工具进行消毒.
   1. 清洗工具并将其放置在 sonicator 的浴缸中5分钟. 将它们放在一个热珠杀菌器设置为250和 #176; C 为二十年代. 允许工具冷却5分钟
3. 导致麻醉.
   1. 将骨质疏松的大鼠放在带有中央清理系统的麻醉机上的感应室中。用5% 氟烷100% 氧诱导麻醉, 通过鼻锥在 2-3% 异氟醚维持。用眼睛上的兽医药膏, 防止麻醉时的干燥.
   2. 采用脚趾夹紧刺激, 以确保有足够的麻醉平面。如果未注意到响应, 请启动该过程.
4. 将麻醉大鼠置于热垫 (37 和 #176; C) 的背卧床上, 并使用磁固定器缩回系统 ( 图 2A ) 伸展四肢.
   注意: 由于麻醉大鼠无法调节体温, 加热垫的温度对防止体温过低很重要.
5. 使用电动剃须刀剃须腹部区域。用 iodine-based 杀菌剂和葡萄糖酸氯己定 0.5%, 其次是70% 乙醇.
在开始手术前,
6. 将卡洛芬 (5 毫克/千克体重 (BW), 皮下 (平方)) 注入大鼠.
7. 使用无菌手术刀切割皮肤。开始切口 1 cm 在剑过程之下并且切开通过中线 (~ 5-8 cm) ( 图 2B ).
8. 使用外科剪刀使膜通过式阿尔巴切口进入腹腔 ( 图 2C ).
9. 使用器 ( 图 2D ) 公开腹腔.
10. 将肠道转移到鼠的右侧, 以暴露腹主动脉和左肾 ( 图 2E )。在进行暴露前, 触腰椎脊柱。为了避免脱水, 使用无菌浸泡纱布和无菌盐水溶液包裹内脏.
11. 使用 thermocautery 在层中暴露腰椎椎体的前部 L4-5, 并将其从周围的结缔组织和肌肉中分离出来 ( 图 2F -G )。 注意: 在解剖过程中, Thermocautery 应用于控制出血.
12. 用无菌生理盐水浸透无菌棉签, 去除 L4 椎骨的血液和残余组织。使用无菌环钻 (直径约2毫米) 钻5毫米深的骨缺损, 在椎体外露前部的中心 (图 2 h I).
    注: 仅通过腹侧皮质和基础小梁骨, 施加最小压力进行钻孔;避免钻过背部皮层。请注意, 骨质疏松的大鼠椎骨非常脆弱。使用棉签清洁缺陷, 并施加压力, 以止血, 如果存在.
13. 在 L5 椎骨上重复步骤2.11 以创建每只老鼠的总2缺陷 ( 图 2J ).
14. 将肠道恢复到腹腔.
15. 使用乔合成可吸收外科缝合线 (3-0 乔染色27和 #34; SH 锥) 以连续模式缝合膜 ( 图 2K ).
16. 用4-0 单丝尼龙吸收缝合在一个简单中断的模式下关闭皮肤 ( 图 2L ).
17. 应用100和 #181; 在皮肤缝合线上和它们之间的外用皮肤粘合剂的 L, 以确保完全关闭皮肤.
18. 用温水 (37 和 #176; C) 林格铃声和 #39 的解决方案 (1 毫升/100 g BW, 平方), 以防止低温和脱水.
在手术前, 用丁丙诺啡 (0.5 毫克/千克体重, 平方) 向老鼠注射, 每 8-12 小时, 在需要时进行术后疼痛缓解.
19. 在恢复足够的意识以维持胸骨卧床之前, 不要让动物无人看管。另外, 在完全恢复之前, 不要把已经经过外科手术的动物归还给其他动物.
20. 在该动物在加热垫上恢复后, 将其返回到其笼子.
    注意: 将老鼠单独 ( 即, 在单独的笼子里), 以防止 rat-to-rat 的缝合和伤口的切割.
21. 将食物浸泡在笼底的培养皿中, 在后几天内将其放入水中, 以帮助老鼠到达食品.
22. 管理卡洛芬 (5 毫克/千克 BW, 平方) 24 h 后的疼痛缓解每24小时的需要.
23. 去除皮肤缝合线, 而动物在2% 异氟醚麻醉下 10-14 天后.

