研究酸性后处理对脑缺血神经保护作用的实验模型

摘要

酸性后处理可保护脑缺血损伤。本文介绍了两种实施酸性后处理的模型，分别通过在氧糖剥夺后将皮质-纹状体脑片转移至酸性缓冲液中实现 体外 并通过吸入20% CO₂ 大脑中动脉闭塞后 体内.

摘要

脑卒中是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因之一，目前可用的治疗方法有限。作为一种内源性神经保护策略，缺血后处理已被证明是抗脑缺血的有前景疗法。然而，复杂的操作程序和潜在的安全性问题限制了其临床应用。为克服这些缺点，我们开发了酸性后处理（APC）作为实验性局灶性脑缺血的治疗手段。APC是指在缺血后灌注期间通过吸入CO₂实现轻度酸中毒的治疗方法。本文介绍了分别用于实施APC的体外（in vitro）和体内（in vivo）两种模型。采用小鼠氧糖剥夺（OGD）处理以及小鼠皮质纹状体阻塞和大脑中动脉阻塞（MCAO）来模拟脑缺血。APC可通过将脑片转移至用20% CO₂气体饱和的酸性缓冲液，或让小鼠吸入20% CO₂气体来简便实现。APC在组织存活率和脑梗死体积方面均显示出显著的脑保护作用。

引言

脑卒中是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因之一。近几十年来，人们为寻找有效的脑卒中治疗方法付出了巨大努力，但成果仍不理想。后处理是指在缺血事件发生后通过亚毒性刺激进行干预的一种过程。后处理包括缺血后处理、缺氧后处理、低糖后处理以及远隔缺血后处理，能够激活内源性适应机制，已被证明是防治脑缺血具有前景的治疗策略^1,2,3,4。然而，缺血后处理可能带来额外的损伤。肢体远隔缺血后处理通常需要在同侧或双侧后肢进行数个循环的5–20分钟缺血与再灌注^5,6,7。因此，这些后处理操作在临床实践中存在风险或难以实施。为了克服这些缺点，我们开发了APC作为小鼠局灶性脑缺血的治疗方法⁸。APC仅通过吸入20% CO₂即可诱导，以更可行且安全的方式显著减轻缺血性脑损伤。近期我们已证实APC可延长再灌注时间窗，凸显了APC在脑卒中治疗中的重要意义⁹。

本文介绍了两种用于研究活化蛋白C（APC）对脑缺血神经保护作用的实验模型。第一种是小鼠皮质纹状体脑片的氧糖剥夺（OGD）模型。通过快速制备并将脑片转移至人工环境（通常为人工脑脊液，ASCF），可维持细胞活力和神经元环路完整性，从而实现对脑功能的研究 体外^10,11在ASCF中进行OGD可模拟脑缺血并诱导缺血性损伤^12,13,14. OGD结束后，脑片在常规人工脑脊液（r-ASCF）中重新孵育以实现再灌注，随后在通入20% CO的酸性ASCF中用APC处理₂与原代培养细胞相比，皮质-纹状体脑片保持了完整的组织学特征。

研究大脑功能 体内，采用小鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型。通过颈总动脉插入火焰烧钝的单丝线栓以阻塞大脑中动脉。作为最常用的脑卒中模型之一，MCAO模型具有临床相关性，且使用单丝线栓更易于实现再灌注。仅需吸入含20% CO的常氧混合气体₂ 再灌注开始后，活化蛋白C（APC）显示出对脑缺血的显著保护作用，表现为脑梗死体积减小。

方案

所有实验均经浙江大学动物实验伦理委员会批准，并严格遵循其伦理指南进行，完全符合美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》的要求。实验过程中尽可能减少动物的疼痛与不适，并使用最少数量的动物。

