线虫群体化学感应偏好性实验的自动化分析

摘要

我们介绍了一种行为记录装置和实验方案，可实现对线虫Caenorhabditis elegans在基于群体的实验中对可溶性化合物偏好性的自动化分析。本文描述了行为检测室的构建方法、行为学实验方案以及视频分析软件的使用。

摘要

线虫， 秀丽隐杆线虫仅由302个神经元组成的紧凑神经系统支撑着多种多样的行为。为了促进对这些行为背后神经回路的解析，有必要开发出稳健且可重复的行为检测方法。此前 秀丽隐杆线虫 行为学研究已采用“坠落实验”、“趋化性检测”和“滞留检测”的多种变体来研究 秀丽隐杆线虫 可溶性化合物。本文所述方法旨在结合上述三种检测技术的互补优势。简而言之，在每个检测平板中央绘制一个小圆圈，并将其均分为四个象限，对照溶液与实验溶液交替置于各象限中。加入线虫后，将检测平板放入行为检测室，由显微镜摄像机记录线虫与处理区域的接触过程。随后进行自动视频分析，为每段视频生成一个偏好指数（PI）值。该方法的视频采集与自动分析功能最大限度减少了实验人员的干预及由此产生的误差。此外，每次检测仅需微量实验化合物，且行为检测室的多摄像头配置提高了实验通量。该方法特别适用于对遗传突变体和新型化合物进行行为筛选。然而，由于对照区与实验区距离较近，该方法不适用于研究刺激梯度导航行为；当可用线虫数量较少时，也不宜采用此方法。目前该方法仅适用于检测对可溶性化合物的行为反应，但可轻松改造以适应多模态感觉相互作用及光遗传学研究。该方法亦可调整用于检测其他线虫物种的化学感受反应。

引言

觅食动物必须整合来自多种感觉模式的输入，并选择适当的行为策略，才能成功地在其环境中导航。理解外部感觉输入如何被接收并转化为神经信息以指导行为选择，是神经生物学领域的一个核心目标。这种遗传上易于操作的线虫， 秀丽隐杆线虫是一种研究感觉生物学及多模态整合神经机制的优选模式生物。尽管 秀丽隐杆线虫 仅有302个神经元，却能够检测并区分多种环境刺激，包括可溶性化合物、挥发性气味分子以及环境温度^{1,2,3,4,5,6,7}线虫 秀丽隐杆线虫 严重依赖其化学感受装置来定位食物来源并对潜在威胁作出反应。因此，用于筛选野生型和突变型个体行为反应的实验方法 秀丽隐杆线虫 对化学刺激的反应在解析遗传、细胞和神经机制中起着至关重要的作用 秀丽隐杆线虫出色的感知能力。

为了检测线虫对可溶性化合物的反应，已有三种检测方法被描述——液滴测试、趋化性实验和滞留实验。在液滴测试中，将少量化合物溶液滴加至正在移动的线虫尾部，当液体到达线虫前端感觉器官时，记录线虫选择后退还是继续向前移动的行为⁴。液滴测试所需的实验准备较少，在线虫样本量较小时尤为适用，例如经激光操作处理的线虫。然而，由于每次只能检测一条线虫，且实验过程中需要研究人员全程在场观察，因此该方法可能耗时较长。此外，液滴测试还容易因每条线虫接受液滴施加的方式存在差异而引入实验变异，从而影响整体检测结果。该方法的另一局限性在于，仅可用于检测线虫对厌恶性化合物的反应，因为无法通过线虫的前向运动区分化合物是具有吸引作用还是中性效应。

可溶性化合物的趋化性实验通常包括将琼脂平板分为四个象限，将实验溶液混入其中相对的两个象限的琼脂中，对照溶液则混入另外两个象限^8,9。实验开始时，在平板中心放置一滴含有线虫的缓冲液，并在不同时间点统计各象限中的线虫数量。与滴加实验相比，趋化性实验具有更高的统计效力，因为每次实验可检测大量线虫。然而，该方法的一个局限性在于制备趋化性实验平板需要较大量的实验化合物。如果目标化合物的获取需要经过复杂的纯化过程且产率有限（例如ascaroside信号分子的情况），则难以开展大规模的行为筛选¹⁰。此外，实验过程中需人工计数线虫，容易引入误差，且在计数过程中对平板的扰动可能影响实验结果。