3。MicroCT 扫描

注意: 时间是每只动物的 30-40 分钟.

1. 在手术后的第二天, 将骨质疏松的大鼠放在与中央清理系统相连的麻醉机的感应室中。采用5% 氟烷100% 氧诱导麻醉, 通过鼻锥在 2-3% 异氟醚维持.
2. 使用 活体扫描鼠体内的 和 #181; CT 扫描仪。重复扫描进行骨再生的纵向分析.
   注意: 请确保所有的动物都使用相同的设置进行扫描 ( 即, X 射线能量、扫描介质、强度、体素大小和图像分辨率) 和 similar 方向。例如: x 射线能量, 55 kVP;电流, 145 和 #181;体素大小, 35 和 #181;增量, 115 和 #181; m;和集成时间, 200 毫秒;与 PBS 的样品。请参阅 Bouxtein et al. ³⁴ 用于啮齿动物和 #181 的进一步解释和考虑; CT 扫描用于评估骨组织结构。理想情况下, 可用的最高扫描分辨率将用于所有扫描;然而, 高分辨率扫描需要更长的采集时间, 生成大量的数据集, 并使动物暴露在更多的电离辐射中。后者可能会产生不必要的影响, 包括减少骨折愈合。因此, 应仔细考虑额外数据和扫描时间之间的权衡.

4。椎体分离

注意: 计时是 20-30 min/每样.

1. 对感兴趣的椎骨进行轮廓, 如图 3A -i.. 确保包括椎骨的所有部分, 同时排除属于相邻椎体的部分.
   1. 单击并 #34; #181; CT 评估程序和 #34; 从菜单中选择示例.
   2. 使用鼠标对每个切片进行轮廓.
   3. 使用 #34; Z 和 #34; bar 转到下一切片.
2. 将轮廓椎骨保存为单独的文件 ( 图 3J -K ), 通过单击并 #34; 文件和 #34; #160; #8594; #34; 保存 GOBJ 和 #34; 每两片.

5. 纵向定量评估 VOI 的定义

注意: 以下步骤取决于扫描是从1天后的手术 (参考椎骨) 或从随后的时间点 (靶椎骨).