1. 大脑皮层-纹状体脑片的氧糖剥夺

1. 溶液配制：
   1. 配制 1,000 mL r-ACSF（124 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、1.25 mmol/L KH₂PO₄、2 mmol/L MgSO₄、26 mmol/L NaHCO₃、2 mmol/L CaCl₂、10 mmol/L 葡萄糖，最终 pH 7.4）。整个实验过程中以 5% CO₂ 和 95% O₂ 持续通气。
   2. 按上述方法配制 200 mL 无葡萄糖 ACSF（gf-ACSF），但不添加葡萄糖，并以 5% CO₂ 和 95% N₂ 通气。在应用于脑片前先通气 30 分钟，以降低溶液中的氧含量。持续通气直至氧糖剥夺（OGD）操作完成。
   3. 通过将 200 mL r-ACSF 与 20% CO₂ 和 80% O₂ 平衡来配制酸性 ACSF（a-ACSF）。在应用于脑片前通气 30 分钟，使溶液 pH 降至 6.8，并持续通气直至 APC 操作完成。
   4. 将三个组织储存器分别放入 r-ACSF、gf-ACSF 和 a-ACSF 中。
2. 脑片制备：
   注意：本研究使用 8 周龄雄性 C57Bl/6J 小鼠。动物饲养于受控温度（22 ± 2 °C）环境中，光照-黑暗周期为 12 小时，并可自由获取颗粒饲料和饮水。
   1. 在诱导室中使用过量异氟烷处死一只小鼠，随后将其断头。使用小剪刀和镊子解剖出大脑。用薄刮刀取出大脑，小心放入一个盛有冰浴 r-ACSF（以 5% CO₂ 和 95% O₂ 平衡）的玻璃烧杯中。
      注意：这些步骤应尽可能快速而细致地完成。
   2. 将大脑在冰浴 r-ACSF 中保持 5 分钟。调节气体压力以避免大脑移动。
   3. 在振动切片机载物台上以两条带状形式涂上冷冻胶。在远离刀片的一侧胶带上放置一块 3% 琼脂糖以支撑大脑。
   4. 将一个 10 cm 的培养皿倒置于冰上，然后在培养皿上放置一张滤纸。用数滴冰浴 r-ACSF 润湿滤纸。
   5. 用镊子将大脑转移至滤纸上。用刀片和镊子切除前极和小脑。
      注意：横切面应尽可能平滑，并垂直于矢状面。
   6. 将剩余的大脑组织垂直放置在另一条胶带上，并使其紧靠琼脂糖支撑。向切割槽中加入冰浴 r-ACSF 以完全浸没大脑，并在冰槽区域加入冰块。保持槽内 r-ACSF 以 5% CO₂ 和 95% O₂ 持续通气。
   7. 升起槽体，调节刀片位置，使刀片尽可能靠近大脑且略高于大脑表面。
   8. 选择 "CONT" 模式以连续切割脑片。设定切片厚度为 400 µm，振动频率为 6–8，速度为 3–4。按下 "start/stop" 按钮启动自动切割。
   9. 剪去 3 mL 巴斯德移液管的尖端，使其开口大小与脑片相匹配。
      注意：开口应足够大，以避免对脑片造成额外损伤。
   10. 用剪过尖端的巴斯德移液管逐个吸取五片脑片，并将其放入盛有冰浴 r-ACSF（以 5% CO₂ 和 95% O₂ 通气）的组织储存器中。不收集第一片切出的脑片。调节气体压力以避免脑片移动。
       注意：脑片不应相互重叠。
   11. 将脑片在室温下置于 r-ACSF 中孵育 30 分钟，随后在 37 °C 水浴中再孵育 10 分钟，以恢复突触功能。
3. 氧糖剥夺（OGD）与酸性再灌注处理（APC）：
   1. 将 gf-ACSF 和 a-ACSF 放入 37 °C 水浴中，并如前所述在 1.1.2 和 1.1.3 步骤中使用相应气体通气 30 分钟。
   2. 将一片脑片保留在 r-ACSF 中作为对照。将另外四片脑片小心转移至预热的 gf-ACSF 组织储存器中，孵育 15 分钟。随后将这些脑片转移回 r-ACSF 组织储存器中以实现再灌注。
   3. 为研究 APC 的时间窗，将一片脑片直接从 gf-ACSF 转移至 a-ACSF。将另外三片脑片先转移至 r-ACSF，然后分别在再灌注后 5 分钟和 15 分钟时，将其中两片转移至 a-ACSF 组织储存器中。
   4. 将这两片脑片在 a-ACSF 中孵育 3 分钟，然后转移回 r-ACSF。三片脑片在 r-ACSF 中继续孵育 1 小时。将剩余脑片保留在 r-ACSF 中作为 OGD 组。
   5. 进行剂量反应研究时，OGD 后先将全部四片脑片转移至 r-ACSF 组织储存器中，孵育 5 分钟。然后将一片脑片保留在 r-ACSF 中作为 OGD 组，其余三片转移至 a-ACSF 中。分别在 a-ACSF 中孵育 1、3 和 5 分钟后，再将它们转移回 r-ACSF。三片脑片在 r-ACSF 中继续孵育 1 小时。
4. 脑片活力测定：
   1. 配制 0.25% 2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）生理盐水溶液。将 1.25 g TTC 粉末加入 500 mL 生理盐水溶液中。
      注意：待粉末完全溶解后，将溶液转移至用铝箔包裹的 24 孔板中（每孔 500 µL），并在 4 °C 下保存。TTC 及经 TTC 染色的组织对光敏感。
   2. 将脑片转移至含有 TTC 溶液的 24 孔板中（每孔一片），并在溶液中将脑片展平。将脑片在 37 °C 浅水浴中孵育 30 分钟。
   3. 将脑片转移至用铝箔包裹的洁净 1.5 mL 离心管中，并测量脑片的干重。
   4. 向离心管中加入乙醇/二甲基亚砜（1:1）（体积与重量比 v:w = 10:1），以提取甲臜。将脑片在避光、室温条件下孵育 24 小时。
   5. 将离心管中的全部乙醇/二甲基亚砜溶液转移至 96 孔板中，使用酶标仪在 490 nm 处测量吸光度。
   6. 将吸光度归一化至脑片干重，并以对照组脑片的百分比表示活力。

