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研究酸性后处理对脑缺血神经保护作用的实验模型

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DOI：

10.3791/55931

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2017年7月31日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Pharmacology & Toxicology, College of Pharmaceutical Sciences, Department of Pharmacology, Key Laboratory of Medical Neurobiology of The Ministry of Health of China, Zhejiang Province Key Laboratory of Neurobiology, Zhejiang University

通讯作者： Zhong Chen <chenzhong@zju.edu.cn>, Xiangnan Zhang <xiangnan_zhang@zju.edu.cn>

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

酸性后处理可保护脑缺血损伤。本文介绍了两种实施酸性后处理的模型，分别通过在氧糖剥夺后将皮质-纹状体脑片转移至酸性缓冲液中来实现。 体外 并通过吸入20% CO2 大脑中动脉闭塞后 体内.

摘要

脑卒中是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因之一，目前可用的治疗手段有限。作为一种内源性神经保护策略，缺血后处理已被证明是抗脑缺血的有前景疗法。然而，复杂的操作流程和潜在的安全问题限制了其临床应用。为克服这些缺点，我们开发了酸性后处理（APC）作为实验性局灶性脑缺血的治疗手段。APC是指在缺血后灌注期间通过吸入CO2实现轻度酸中毒的治疗方法。本文介绍了分别用于实施APC的体外（in vitro）和体内（in vivo）两种模型。采用小鼠氧糖剥夺（OGD）处理以及小鼠皮质纹状体阻塞和大脑中动脉阻塞（MCAO）来模拟脑缺血。APC可通过将脑片转移至用20% CO2气体饱和的酸性缓冲液，或让小鼠吸入20% CO2气体来简便实现。APC在组织存活力和脑梗死体积方面的表现显示出对脑缺血显著的保护作用。

引言

脑卒中是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因之一。近几十年来，人们为寻找有效的脑卒中治疗方法付出了巨大努力，但成果仍不理想。后处理是指在缺血事件发生后通过亚毒性刺激进行干预的一种过程。缺血后处理、缺氧后处理、低糖后处理以及远隔缺血后处理等均可激活内源性适应机制，已被证明是防治脑缺血具有前景的治疗策略1,2,3,4。然而，缺血后处理可能带来额外的损伤。肢体远隔缺血后处理通常需要在同侧或双侧后肢进行数个循环的5–20分钟缺血与再灌注5,6,7。因此，这些后处理操作在临床实践中存在风险或难以实施。为克服上述缺点，我们开发了APC作为小鼠局灶性脑缺血的治疗方法8。APC仅需通过吸入20% CO2即可诱导，以更可行且安全的方式显著减轻缺血性脑损伤。近期我们进一步证实，APC可延长再灌注时间窗，凸显其在脑卒中治疗中的重要意义9。

本文介绍了两种用于研究活化蛋白C（APC）对脑缺血神经保护作用的实验模型。第一种是小鼠皮质纹状体脑片的氧糖剥夺（OGD）模型。通过快速制备并将脑片转移至人工环境中（通常为人工脑脊液，ASCF），可维持细胞活力和神经元环路完整性，从而实现对脑功能的研究 体外10,11在ASCF中进行OGD可模拟脑缺血并诱导缺血性损伤12,13,14. OGD后，脑片在常规ASCF（r-ASCF）中重新孵育以实现再灌注，随后在通入20% CO的酸性ASCF中用APC处理2与原代培养细胞相比，皮质-纹状体脑片保持了完整的组织学特征。

研究大脑功能 体内，采用小鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型。通过颈总动脉插入火焰烧钝的单丝线栓以阻塞大脑中动脉。作为最常用的脑卒中模型之一，MCAO模型具有临床相关性，且使用单丝线栓更易于实现再灌注。仅需吸入含20% CO的常氧混合气体2 再灌注开始后，APC 显示出对脑缺血的显著保护作用，表现为脑梗死体积减小。

方案

所有实验均经浙江大学动物实验伦理委员会批准，并遵循其伦理准则进行，完全符合美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》的要求。实验过程中尽可能减少动物的任何疼痛或不适，并使用最少数量的动物。