与前述两种方法不同，滞留实验利用机器视觉技术，可在评分过程中最大限度地减少误差，并降低实验人员在检测过程中的干扰¹¹。对线虫行为视频记录的计算机分析还可能揭示出更细微的行为动态，而这些动态在仅于少数离散时间点进行评分时容易被忽略。在滞留实验中，将两种溶液液滴分别加在小型圆形细菌食物斑块的相对两侧，随后将少量线虫放置于食物斑块中央。然后对线虫行为进行视频记录和分析，并根据每种溶液区域中线虫像素的总数计算偏好指数值。尽管存在吸引性食物斑块可使每次实验中使用的线虫群体数量减少，但已有研究表明食物会增强线虫对可溶性驱避剂的回避行为¹²。此外，线虫对短波长光具有避光反应，在行为记录装置中使用发出白光的显微镜光源可能会影响其行为¹³。

本文所讨论方法的目的是利用基于群体的检测手段，记录并分析秀丽隐杆线虫（C. elegans）对可溶性化合物的偏好性。为此，当前方法整合并改进了前述三种方法的各项优点。该方法能够对大量线虫群体进行测试，且每次实验仅需使用少量待测溶液。此外，实验在定制的封闭式行为检测室中进行，并采用红外LED背光照明，以最大限度减少短波长光对线虫行为的影响。每个检测室还可配备多台显微镜相机，在不占用额外实验台空间的前提下提高实验通量。最后，视频分析软件会为每段视频输出一个偏好指数值，并提供相应的线虫分布动态图，以直观展示群体行为随时间的变化。该检测室装置及实验方案还可进一步修改，用于研究多模态行为反应，例如气味物质或温度对化学感应行为的影响。

本文介绍了行为观察室的构建方法和检测方案，展示了该方法在分析野生型线虫及化学感应缺陷突变体对已知可溶性驱避剂铜离子⁴反应中的应用。最后，详细说明了使用所提供软件进行视频分析的过程。

方案

1. 行为实验装置组装

注意：行为实验箱由挤压铝型材杆构成的大致呈立方体形状的框架组成，外部覆盖不透明织物罩，底部为透明丙烯酸板，并设有相机支撑结构。构成行为实验箱的挤压铝型材杆之间的连接均为直角，使用“L”形角码（宽度1英寸，支腿长1英寸）固定，通过螺钉和滑入式T型螺母将角码的一个支腿固定到每根型材杆上。每个连接处根据下文描述使用一个或两个角码进行固定。织物罩通过其角落的金属环，利用相同的螺钉和滑入式T型螺母固定在铝型材框架上。安装时，螺钉应正确插入滑入式T型螺母的沉头一侧，而非带有凸起边缘的一侧。当将螺钉/T型螺母紧固组件安装到铝型材杆上时，应将T型螺母滑入型材杆相应表面的槽道内，使螺钉头部从槽口伸出。

