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提高高分子量生物素化葡聚糖胺在大鼠丘脑皮层投射示踪中的应用

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DOI：

10.3791/55938

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2018年4月12日

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1Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种优化的实验方案，可通过荧光染色方法有效显示生物素化葡聚糖胺（BDA）在神经环路中的标记情况。该方法适用于在共聚焦激光扫描显微镜下分析BDA标记的精细结构，并将其与其他神经成分区分开来。

摘要

高分子量生物素化葡聚糖胺（BDA）作为高灵敏度的神经解剖学示踪剂已被使用数十年。由于其标记质量受多种因素影响，本文提供了一种优化的高分子量 BDA 应用方案，用于研究中枢神经系统中最佳的神经标记效果。通过精细玻璃微量移液管将 BDA 立体定位注射至大鼠丘脑腹后内侧核（VPM）后，使用荧光链霉亲和素-Alexa（AF）594 对 BDA 进行染色，并用荧光尼氏染料 AF500/525 进行复染。在绿色尼氏染色背景下，躯体感觉皮层中的红色 BDA 标记（包括神经元胞体和轴突终末）显示得更为清晰。此外，对 BDA 和钙结合蛋白小清蛋白（PV）进行双重荧光染色，以观察皮层靶区中 BDA 标记与 PV 阳性中间神经元之间的关系，从而为研究局部神经环路及其化学特性提供了可能。因此，该优化方法不仅适用于通过丘脑与大脑皮层之间的双向神经通路，以高分子量 BDA 实现高质量神经标记的可视化，还可同时结合荧光组织化学或免疫组织化学技术，对其他神经标志物进行共标显示。

引言

高分子量BDA（10,000分子量）是一种高度敏感的示踪剂，已用于中枢神经系统神经通路示踪超过20年1。尽管BDA是常用的神经束示踪技术，但其在动物体内的标记质量可能受到多种因素的影响1,2,3。我们最近的研究表明，BDA标记的最佳结构不仅与适当的注射后存活时间有关，还与染色方法相关4。迄今为止，以往研究中用于显示BDA标记的方法包括传统的亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）、链霉亲和素-异硫氰酸荧光素以及链霉亲和素-AF594染色法2,3,4,5。相比之下，BDA的荧光染色操作更为简便。

为了拓展高分子量 BDA 的应用，本研究引入了一种优化的实验方案。在将 BDA 注射至大鼠脑内丘脑腹后内侧核（VPM）后，通过标准 ABC 染色法以及双重荧光染色法显示 BDA 标记结果；其中双重荧光染色用于观察 BDA 标记与皮层靶区中基本神经元结构或中间神经元之间的关系，分别采用链霉亲和素-AF594 与荧光尼氏染色或 PV 免疫组织化学染色进行标记。通过 VPM 与初级躯体感觉皮层（S1）之间存在的双向神经通路6,7,8，我们将观察重点放在 S1 区域中丘脑皮层投射轴突和皮层丘脑投射神经元胞体的 BDA 标记情况。通过该方法，我们不仅期望提供一种获得高质量高分子量 BDA 神经标记的详细操作流程，还旨在建立一种将荧光 BDA 标记与其他荧光神经标志物结合组织化学或免疫组织化学的优化方案。该方法更适用于在共聚焦激光扫描显微镜下研究局部神经环路及其化学特性。

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方案

本研究经中国中医科学院伦理委员会批准（编号 20160014）。所有操作均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》（国家科学院出版社，华盛顿特区，1996 年版）。本研究共使用四只成年雄性大鼠（体重 250–280 g）。所有动物均饲养在温度和湿度受控的环境中，光照周期为 12 小时明/暗循环，并可自由摄食和饮水。本研究所用仪器与材料见图 1。手术前，所有器械（如立体定位仪和玻璃移液管）均使用 70% 乙醇进行清洁。