1. 大脑皮层-纹状体脑片的氧糖剥夺

  1. 溶液配制：
    1. 配制 1,000 mL r-ACSF（124 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、1.25 mmol/L KH2PO4、2 mmol/L MgSO4、26 mmol/L NaHCO3、2 mmol/L CaCl2、10 mmol/L 葡萄糖，最终 pH 为 7.4）。整个实验过程中用 5% CO2 和 95% O2 持续通气。
    2. 按上述方法配制 200 mL 无葡萄糖 ACSF（gf-ACSF），但不添加葡萄糖，并用 5% CO2 和 95% N2 通气。在应用于脑片前，先通气 30 分钟以降低溶液中的氧含量。持续通气直至氧糖剥夺（OGD）操作完成。
    3. 通过将 200 mL r-ACSF 与 20% CO2 和 80% O2 平衡来配制酸性 ACSF（a-ACSF）。在应用于脑片前通气 30 分钟，使溶液 pH 降至 6.8，并持续通气直至 APC 操作完成。
    4. 将三个组织储存槽分别放入 r-ACSF、gf-ACSF 和 a-ACSF 中。
  2. 脑片制备：
    注意：本研究使用 8 周龄雄性 C57Bl/6J 小鼠。动物饲养于受控温度（22 ± 2 °C）环境中，光照-黑暗周期为 12 小时，并可自由获取颗粒饲料和饮水。
    1. 在诱导室中使用过量异氟烷处死小鼠，随后进行断头。使用小剪刀和镊子解剖出脑组织。用薄刮刀取出脑组织，小心放入盛有冰浴 r-ACSF（已用 5% CO2 和 95% O2 平衡）的玻璃烧杯中。
      注意：上述步骤应尽可能快速且细致地完成。
    2. 将脑组织置于冰浴 r-ACSF 中 5 分钟。调节气体压力以避免脑组织移动。
    3. 在振动切片机平台上用冷冻沉淀胶涂抹两条胶带。在远离刀片的一侧胶带上放置一块 3% 琼脂糖以支撑脑组织。
    4. 将一个直径 10 cm 的培养皿倒置在冰上，然后在皿内放置一张滤纸。用数滴冰浴 r-ACSF 润湿滤纸。
    5. 用镊子将脑组织转移至滤纸上。用刀片和镊子切除前极和小脑。
      注意：横切面应尽可能平整，并垂直于矢状面。
    6. 将剩余脑组织垂直放置在另一条胶带上，并使其紧靠琼脂糖支撑。向切割储液槽中加入冰浴 r-ACSF 以完全浸没脑组织，并在冰槽区域加入冰块。保持储液槽中的 r-ACSF 持续通以 5% CO2 和 95% O2。
    7. 升起储液槽，调整刀片位置，使刀片尽可能靠近脑组织并略高于其表面。
    8. 选择 "CONT" 模式以连续切割脑片。设定切片厚度为 400 µm，振动频率为 6–8，切割速度为 3–4。按下 "start/stop" 按钮开始自动切割。
    9. 剪去 3 mL 巴斯德移液管的尖端，使其开口大小与脑片相匹配。
      注意：开口应足够大，以避免对脑片造成额外损伤。
    10. 用剪过尖端的巴斯德移液管逐个吸取五片脑片，并将其转移至盛有冰浴 r-ACSF（持续通以 5% CO2 和 95% O2）的组织储存槽中。不收集第一片切出的脑片。调节气体压力以避免脑片移动。
      注意：脑片之间不应相互重叠。
    11. 将脑片在室温 r-ACSF 中孵育 30 分钟，随后在 37 °C 水浴中再孵育 10 分钟，以恢复突触功能。
  3. 氧糖剥夺（OGD）与酸性灌注预处理（APC）：
    1. 将 gf-ACSF 和 a-ACSF 放入 37 °C 水浴中，并按照 1.1.2 和 1.1.3 所述分别用相应气体通气 30 分钟。
    2. 将一片脑片保留在 r-ACSF 中作为对照。将另外四片脑片小心转移至预热的 gf-ACSF 组织储存槽中，孵育 15 分钟。随后将这些脑片转移回 r-ACSF 组织储存槽中以实现再灌注。
    3. 为研究 APC 的时间窗，将一片脑片直接从 gf-ACSF 转移至 a-ACSF。将另外三片脑片先转移至 r-ACSF，然后分别在再灌注后 5 分钟和 15 分钟时，将其中两片转移至 a-ACSF 组织储存槽中。
    4. 将这两片脑片在 a-ACSF 中孵育 3 分钟后，再转移回 r-ACSF。将这三片脑片在 r-ACSF 中继续孵育 1 小时。将剩余脑片保留在 r-ACSF 中作为 OGD 组。
    5. 进行剂量反应研究时，OGD 后先将全部四片脑片转移至 r-ACSF 组织储存槽中，孵育 5 分钟。然后将一片脑片保留在 r-ACSF 中作为 OGD 组，其余三片转移至 a-ACSF 中。分别在 a-ACSF 中孵育 1、3 和 5 分钟后，再转移回 r-ACSF，并在 r-ACSF 中继续孵育 1 小时。
  4. 脑片活力测定：
    1. 配制 0.25% 2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）生理盐水溶液。将 1.25 g TTC 粉末加入 500 mL 生理盐水中。
      注意：待粉末完全溶解后，将溶液转移至用铝箔包裹的 24 孔板中（每孔 500 µL），并在 4 °C 下保存。TTC 及经 TTC 染色的组织对光敏感。
    2. 将脑片转移至含有 TTC 溶液的 24 孔板中（每孔一片），并在溶液中将其展开。将脑片置于 37 °C 浅水浴中孵育 30 分钟。
    3. 将脑片转移至用铝箔包裹的洁净 1.5 mL 离心管中，测定脑片干重。
    4. 向离心管中加入乙醇/二甲基亚砜（1:1）溶液（体积与重量比为 10:1），以提取甲臜。将脑片在避光条件下室温孵育 24 小时。
    5. 将各管中的乙醇/二甲基亚砜溶液全部转移至 96 孔板中，使用酶标仪在 490 nm 波长处测定吸光度。
    6. 将吸光度值按脑片干重进行归一化处理，并以对照组脑片的百分比形式表示活力。