1. 参考椎骨
   注意: 定时是 20-30 分钟每样品。
   1. 对于 Z 旋转, 从缺陷的中心 ( 图 4A -b ) 中使用 XY 切片测量边距的角度。
      1. 在 Z 平面上, 转到椎骨的区域, 其中的缺陷是最清晰的, 屏幕捕获椎骨.
      2. 在演示文稿软件中, 准备一个矩形形状的对象, 它将适合该缺陷.
      3. 旋转脊椎的图像, 使缺陷朝上, 缺陷边缘与矩形的两侧平行.
      4. 测量旋转角度 (右键单击图像和 #160; #8594; #34; 格式化图片和 #34; #160; #8594; #34; 大小和 #34;)
      5. 使用测量角度旋转椎骨 ( 图 4C )。
         1. 打开一个新的 DECterm 窗口 (#34; 会话管理器和 #34; #160; #8594; #34; 应用和 #34; #160; #8594; #34;D ecterm #34;).
         2. 运行和 #34; 彩光和 #34;:
         3. 彩光和 #62; turn3d
         4. -输入和 #62;
         5. -输出和 #62;
         6. -turnaxis_angles [0.000 90.000 90.000] 和 #62; 90 90 0
         7. -turnangle [0.000] 和 #62; 测量角度
         8. -img_interpol_option [1] 和 #62;
         对于 X 旋转的
   2. , 请使用缺陷中心的 YZ 切片 ( 图 4D E ) 测量边距的角度。使用测量的角度旋转椎骨 ( 图 4F )。
      1. 单击 #34; YZ 和 #34; #34; uCT 评估计划和 #34; 重复步骤 5.1. 1.1-5.1. 1.5. 2.
      2. 彩光和 #62; isq
      3. -aim_name [in] 和 #62;
      4. -isq_filename [default_file_name] 和 #62; 插入 isq 文件目录 ( 例如, 和 #34;D k0: [MICROCT。数据.加齐特.马克西姆 80. DAY1] Z2102970。ISQ 和 #34;)
      5. -pos [0 0 0] 和 #62;
      6. -dim [-1-1-1] 和 #62;
   3. 通过将 XY 平面更改为 "平面" 来翻转旋转的椎骨。
      1. 打开一个新的 DECterm 窗口 (#34; 会话管理器和 #34; #160; #8594; #34; 应用和 #34; #160; #8594; #34;D ecterm #34;).
      2. 运行和 #34; 彩光和 #34;:
      3. 彩光和 #62; 翻转
      4. -输入和 #62; 输出
      5. 输入 [输出] 和 #62; out2
      6. -new_xydir [yz] 和 #62;
   4. 定义 VOI。
      1. 通过选择 #34 中的圆形轮廓图标、uCT 评估程序和 #34 ( 图 6A ), 从缺陷中心绘制缺陷的圆形轮廓。复制该轮廓并将其粘贴到缺陷的所有切片 ( 图 6B ).
         注意: 由于所有缺陷都是使用相同的过程创建的, 所以分析了所有样本的相同数量的切片和随后的总音量 (TV).
2. 目标椎骨.
   注意: 定时是 10-20 分钟每样品。
   1. 将目标和参考椎骨的 DICOM 文件加载到图像分析软件的主窗口中.
      注意: 要避免灰度值更改, 请在 "加载" 菜单中定义与原始 DICOM 文件相同的输出数据类型.
   2. 注册到参考椎骨。
      1. 启动和 #34; 3 维体素注册和 #34; 模块和输入参考椎骨作为和 #34; 基础体积和 #34; 靶椎作为和 #34; 匹配音量. #34; 单击和 #34; 注册和 #34; 注册椎骨 (图 5 ).
   3. 使用相同的数据类型保存已注册的文件并将其导入到 #181; CT 环境.
   4. 应用 VOI。
      1. 通过单击和 #34 对已注册的目标椎骨应用 VOI 定义的参考椎骨; uCT 评估程序和 #34; #160; #8594; #34; 文件和 #34; #8594; #34; 加载 GOBJ 和 #34; 并选择以前创建的 GOBJ。检查 VOI 和缺陷是否同心.

6。MicroCT 分析

注意: 每个示例的计时为 10-20 分钟.

1. 使用 #181 发送用于评估的 VOI; CT 评估程序 ( 图 6 ).
   注意: 在分析所有 VOIs 时, 请确保使用相同的参数。确保阈值设置得足够高, 以便在最小的骨骼丢失时忽略背景噪音。如果使用显影生物材料, 可以使用一些策略来分析骨形成。如果生物材料和骨组织之间的密度有差异, 可以将生物材料分割成 ^{35 , 36} 。否则, 研究者可以定性地评价实验组之间骨形成的差异.