2. 大脑中动脉闭塞（MCAO）

1. 准备：
   1. 使用70%乙醇对工作台、激光多普勒血流仪（LDF）仪器及其附件表面进行消毒。
   2. 准备已灭菌的器械：剪刀两把，10 cm；镊子两把，10 cm；眼科镊一把，11 cm；显微眼科剪一把，9 cm；微血管夹一个，1.8 cm；持针器一个，12.5 cm；若干手术缝线（△ 1/2 4 × 10）；棉签。
   3. 准备一支不含针头的注射器，内装生理盐水，用于维持操作区域湿润。
   4. 准备麻醉气体（100% O₂ + 异氟烷）。
2. 脑血流检测：
   1. 设置激光多普勒血流仪。
   2. 向小鼠腹腔注射镇痛药：安乃近 200 mg/kg，卡洛芬 4 mg/kg，丁丙诺啡 0.1 mg/kg。
   3. 将小鼠放入诱导室，使用含4%异氟烷的氧气进行麻醉，直至其身体和胡须的自发运动停止。
   4. 将小鼠置于俯卧位，鼻部接入鼻罩，并在后续操作中维持1.5%异氟烷麻醉。
   5. 在双眼上涂抹右旋泛醇眼膏。
   6. 使用70%乙醇对头部进行消毒。
   7. 使用手术刀在眼睛与耳朵之间做右侧旁正中皮肤切口，暴露前囟。
   8. 用无菌棉签擦拭颅骨表面。
   9. 在颅骨表面滴加一至两滴手术胶水。
   10. 将光纤探头尖端置于前囟后方5 mm、中线外侧6 mm处。
   11. 在计算机软件上开始记录血流信号。等待稳定的血流基线出现后，在胶水上滴加20 µL固化剂以固定探头。
       注：理想的基线值应高于500 flux。
   12. 若基线值低于200 flux，需微调探头位置以获得合适的基线。在整个实验过程中保持探头与颅骨固定。
   13. 光纤探头固定后，使用碘伏对头部进行再次消毒。
3. 大脑中动脉闭塞（MCAO）：
   1. 将已麻醉的小鼠（颅骨上已固定LDF探头）仰卧位固定，并在整个手术过程中使用加热灯维持其体温。使用70%乙醇对颈部进行消毒。
   2. 使用手术刀在颈部做旁正中皮肤切口；用镊子钝性分离软组织以暴露血管。在暴露的组织上滴加一滴生理盐水以保持湿润。
   3. 使用眼科镊将颈总动脉从周围组织和迷走神经中分离出来，注意避免损伤迷走神经。 暴露颈总动脉后，再次使用碘伏对颈部皮肤进行消毒。
   4. 在颈总动脉远端放置微血管夹，并在近端用6-0丝线打结结扎。将血管夹尽可能靠近近端放置，以便后续操作。确保血管夹与结扎点之间的血管段尽可能长，以利于后续操作。
   5. 在血管夹近端打一个松结作为临时结扎线，确保两个结之间有足够的空间用于插入单丝线栓。
   6. 使用显微眼科剪在两个结之间做一小段纵向切口，切口应尽可能靠近结扎点，注意不要切断血管。
   7. 通过切口将12 mm钝头单丝线栓插入动脉腔内，并推进数毫米。收紧松结固定线栓头部，然后移除血管夹。
   8. 使用眼科镊将线栓沿颈内动脉推进约10 mm，以阻塞大脑中动脉，此时LDF软件应显示血流显著下降（>较基线血流减少80%以上）。记录闭塞开始时间。
      注：LDF仪器设置详见第2.2节。
   9. 闭塞大脑中动脉1小时。切断LDF探头连接，将小鼠放入30 °C培养箱中完成闭塞期。
4. 再灌注与酸中毒处理（APC）：
   1. 在闭塞开始后55分钟，按照前述方法使用异氟烷重新麻醉动物。将小鼠仰卧位固定，切开颈部切口，重新暴露颈总动脉。
   2. 闭塞期结束后，使用眼科镊轻轻拉出线栓以实现再灌注，并通过收紧结扎线将临时结扎转为永久结扎。
   3. 为进行酸中毒处理，在再灌注后5、50或100分钟时，将鼻罩吸入气体更换为含20% CO₂、20% O₂和60% N₂ 的混合气体，持续5分钟。使用间断缝合关闭切口。
   4. 将小鼠置于30 °C加热笼中，直至其恢复意识，随后转移至清洁的单独笼具中。提供培养皿盛装的饮水和湿润饲料。术后密切观察小鼠是否出现剧烈疼痛或死亡。
5. 脑梗死体积测定：
   1. 在再灌注后24小时，采用TTC染色法测定脑梗死体积。
   2. 在预定处死时间前，按步骤1.4.1所述配制0.25% TTC溶液。将溶液分装至24孔板中（每孔1 mL），用铝箔包裹后于4 °C保存。
      注：TTC及其染色组织对光敏感。
   3. 再灌注24小时后，在诱导室中使用过量异氟烷处死动物，断头取脑。使用小剪刀和镊子分离脑组织。检查脑表面出血点，排除在Willis环处发生蛛网膜下腔出血的小鼠。
   4. 将脑组织置于放置在-20 °C冰袋上的洁净载玻片上，连同载玻片一起放入-20 °C冰箱中5分钟，以便于切片。
   5. 从-20 °C环境中取出脑组织和载玻片，放回-20 °C冰袋上。使用刀片和镊子切除额极和小脑。
   6. 使用刀片将脑组织水平切成1 mm厚的切片，共切5片。用镊子将切片转移至含TTC溶液的24孔板中（每孔一片），并在溶液中展平切片。将切片置于37 °C水浴中避光孵育30分钟。
   7. 吸除TTC溶液，每孔加入10%甲醛溶液1 mL，室温孵育30分钟。将切片按切割顺序排列于透明薄膜上，扫描至图像分析仪中。
   8. 使用ImageJ分析软件⁸基于视觉识别，计算梗死面积占整个脑切片面积的百分比；见图2（左）。