2. 大脑中动脉闭塞（MCAO）

  1. 准备：
    1. 使用70%乙醇对工作台、激光多普勒血流仪（LDF）仪器及其附件表面进行消毒。
    2. 准备已灭菌的器械：剪刀两把，10 cm；镊子两把，10 cm；眼科镊一把，11 cm；显微眼科剪一把，9 cm；微血管夹一个，1.8 cm；持针器一个，12.5 cm；若干手术缝线（△ 1/2 4 × 10）；棉签。
    3. 准备一支不含针头的注射器，内装生理盐水，用于维持操作区域湿润。
    4. 准备麻醉气体（100% O2 + 异氟烷）。
  2. 脑血流检测：
    1. 设置激光多普勒血流仪。
    2. 向小鼠腹腔注射镇痛药：安乃近 200 mg/kg，卡洛芬 4 mg/kg，丁丙诺啡 0.1 mg/kg。
    3. 将小鼠放入诱导室，使用含4%异氟烷的氧气进行麻醉，直至其身体和胡须的自发运动停止。
    4. 将小鼠置于俯卧位，鼻部接入鼻罩，并在后续操作中维持1.5%异氟烷麻醉。
    5. 在双眼上涂抹右旋泛醇眼膏。
    6. 使用70%乙醇对头部进行消毒。
    7. 使用手术刀在眼与耳之间做右侧旁正中皮肤切口，暴露前囟。
    8. 用无菌棉球擦拭颅骨表面。
    9. 在颅骨表面滴加一至两滴手术胶水。
    10. 将光纤探头尖端置于前囟后方5 mm、中线外侧6 mm处。
    11. 在计算机软件上开始记录血流信号。待血流基线稳定后，在胶水上滴加20 µL固化剂以固定探头。
      注：理想的基线值应高于500 flux。
    12. 若基线值低于200 flux，需微调探头位置以获得合适的基线。实验期间保持探头牢固附着于颅骨。
    13. 光纤探头固定后，使用碘伏对头部进行消毒。
  3. 大脑中动脉闭塞（MCAO）：
    1. 将已麻醉的小鼠（颅骨上已固定LDF探头）仰卧位固定，并在整个手术过程中使用加热灯维持体温。使用70%乙醇对颈部进行消毒。
    2. 使用手术刀在颈部做旁正中皮肤切口，用镊子钝性分离软组织以暴露血管。在暴露的组织上滴加一滴生理盐水以保持湿润。
    3. 使用眼科镊将颈总动脉从周围组织和迷走神经中分离出来，注意避免损伤迷走神经。 暴露颈总动脉后，再次使用碘伏对颈部皮肤进行消毒。
    4. 在颈总动脉远端放置微血管夹，并在近端用6-0丝线打结固定。夹子应尽可能靠近近端，以便后续操作。确保夹子与结扎点之间的血管长度尽可能长，以利于后续操作。
    5. 在夹子近端打一个松结作为临时缝线，确保两个结之间有足够的空间用于插入单丝线栓。
    6. 使用显微眼科剪在两个结之间做一小段纵向切口，切口应尽可能靠近结扎点。注意避免切断血管。
    7. 通过切口将12 mm钝头单丝线栓插入动脉腔内，并推进数毫米。收紧松结固定线栓头部，然后移除血管夹。
    8. 使用眼科镊将线栓沿颈内动脉推进约10 mm，以阻塞大脑中动脉，直至LDF软件显示血流显著下降（>较基线血流减少80%以上）。记录闭塞开始时间。
      注：LDF仪器设置详见第2.2节。
    9. 闭塞大脑中动脉1小时。切断LDF探头连接，将小鼠置于30 °C培养箱中完成闭塞期。
  4. 再灌注与酸中毒处理（APC）：
    1. 在闭塞开始后55分钟，按前述方法使用异氟烷重新麻醉动物。将小鼠仰卧位固定，切开颈部切口，重新暴露颈总动脉。
    2. 闭塞期结束后，用眼科镊轻轻拉出线栓以实现再灌注，并通过收紧结扎将临时缝线转为永久结扎。
    3. 如需进行酸中毒处理，在再灌注后5、50或100分钟时，将鼻罩吸入气体更换为含20% CO2、20% O2 和60% N2 的混合气体，持续5分钟。使用间断缝合关闭切口。
    4. 将小鼠置于30 °C加热笼中，直至其恢复意识，随后转移至清洁的单独笼具中。提供培养皿盛装的饮水和湿润饲料。术后密切观察小鼠是否出现剧烈疼痛或死亡。
  5. 脑梗死体积测定：
    1. 在再灌注后24小时，采用TTC染色法测定脑梗死体积。
    2. 在预定处死时间前，按步骤1.4.1所述配制0.25% TTC溶液。将溶液分装至24孔板中（每孔1 mL），用铝箔包裹后于4 °C保存。
      注：TTC及其染色组织对光敏感。
    3. 再灌注24小时后，在诱导室中使用过量异氟烷处死动物，断头取脑。使用小剪刀和镊子分离脑组织。检查脑表面出血点，排除在Willis环处发生蛛网膜下腔出血的小鼠。
    4. 将脑组织置于放置于-20 °C冰袋上的洁净载玻片上，连同载玻片一起放入-20 °C冰箱中5分钟，以便后续切片。
    5. 从-20 °C环境中取出脑组织和载玻片，放回-20 °C冰袋上。使用刀片和镊子切除额极和小脑。
    6. 用刀片将脑组织水平切成1 mm厚的切片，共5片。用镊子将切片转移至含TTC溶液的24孔板中（每孔一片），并在溶液中展平切片。将切片置于37 °C水浴中避光孵育30分钟。
    7. 吸除TTC溶液，每孔加入10%甲醛溶液1 mL，室温孵育30分钟。将切片按切割顺序排列于透明薄膜上，扫描至图像分析仪中。
    8. 使用ImageJ分析软件8基于视觉识别，计算梗死面积占整个脑切片面积的百分比；见图2（左）。