1. 手术操作

  1. 使用立体定位图谱9确定VPM中感兴趣区域的坐标（图2A）。
  2. 准备一支配备玻璃微量移液管（尖端直径约为10–20 µm）的1 µL微量注射器（图1D），并用液体石蜡进行测试。
  3. 通过腹腔注射7%水合氯醛 (0.7 mL/100 g)对大鼠进行麻醉。
  4. 通过夹尾和足底回缩反射确认深度麻醉后，使用电动剃刀剃除动物头部的毛发，并依次使用10%聚维酮碘和70%乙醇各擦拭手术区域3次 。
  5. 将钝头耳杆插入大鼠耳道，将其固定于立体定位仪中，并将上切牙置于门齿夹内（图1E），随后在眼睛上涂抹眼用软膏。
  6. 再次使用70%乙醇清洁手术区域的头皮。使用无菌外科手套和毛巾，确保手术在无菌条件下进行。
  7. 使用手术刀沿矢状缝做矢状切口（图1F）。
  8. 在整个手术过程中，使用无菌棉签刮除颅骨上的肌肉和骨膜，以控制出血（图1F）。
  9. 根据图谱中的预定义坐标（图2A），确定开颅位置（前囟后-3.3 mm，中线右侧2.6 mm）（图1G）。
  10. 使用圆头钻头（#106）的磨钻进行开颅（图1H），持续钻入数分钟，深度约达1 mm，直至暴露脑膜（图1I）。
  11. 使用显微镊切除注射部位上方的硬脑膜，暴露大脑皮层（图1I）。
  12. 将微量注射器中的液体石蜡更换为10% BDA（分子量10,000，溶于蒸馏水）溶液（图1J）。
  13. 将注射器安装至微量注射装置，并连接微泵（图1K）。
    注：注射体积取决于微泵速度。此处设定为30 nL/min（图1L）。
  14. 在体视显微镜下，使用微量注射装置手动将玻璃微量移液管经脑皮层表面插入VPM，深度为5.8 mm（图1M）。
  15. 使用微泵在3分钟内向VPM内压力注射100 nL的10% BDA溶液（35 nL/min）（图1L，M）。
  16. 注射完成后，保持移液管原位5分钟，然后缓慢撤出。
  17. 使用无菌缝线缝合伤口（图1N）。遵循当地动物护理委员会关于术前和 术后镇痛的指导原则 。
  18. 将大鼠置于温暖的恢复区域，直至其恢复意识并完全苏醒 。
  19. 将恢复后的大鼠放回其笼中。

2. 灌注与切片

  1. 在通常为10天的存活时间后，通过腹腔注射过量的10%乌拉坦（2 mL/100 g）对动物实施安乐死。
  2. 在通风橱内对实验大鼠进行灌注（图1O）。
    1. 待呼吸停止后，使用剪刀和镊子打开大鼠胸腔以暴露心脏。将静脉导管从左心室插入并朝向主动脉方向推进，随后剪开右心耳。
    2. 首先以生理温度（37 °C）的0.9%磷酸盐缓冲液（PBS）灌注约1–2分钟，直至从心脏流出的液体变清亮，然后继续灌注250–300 mL的4%多聚甲醛溶于0.1 M磷酸盐缓冲液（PB, pH 7.4）中。
  3. 灌注完成后，切开头皮并打开颅骨，取出大鼠脑组织。将分离出的脑组织在4%多聚甲醛中室温（26 °C）后固定2小时，随后在含30%蔗糖的0.1 M PBS（pH 7.4）溶液中于4 °C下进行冷冻保护处理3天，直至脑组织完全沉入溶液中（图1P）。
  4. 当脑组织完全沉入溶液后，在脑切模上将脑组织按冠状方向分为三个部分（图1Q），其中中央部分包含VPM和S1区。
  5. 使用冷冻切片滑动切片机将脑组织的中央部分按冠状方向切成40 µm厚的切片。按顺序将切片收集至6孔板中，孔内盛有0.1 M PBS（pH 7.4）（图1R，S）。

3. 标准ABC染色法

注意：采用脑组织每第三个冠状切片的游离切片，通过标准ABC法显示BDA标记10。

  1. 用 0.1 M PBS 冲洗切片约 1 分钟。
  2. 将切片置于含 0.3% Triton X-100 的 0.1 M PB（pH 7.4）中的 1% ABC 溶液中，室温孵育 1 小时。
  3. 用 50 mM Tris 缓冲液（pH 7.4）洗涤切片三次。
  4. 将切片在含有 0.02% 3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）和 0.01% H2O2 的 50 mM Tris 缓冲液中染色，室温下约 2–5 分钟。
  5. 用 50 mM Tris 缓冲液（pH 7.4）洗涤切片三次。
  6. 使用标准组织化学技术将切片贴附于显微镜载玻片上（图 1T；参见 补充视频文件 III，灌注与切片部分）。
  7. 室温下空气中干燥切片过夜。
  8. 将切片依次短暂浸入系列酒精溶液（50%、70%、95%、100%）中脱水，每种溶液中约 15 秒。各步骤之间切勿使切片干燥。
  9. 用二甲苯透明处理切片三次，每次约 20 分钟。
  10. 在切片上滴加 2 至 3 滴树胶，然后盖上盖玻片。