结果

在上述描述的皮质-纹状体脑片模型中，于再灌注后1小时通过TTC染色法量化皮质-纹状体脑片的存活性。TTC转化率通过将490 nm处的吸光度归一化至对照组脑片进行计算。根据TTC转化结果，酸中毒预处理对氧糖剥夺（OGD）诱导的再灌注损伤具有保护作用，且该保护作用具有起始时间和持续时间依赖性。具体而言，在15分钟OGD后5分钟给予酸中毒处理时，1分钟和3分钟的酸化处理均显著提高了脑片存活性，而5分钟处理则无此效果（OGD：0.609 ± 0.029，5/1：0.758 ± 0.034，5/3：0.821 ± 0.041，5/5：0.672 ± 0.053，数据以均值 ± 标准误表示）（图1A）。酸中毒处理的神经保护作用在再灌注后5分钟内仍存在，但在15分钟时则不再显著（OGD：0.584 ± 0.044，0/3：0.762 ± 0.036，5/3：0.833 ± 0.062，15/3：0.627 ± 0.038）（图1

讨论

本文介绍了两种用于研究活化蛋白C（APC）对脑缺血神经保护作用的实验模型。在脑片模型中，再灌注开始后，将小鼠皮质纹状体脑片置于经20% CO₂气体饱和的酸性缓冲液中孵育以实现APC；而在大脑中动脉阻塞（MCAO）模型中，再灌注后通过让小鼠吸入20% CO₂实现APC。这两种模型均能反映APC对脑缺血的神经保护作用。其保护效果与缺血后处理相当，但具有更宽的时间窗。在MCAO模型中，APC的时间窗可长达再灌注后50分钟，而缺血后处理仅为10分钟¹⁵。此外，APC操作更为简便且安全性更高。

在皮质-纹状体脑片模型中，轻柔且快速的操作对于最大限度地保持脑片的活性至关重要。进行大脑中动脉阻塞（MCAO）操作时，需要监测脑血流，并观察到血流急剧下降，以确认大脑中动脉的阻塞。在取出脑组织进行TTC染色后，必须仔细检查脑组织，以排除蛛网膜下腔出血。

酸中毒的强度和持续时间对于实现APC的神经保护作用至关重要。在皮质-纹状体脑片模型中，延长酸中毒处理时间...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化钠	Sigma	S5886
氯化钾	Sigma	P5405
磷酸二氢钾	Sigma	P9791
硫酸镁	Sigma	M2643
碳酸氢钠	Sigma	S5761
二水合氯化钙	Sigma	C5080
D-(+)-葡萄糖	Sigma	G7021
振动切片机	Leica	VT1000 S
2,3,5-三苯基氯化四氮唑	Sigma	T8877
无水乙醇	阿拉丁工业公司	E111993
二甲基亚砜	Sigma	D8418
激光多普勒血流仪	Moor Instruments Ltd	Model Moor VMS-LDF2
无水乙醚	国药集团化学试剂有限公司	80059618
水合三氯乙醛	国药集团化学试剂有限公司	30037517
10% 甲醛	阿拉丁工业公司	F111936
24 孔板	Jet Biofil	TCP-010-024