结果

在上述描述的皮质-纹状体脑片模型中，于再灌注1小时后通过TTC染色法量化皮质-纹状体脑片的存活率。TTC转化率通过将490 nm处的吸光度值相对于对照组脑片进行归一化计算得出。根据TTC转化结果，酸中毒预处理以起始时间和持续时间依赖的方式对氧糖剥夺（OGD）诱导的再灌注损伤具有保护作用。具体而言，在15分钟OGD后5分钟给予酸中毒处理时，1分钟和3分钟的酸化处理均显著提高了脑片存活率，而5分钟处理则无此效果（OGD: 0.609 ± 0.029，5/1: 0.758 ± 0.034，5/3: 0.821 ± 0.041，5/5: 0.672 ± 0.053，数据表示为均值 ± 标准误）（图1A）。酸中毒处理的神经保护作用在再灌注后5分钟内仍存在，但在15分钟时则消失（OGD: 0.584 ± 0.044，0/3: 0.762 ± 0.036，5/3: 0.833 ± 0.062，15/3: 0.627 ± 0.038）（图1B）。

在MCAO模型中，再灌注开始后5分钟时启动的5分钟酸中毒治疗可挽救缺血损伤引起的细胞死亡，表现为梗死体积减小（MCAO：33.4 ± 4.4%，5/5：16.6 ± 2.7%，50/5：19.5 ± 2.1%，100/5：37 ± 2.1%）。即使治疗开始时间延迟至再灌注后50分钟，神经保护作用仍然显著。然而，在再灌注100分钟时启动的酸中毒治疗则未能阻断缺血性损伤（图2）。