4. 大脑皮层中BDA与基本神经元结构的双重荧光染色

注意：相比之下，为观察BDA标记与基本神经结构成分之间的相关性，对相邻切片进行双重荧光染色，使用链霉亲和素-AF594和荧光尼氏染色AF500/525进行复染。

  1. 用 0.1 M PBS 冲洗切片约 1 分钟。
  2. 将切片在含有 0.3% Triton X-100 的 0.1 M PBS（pH 7.4）溶液中，与链霉亲和素-AF594（1:500）和 AF500/525 绿色荧光尼氏染料（1:1,000）混合液于室温孵育 2 小时。
  3. 用 0.1 M PB（pH 7.4）洗涤切片三次。
  4. 采用标准组织化学技术将切片贴附于显微镜载玻片上，并在空气中干燥约 1 小时。
  5. 观察前，用含 50% 甘油的蒸馏水封片剂为荧光切片加盖盖玻片。

5. 大脑皮层中BDA与中间神经元的双重荧光染色

注意：对皮层靶区代表性切片进行双重荧光染色，以观察BDA标记与中间神经元之间的关联，所用试剂为链霉亲和素-AF594和PV免疫组化染色。

  1. 用 0.1 M PBS（pH 7.4）冲洗代表性切片约 1 分钟。
  2. 将切片置于含 3% 正常山羊血清和 0.3% Triton X-100 的 0.1 M PBS 封闭液中，孵育 30 分钟。
  3. 将切片转移至含小鼠单克隆抗 PV IgG 抗体（1:1,000）、1% 正常山羊血清和 0.3% Triton X-100 的 0.1 M PBS（pH 7.4）溶液中，4 °C 过夜孵育。
  4. 次日，用 0.1 M PBS（pH 7.4）洗涤切片三次。
  5. 将切片置于含山羊抗小鼠 AF488 二抗（1:500）、链霉亲和素 AF594（1:500）和 4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI，1:40,000）的混合溶液中，该溶液以含 1% 正常山羊血清和 0.3% Triton X-100 的 0.1 M PBS（pH 7.4）配制，孵育 1 小时。
  6. 重复步骤 4.3 至 4.5。

6. 观察

  1. 拍摄腹后内侧核（VPM）、丘脑皮层轴突和皮层丘脑神经元的图像。
    1. 使用配备物镜（4x，NA：0.13；10x，NA：0.40；和40x，NA：0.95）的共聚焦成像系统观察荧光样品。激发波长和发射波长分别设置为405 nm（蓝色）、488 nm（绿色）和559 nm（红色）。
      注意：此处共聚焦针孔大小为152 µm（4x，10x）和105 µm（40x）。图像采集的空间分辨率为1024 × 1024像素（4x，10x）和640 × 640像素（40x）。
    2. 对每张厚度为40 µm的切片，以2 µm为步长连续采集20帧图像（Z系列）。
    3. 使用共聚焦图像处理软件系统将图像整合为一幅单一的聚焦图像，用于三维分析，步骤如下：设置起始焦平面 → 设置终止焦平面 → 设置步长 → 选择深度模式 → 图像采集 → Z系列。
  2. 使用配备数字相机的光学显微镜（4x，NA：0.13；10x，NA：0.40；和40x，NA：0.95物镜）拍摄明场图像。曝光时间为500 ms。使用图像编辑软件调节图像的亮度和对比度，并添加标签。

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结果

向VPM注射BDA后存活10天足以在注射侧同侧的相应皮层区域产生强烈的神经标记（图2）。BDA的传统ABC染色和荧光染色方法均显示出S1区相似的神经标记模式，包括顺行标记的丘脑-皮层轴突和逆行标记的皮层-丘脑神经元（图2C、D）。

对于顺行标记的轴突，从第2层到第6层均可观察到，其中第4层密度较高，在桶状区可见典型的丘脑皮层轴突形态（图2C，D）。在高倍镜下观察，BDA标记清晰显示于轴突主干、分支、侧支以及小的串珠样膨大结构（图3A）。在标记的丘脑皮层轴突下方，可见逆行标记的皮层锥体神经元，其胞体分布于第5/6层，而其顶端树突则延伸至第2层（