7。安乐死

1. PPlace 在麻醉机的感应室中的骨质疏松大鼠。在100% 氧气中使用5% 异氟醚诱导麻醉.
2. 通过鼻锥维持麻醉并执行安乐死通过切割胸腔产生双侧气胸 ³⁷ .

Results

使用这个协议, 你可以图像和量化的再生 n = 8 模型骨质疏松椎体缺损不同时间点。通过注册程序获得的解剖匹配, 可以在所有时间点对同一 VOI 进行分析。这导致了高度准确的纵向3D 计量分析, 即使原始缺陷的边缘不再是可识别的。我们使用五时间点 (天 1, 星期 2, 星期 4, 星期8和星期 12) 作为一个例子为骨骼再生的纵向评估 (图 7)。可通过对2D 剖面和3D 图像的定性评估 (如图 7A中所示) 和骨量 (BVD) 和质量 (AD) (图 7B) 的定量比较来评估再生。以下形态学指数可以确定为新形成的骨: (i) 电视, 包括骨和软组织体积 (电视, mm³);(二) 矿化组织的体积 (BV, 毫米³);(iii) 骨量密度 (BV/电视);和 (iv) 骨矿物质密度 (BMD, 镁羟基磷灰石每 cm³)。具体而言...

Discussion

骨质疏松是脊椎压迫性骨折的最常见原因, 脊柱的负荷增加, 导致椎体塌陷。然而, 在真正复制类似椎体塌陷的啮齿动物中, 几乎不可能产生损伤。相反, 研究人员在椎体中心创建一个圆柱形空洞以模拟 OVCFs^{16,17,18,19,20,21,24,38,39}. 由于在文献中没有一致的缺陷大小, critical-sized 缺陷被定义为一个不自发愈合完全没有干预在3月内术后^16,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
异氟醚	MWI 动物保健公司，加利福尼亚州帕萨迪纳	501017
BetadineSolution	MWI 动物保健公司，加利福尼亚州帕萨迪纳市	4677
葡萄糖酸氯己定 2% 擦洗	MWI 动物保健公司，加利福尼亚州帕萨迪纳市	510083
异丙醇 70%-夸脱	MWI 动物保健公司，加利福尼亚州帕萨迪纳市	501044
卡洛芬	MWI 动物保健公司，帕萨迪纳，加利福尼亚州	26357
丁丙诺啡 0.3 mg/mL	MWI 动物保健，帕萨迪纳，加利福尼亚州	56163
切除无胸腺裸鼠	Harlan Laboratories，印第安纳波利斯，印第安纳州	Hsd：RH-Foxn1 rnu
低钙食品	Newco Distributors， Inc.，CA	1814948 （5AV8 AIN-93M w/low calcium）
磷酸盐缓冲盐水	Life Technologies Corporation
Dermabond	J 和 J Ethicon	DHVM12
麻醉机	Patterson Scientific	TEC 3EX
滑顶诱导室	Patterson Scientific	78917833
ProStation 加热工作站	Patterson Scientific	78914731
手术单	HALYARD HEALTH INC	89101
磁性固定器回缩系统	Fine Science Tools， Inc.， CA	18200-50
解剖剪刀，10 厘米，弯曲，SS	World Precision Instruments，FL	14394
虹膜剪刀，11.5 厘米，45 度;角、锯齿、锐普/夏普	世界精密仪器，FL	503225
镊子，5 号	世界精密仪器，FL	555048FT
微型蚊子止血钳	世界精密仪器，FL	503360
无菌棉纱布	美敦力，明尼苏达州明尼阿波利斯，明尼苏达州	9024
吸收矛 - 安装/无菌	精细科学工具，CA	18105-01
注射器，1 mL	TERUMO TERUMO MED	SS-01T
针头，25 号	BD MED SYS 注射系统
层流罩	Baker	SterilGARD e3-II 类 A2 型生物安全柜
热灼灼装置	World Precision Instruments，FL	501292
微型钻头 OmniDrill115/230V	World Precision Instruments， FL	503598
用于微型钻头的环钻，直径 2 mm	精细科学工具，CA	18004-20
3-0 Vicryl 未染色 27"SH 锥度	J AND J	ETHICON 1663G
4-0 Ethilon black 18"PC3 常规切割	J 和 J Ethicon	1954G
锥形束体内显微CT （vivaCT 40）Scanco	Medical	vivaCT 40
SCANCO Medical 显微CT系统软件套件	Scanco Medical	vivaCT 40
分析软件	生物医学成像，梅奥诊所，明尼苏达州罗切斯特	分析 12	图像分析软件
Veterenery 眼膏