所有数据均以盲法收集和分析。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。在皮质-纹状体脑片模型中，每组包含 6-8 个样本；在 MCAO 模型中，每组包含 9-10 个样本。多组间比较采用单因素方差分析，结合最小显著差异法进行。

比较不同OGD和R/Acl处理时间下TTC转化的柱状图，显示统计学显著性。
图1。APC对皮质纹状体脑片中OGD诱导的再灌注损伤具有保护作用。 皮质纹状体脑片在OGD后分别接受不同持续时间的酸中毒处理（pH 6.8）（A）以及不同恢复时间的处理（B）。细胞活力通过再灌注后24小时的3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）比色法检测，皮质纹状体脑片活力则通过再灌注后1小时的TTC染色法进行定量。数据以均值±标准误表示。每组n = 6 - 8；采用单因素方差分析，*p < 0.05，**p < 0.01；R，再灌注。请点击此处查看该图的放大版本。

脑梗死体积分析，TTC染色切片，柱状图比较，CO₂暴露效应。
图2APC 可保护小鼠免受 MCAO 诱导的损伤 动物接受60分钟大脑中动脉闭塞（MCAO），并在再灌注后5、50或100分钟时通过吸入20% CO₂治疗5分钟。再灌注24小时后采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑染色法测定梗死体积（左图中黑色虚线所示）。数据以均值±标准误表示。每组n = 8 - 10；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。< 0.05 和 **p< 0.01（单因素方差分析）；R，再灌注。 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

本文介绍了两种用于研究活化蛋白C（APC）对脑缺血神经保护作用的实验模型。在脑片模型中，再灌注开始后，将小鼠皮质纹状体脑片置于经20% CO2气体饱和的酸性缓冲液中孵育以实现APC；而在大脑中动脉阻塞（MCAO）模型中，再灌注后通过让小鼠吸入20% CO2实现APC。这两种模型均能反映APC对脑缺血的神经保护作用。其保护效果与缺血后处理相当，但具有更宽的时间窗。在MCAO模型中，APC的时间窗可长达再灌注后50分钟，而缺血后处理仅为10分钟15。此外，APC操作更为简便且安全性更高。

在皮质-纹状体脑片模型中，轻柔且快速的操作对于最大限度地保持脑片的活性至关重要。进行MCAO操作时，需要监测脑血流，并观察到血流急剧下降，以确认大脑中动脉的阻塞。在脑组织取出进行TTC染色后，必须仔细检查脑组织，以排除蛛网膜下腔出血。

酸中毒的强度和持续时间对于实现APC的神经保护作用至关重要。在皮质-纹状体脑片模型中，延长酸中毒处理时间并无益处（图1A）。此外，我们之前的研究表明，吸入10%和20%的CO2可对小鼠产生神经保护作用，而吸入30%的CO2则不能8。这些结果提示，轻度酸中毒对于APC的神经保护作用至关重要，因此CO2的浓度和APC的持续时间是实现酸中毒介导神经保护不可或缺的因素。

除了TTC染色外，还可结合多种技术以满足不同的研究需求。例如，可在最后一步增加细胞外电生理记录，以观察缺血和酸中毒对神经电位的影响16。还可收集脑片的灌流液，通过高效液相色谱法（HPLC）检测氨基酸类神经递质在缺血后处理（APC）后的浓度变化17。此外，可制备特定脑区的脑片，以研究该区域对缺血和缺血后处理的反应。总体而言，可引入多种替代方法以阐明缺血和酸中毒的影响。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由国家自然科学基金（81573406、81373393、81273506、81221003、81473186 和 81402907）、浙江省自然科学基金（LR15H310001）及浙江省领军型创新团队支持计划资助&T创新团队（2011R50014）

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氯化钠SigmaS5886
氯化钾SigmaP5405
磷酸二氢钾SigmaP9791
硫酸镁SigmaM2643
碳酸氢钠SigmaS5761
二水合氯化钙SigmaC5080
D-(+)-葡萄糖SigmaG7021
振动切片机LeicaVT1000 S
2,3,5-三苯基氯化四氮唑SigmaT8877
无水乙醇阿拉丁工业公司E111993
二甲基亚砜SigmaD8418
激光多普勒血流仪Moor Instruments LtdModel Moor VMS-LDF2
无水乙醚国药集团化学试剂有限公司80059618
水合三氯乙醛国药集团化学试剂有限公司30037517
10% 福尔马林阿拉丁工业公司F111936
24 孔板Jet BiofilTCP-010-024

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