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讨论

选择合适的示踪剂是成功进行神经示踪实验的关键步骤。在生物素化葡聚糖胺（BDA）家族中，高分子量BDA（10,000分子量）相较于低分子量BDA（3,000分子量），更推荐用于顺行性神经通路的示踪2,3,11,12,13。然而，许多研究也表明，高分子量BDA在顺行性示踪的同时，也可能用于逆行性通路的示踪1,2,3。通过VPM与S1之间的双向神经通路，我们进一步提供了证据支持高分子量BDA适用于双向纤维束示踪的观点4。在该领域的类似研究中，高分子量BDA也被应用于视觉和听觉系统，用于检测...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由国家自然科学基金（项目编号 81373557；编号 81403327）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
生物素化葡聚糖胺（BDA）Molecular ProbesD1956分子量 10,000
链霉亲和素-Alexa Fluor 594Molecular ProbesS32356避光保存
500/525 绿色荧光尼氏染色剂Molecular ProbesN21480避光保存
脑立体定位仪NarishigeSR-50
冷冻切片机ThermoMicrom International GmbH
共聚焦成像OlympusFV1200
系统
微型钻机Saeyang MicrotechMarathon-N7
Sprague Dawley 大鼠中国医学科学院实验动物科学研究所SCKX (JUN) 2012-004
Vectastain ABC 试剂盒Vector LaboratoriesPK-4000
Superfrost Plus 显微镜载玻片Thermo#4951PLUS-00125×75×1 mm
Photoshop 与 IllustratorAdobeCS5

参考文献

  1. Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. J Neurosci Methods. 41, 239-254 (1992).
  2. Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. J Neurosci Methods. 103, 23-37 (2000).
  3. Ling, C., Hendrickson, M. L., Kalil, R. E. Resolving the detailed structure of cortical and thalamic neurons in the adult rat brain with refined biotinylated dextran amine labeling. PLoS One. 7, e45886(2012).
  4. Zhang, W. J., et al. Anterograde and retrograde tracing with high molecular weight biotinylated dextran amine through thalamocortical and corticothalamic pathways. Microsc Res Tech. 80, 260-266 (2017).
  5. Han, X., et al. Biotinylated dextran amine anterograde tracing of the canine corticospinal tract. Neural Regen Res. 7, 805-809 (2012).
  6. Armstrong-James, M., Callahan, C. A. Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. II. spatiotemporal convergence in the thalamic ventroposterior medial nucleus (VPm) and its relevance to generation of receptive fields of S1 cortical "barrel" neurones. J Comp Neurol. 303, 211-224 (1991).
  7. Armstrong-James, M., Callahan, C. A., Friedman, M. A. Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. I. Intracortical origins of surround but not centre-receptive fields of layer IV neurones in the rat S1 barrel field cortex. J Comp Neurol. 303, 193-210 (1991).
  8. Agmon, A., Yang, L. T., Jones, E. G., O'Dowd, D. K. Topological precision in the thalamic projection to neonatal mouse barrel cortex. J Neurosci. 15, 549-561 (1995).
  9. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. San Diego. (1998).
  10. Davidoff, M., Schulze, W. Standard avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) staining combination of the peroxidase anti-peroxidase (PAP)-and avidin-biotin-peroxidase complex (ABC)-techniques: an amplification alternative in immunocytochemical staining. Histochemistry. 93, 531-536 (1990).
  11. Fritzsch, B. Fast axonal diffusion of 3000 molecular weight dextran amines. J Neurosci Methods. 50, 95-103 (1993).
  12. Kaneko, T., Saeki, K., Lee, T., Mizuno, N. Improved retrograde axonal transport and subsequent visualization of tetramethylrhodamine (TMR) -dextran amine by means of an acidic injection vehicle and antibodies against TMR. J Neurosci Methods. 65, 157-165 (1996).
  13. Medina, L., Reiner, A. The efferent projections of the dorsal and ventral pallidal parts of the pigeon basal ganglia, studied with biotinylated dextran amine. Neuroscience. 81, 773-802 (1997).
  14. DE Venecia, R. K., Smelser, C. B., McMullen, N. T. Parvalbumin is expressed in a reciprocal circuit linking the medial geniculate body and auditory neocortex in the rabbit. J Comp Neurol. 400, 349-362 (1998).
  15. Ojima, H., Takayanagi, M. Use of two anterograde axon tracers to label distinct cortical neuronal populations located in close proximity. J Neurosci Methods. 104, 177-182 (2001).
  16. Kobbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog Neurobiol. 62, 327-351 (2000).
  17. Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain Res Bull. 51, 11-28 (2000).
  18. Liao, C. C., Reed, J. L., Kaas, J. H., Qi, H. X. Intracortical connections are altered after long-standing deprivation of dorsal column inputs in the hand region of area 3b in squirrel monkeys. J Comp Neurol. 524, 1494-1526 (2016).

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