本文介绍了一种优化的实验方案，可通过荧光染色方法有效显示生物素化葡聚糖胺（BDA）在神经环路中的标记情况。该方法适用于在共聚焦激光扫描显微镜下分析BDA标记的精细结构，并将其与其他神经成分区分开来。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
提高高分子量生物素化葡聚糖胺在大鼠丘脑皮层投射示踪中的应用
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
高分子量生物素化葡聚糖胺（BDA）作为高灵敏度的神经解剖学示踪剂已被使用数十年。由于其标记质量受多种因素影响，本文提供了一种优化的高分子量 BDA 应用方案，用于研究中枢神经系统中最佳的神经标记效果。通过精细玻璃微量移液管将 BDA 立体定位注射至大鼠丘脑腹后内侧核（VPM）后，使用荧光链霉亲和素-Alexa（AF）594 对 BDA 进行染色，并用荧光尼氏染料 AF500/525 进行复染。在绿色尼氏染色背景下，躯体感觉皮层中的红色 BDA 标记（包括神经元胞体和轴突终末）显示得更为清晰。此外，对 BDA 和钙结合蛋白小清蛋白（PV）进行双重荧光染色，以观察皮层靶区中 BDA 标记与 PV 阳性中间神经元之间的关系，从而为研究局部神经环路及其化学特性提供了可能。因此，该优化方法不仅适用于通过丘脑与大脑皮层之间的双向神经通路，以高分子量 BDA 实现高质量神经标记的可视化，还可同时结合荧光组织化学或免疫组织化学技术，对其他神经标志物进行共标显示。
引言
高分子量BDA（10,000分子量）是一种高度敏感的示踪剂，已用于中枢神经系统神经通路示踪超过20年1。尽管BDA是常用的神经束示踪技术，但其在动物体内的标记质量可能受到多种因素的影响1,2,3。我们最近的研究表明，BDA标记的最佳结构不仅与适当的注射后存活时间有关，还与染色方法相关4。迄今为止，以往研究中用于显示BDA标记的方法包括传统的亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）、链霉亲和素-异硫氰酸荧光素以及链霉亲和素-AF594染色法2,3,4,5。相比之下，BDA的荧光染色操作更为简便。
为了拓展高分子量 BDA 的应用，本研究引入了一种优化的实验方案。在将 BDA 注射至大鼠脑内丘脑腹后内侧核（VPM）后，通过标准 ABC 染色法以及双重荧光染色法显示 BDA 标记结果；其中双重荧光染色用于观察 BDA 标记与皮层靶区中基本神经元结构....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本研究经中国中医科学院伦理委员会批准（编号 20160014）。所有操作均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》（国家科学院出版社，华盛顿特区，1996 年版）。本研究共使用四只成年雄性大鼠（体重 250–280 g）。所有动物均饲养在温度和湿度受控的环境中，光照周期为 12 小时明/暗循环，并可自由摄食和饮水。本研究所用仪器与材料见图 1。手术前，所有器械（如立体定位仪和玻璃移液管）均使用 70% 乙醇进行清洁。
1. 手术操作
- 使用立体定位图谱9确定VPM中感兴趣区域的坐标（图2A）。
- 准备一支配备玻璃微量移液管（尖端直径约为10–20 µm）的1 µL微量注射器（图1D），并用液体石蜡进行测试。
- 通过腹腔注射7%水合氯醛 (0.7 mL/100 g)对大鼠进行麻醉。
- 通过夹尾和足底回缩反射确认深度麻醉后，使用电动剃刀剃除动物头部的毛发，并依次使用10%聚维酮碘和70%乙醇各擦拭手术区域3次 。
- 将钝头耳杆插入大鼠耳道，将其固定于立体定位仪中，并将上切牙置于门齿夹内（
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
在VPM注射BDA后存活10天，足以在注射侧同侧的相应皮层区域产生强烈的神经标记（图2）。采用常规ABC法和荧光染色法对BDA进行染色，均显示出相似的S1区神经标记模式，包括顺行标记的丘脑-皮层轴突和逆行标记的皮层-丘脑神经元（图2C、D）。
对于顺行标记的轴突，从第2层到第6层均可观察到，其中第4层密度较高，在桶状区观察到典型的丘脑皮层轴突形态（图2C，D）。在高倍镜下观察，BDA标记清晰显示于轴突主干、分支、侧支以及小的串珠样膨大结构（图3A）。在标记的丘脑皮层轴突下方，可见逆行标记的皮层锥体神经元，其胞体分布于第5/6层，而其顶端树突则延伸至第.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
选择合适的示踪剂是成功进行神经示踪实验的关键步骤。在生物素化葡聚糖胺（BDA）家族中，高分子量BDA（10,000分子量）相较于低分子量BDA（3,000分子量），更推荐用于顺行性神经通路的示踪2,3,11,12,13。然而，许多研究也表明，高分子量BDA在顺行性示踪的同时，也可能用于逆行性通路的示踪1,2,3。通过VPM与S1之间的双向神经通路，我们进一步提供了证据支持高分子量BDA适用于双向纤维束示踪的观点4。在该领域的类似研究中，高分子量BDA也被应用于视觉和听觉系统，用于检测.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由国家自然科学基金（项目编号 81373557；编号 81403327）资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 生物素化葡聚糖胺（BDA） | Molecular Probes | D1956 | 分子量 10,000 |
| 链霉亲和素-Alexa Fluor 594 | Molecular Probes | S32356 | 避光保存 |
| 500/525 绿色荧光尼氏染色剂 | Molecular Probes | N21480 | 避光保存 |
| 脑立体定位仪 | Narishige | SR-50 | |
| 冷冻切片机 | Thermo | Microm International GmbH | |
| 共聚焦成像 | Olympus | FV1200 | |
| 系统 | |||
| 微型钻机 | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Sprague Dawley 大鼠 | 中国医学科学院实验动物科学研究所 | SCKX (JUN) 2012-004 | |
| Vectastain ABC 试剂盒 | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| Superfrost Plus 显微镜载玻片 | Thermo | #4951PLUS-001 | 25×75×1 mm |
| Photoshop 与 Illustrator | Adobe | CS5 |
参考文献
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. J Neurosci Methods. 41, 239-254 (1992).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
