高分子量生物素化葡聚糖胺在大鼠丘脑-皮质投影示踪中的应用

Dongsheng Xu; Jingjing Cui; Jia Wang; Zhiyun Zhang; Chen She; Wanzhu Bai

doi:10.3791/55938

方法文章

高分子量生物素化葡聚糖胺在大鼠丘脑-皮质投影示踪中的应用

DOI：

10.3791/55938

⸱

2018年4月12日

Dongsheng Xu^*¹ , Jingjing Cui^*¹ , Jia Wang¹ , Zhiyun Zhang¹ , Chen She¹ , Wanzhu Bai¹

¹Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

^* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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在这里, 我们提出了一个完善的协议, 以有效地揭示生物素化葡聚糖胺 (BDA) 标签的荧光染色方法通过一个相互的神经通路。它适用于分析 BDA 标签的精细结构, 并在共焦激光扫描显微镜下将其与其他神经元进行区分。

摘要

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高分子量生物素化葡聚糖胺 (BDA) 已被用作高度敏感的神经解剖学示踪剂数十年。由于其标签的质量受到各种因素的影响, 在这里, 我们提供了一个完善的协议, 以应用高分子量的 BDA 研究最佳神经标记在中枢神经系统。经立体定向注入内侧核 (VPM) 的大鼠丘脑通过一个微妙的玻璃吸管, bda 染色的荧光链亲和素 Alexa (AF) 594 和复染荧光尼斯尔染色 AF500/525。在绿色尼斯尔染色的背景下, 在体感皮层显示了红色的 BDA 标记, 包括神经元细胞体和轴突末端。此外, 对 bda 和钙结合蛋白 parvalbumin (pv) 进行了双荧光染色, 观察了 bda 标记与中间神经元在皮质靶上的相关性, 为研究局部神经电路及其化学特性。因此, 这种精制方法不仅适用于通过丘脑和大脑皮层之间的相互神经通路对高品质的神经标记进行可视化, 而且还可以同时证明其他具有荧光组织化学或免疫化学的神经标记。

引言

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高分子量 BDA (1万分子量), 一种高度灵敏的示踪剂, 已用于在中枢神经系统中追踪神经通路20年以上的¹。虽然 bda 的使用是一种常见的神经道追踪技术, 但在动物中, bda 标签的质量可能受到各种因素的影响, 如¹^,²^,³。最近的研究表明, BDA 标签的优化结构不仅与适当的注射后生存时间有关, 而且与染色方法⁴相关。到目前为止, 传统的亲和-生物素-过氧化物酶复合物 (ABC), 链亲和素异硫氰酸酯, 和 streptavidin-AF594 染色方法, 以揭示 BDA 标签在以前的^研究2, 3, ⁴^,⁵。相比之下, BDA 的荧光染色可以很容易地进行。

为了推广高分子量 BDA 的应用, 本研究引入了一种精细化的协议。在将 bda 注射液注入大鼠脑丘脑的 VPM 后, 采用常规 ABC 染色法和双荧光染色技术对 bda 标签进行了分....

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方案

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这项研究是由中国医学科学院伦理委员会 (参考编号 20160014) 批准的。所有程序都是按照国家卫生研究院关于实验室动物的护理和使用指南进行的 (国家科学院出版社, 华盛顿特区, 1996)。本研究采用四只成年雄性大鼠 (重量250-280 克)。所有动物都被安置在一个12小时的光/暗循环中, 控制着温度和湿度, 并允许免费获得食物和水。本研究中使用的仪器和材料显示在图 1中。手术前, 所有仪器, 如立体定向框架和玻璃吸管, 都用70% 乙醇清洗。

1. 手术程序

使用立体定向地图集⁹ (图 2A) 确定 VPM 中感兴趣的坐标区域。
准备一1µL 微型注射器, 配备玻璃微 (尖直径约10-20 µm) (图 1D), 并用液体石蜡进行测试。
用腹腔注射麻醉7% 水合氯醛 (0.7 mL/100 g) 的大鼠。
一旦深部麻醉证实与尾部捏和踏板撤退反射, 剃光头的动物的头部与电动剃刀和擦洗手术现场3倍, 10% 聚维酮碘其次70% 乙醇分别。
把钝耳棒放到耳朵里, 把老鼠放到立体定向装置中, 把大鼠的上门牙放进嘴里 (

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结果

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10天后, BDA 注入 VPM 的生存是足够的, 以产生强烈的神经标记, 在相应的皮质区域与注射方 (图 2)。BDA 的常规 ABC 和荧光染色程序都揭示了 S1 上类似的神经标记模式, 包括 anterogradely 标记的丘脑-皮质轴突和 retrogradely 标记 corticothalamic 神经元(图 2C, D).

对于 anterogradely 标记的轴突, 它们从2层到6层, 在4层上具有较高的密度, 在桶区观察到典型的丘脑-皮质轴突类型(图 2C, D).在更高的放大倍数视图中, BDA 标签清楚地显示在轴突主干、分支、络和小静脉曲张 (

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讨论

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选择合适的示踪剂是成功的神经追踪实验的关键步骤。在 bda 家族中, 建议通过顺神经通路优先输送高分子量的 bda (1万分子量), 与低分子量 bda (3000 分子量)²^,³^,¹¹^,¹²^,¹³. 然而, 许多研究还表明, 高分子量的 BDA 也可能会与顺追踪¹^,²^,³, 同时用于逆行路径跟踪。通过 VPM 和 S1 之间的相互神经通路, 我们提供了进一步的证据, 支持高分子量 BDA 适用于双向跟踪追踪⁴的观点。同样在这个领域, 高分子量的 BDA 也被用于视觉和听觉系统, 用.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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本研究由中国国家自然科学基金 (项目编号: 81373557; 81403327) 资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
生物素化葡聚糖胺（BDA）	Molecular Probes	D1956	10,000 分子量
霉亲和素-Alexa Fluor 594	Molecular Probes	S32356	避光
500/525 绿色荧光尼氏染色	Molecular Probes	N21480	避光
脑立体定位仪	Narishige	SR-50
冷冻切片机	Thermo	Microm International GmbH
共聚焦成像	奥林巴斯	FV1200
系统
微型钻	Saeyang Microtech	Marathon-N7
Sprague Dawley	中国医学科学院实验动物科学研究所	SCKX （JUN） 2012-004
VectastainABC 套件	Vector Laboratories	PK-4000
superfrost plus 显微镜载玻片	Thermo	#4951PLUS-001	25x75x1mm
Photoshop 和插图	Adobe	CS5

链剂

参考文献

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Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. J Neurosci Methods. 41, 239-254 (1992).
Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing....

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