1. 制备织物覆盖物。
   1. 使用剪刀将不透明的聚酯纤维织物裁剪成五块，以覆盖腔体的顶部和四个侧面。
      1. 裁剪一个14英寸×14英寸的正方形² 用于腔室顶部的织物片。裁剪四块11 x 14英寸的矩形织物² 用于腔室侧面的织物片
   2. 在织物片的四个角安装金属环。
      1. 用铅笔和直尺在所有五块聚酯纤维织物的每条边缘内0.5英寸处标记参考线。
      2. 对于四块矩形板材，使用铆具在每个角落铅笔线交叉的中心位置安装铆环（即每块板材安装4个铆环）。
      3. 对于方形布料，沿每条边各安装两个吊环，每个吊环居中于铅笔线，并位于四条铅笔线各自端点内侧1.5英寸处（即共安装8个吊环，每个角落附近各两个）。
   3. 将螺钉插入每个孔眼中，并将T型螺母松松地固定在每个孔眼上。
2. 制作相机安装支架杆。
   1. 使用带锯或功能相当的工具，为每台相机切割一段2英寸长的铝挤型材，确保切面与型材长度方向垂直，以便后续组装。
   2. 使用台钻和直径为0.25英寸的钻头，在每个相机安装条的中心筋板上距一端0.75英寸处钻孔，使孔垂直于安装条的顶面和底面，并穿过安装条的中心线。也可选择使用手持电钻和直径0.25英寸的钻头钻孔，但需确保孔垂直于安装条的顶面和底面。
3. 准备好所有角撑板。
   1. 从内角侧将螺钉穿过每个角码支腿上的孔，然后在每颗螺钉上松松地拧上一个T型螺母。
4. 准备相机安装组件（图1B第2层
   注意：相机支架组件为“H”形结构，用于支撑三个相机套座。
   1. 将相机支架的安装杆连接到相机支架组件的中心杆上。
      1. 将1.2步骤中制作的三根相机安装杆展开，使钻孔端垂直朝上。在每根安装杆远离钻孔的一端两侧，各套上两个角码支架。
      2. 将角码的支脚与杆的末端对齐并拧紧螺丝以固定。这样可形成一个“T”形结构，其中钻孔位于“T”的底部。
      3. 将一根1英尺长的铝型材放置在工作面上。将上一步骤中的一个相机安装条组件的T型螺母滑入1英尺长型材的一侧。使安装条居中对准1英尺型材的长度方向，并拧紧螺丝以固定位置。将另外两个安装条滑入1英尺型材的另一侧。
      4. 将两个角码支架对称地安装在1英尺长横杆的中点两侧，使其内侧角码支架间距约为2.5英寸。在1英尺横杆两端的侧边各套上两个角码支架，使角码的支脚与横杆末端对齐，然后拧紧螺丝以固定。
   2. 将端杆连接到中心杆上。
      1. 将两根1英尺长的铝型材滑入上一步组装件两端的T型螺母中，形成“H”形结构。将两端的横杆对准中间横杆的中心位置，并拧紧四颗螺丝加以固定。
      2. 将四个角码套入上一步安装的两根端杆顶部，每根杆的两端各一个。调整角码位置，使其支脚与杆的端面平齐，然后拧紧螺丝以固定。
   3. 将相机支架和相机套固定到相机安装组件上。
      1. 对于三台显微镜相机支架中的每一台，松开拇指螺丝并从支架杆上滑下相机套筒，以取下相机支架。
      2. 对于每个相机安装杆（现已固定在“H”形结构的中心杆上），将一个垫圈套入一个圆头螺钉，从相机安装杆的钻孔下方穿入螺钉，再在螺钉上方套入另一个垫圈。将相机支架杆的螺纹孔旋紧至该螺钉上，使其牢固地压紧相机安装杆。
      3. 重复步骤 14.3.2，处理其余两个相机安装支架杆。
      4. 将相机套筒滑入每个相机支架的支杆上，较宽的一端朝向相机安装杆和螺丝方向，并用套筒的拇指螺丝暂时将套筒固定在相机支架支杆上。
         注意：最终操作位置将在第2节中设定。
5. 组装行为实验箱框架（图1A).
   注意：为便于组装，应将框架倒置安装，即从腔室框架的“顶部”开始，将其放置在工作面上（图1B，第1层），并向上工作至框架的“底部”（图1B第3层
   1. 组装行为观察室的顶层时，将四根1英尺长的挤压铝条固定在方形聚酯薄膜板上（图1B第1层
      1. 将一根横杆沿织物片每侧边缘的两个T型螺母滑入，并使横杆位于织物宽度方向的中央。拧紧紧固件，将织物片固定在每根横杆上。
      2. 将方形聚酯薄膜平铺在工作台面上，四根附带的铝条朝上放置。将八个角码套在四根铝条的上表面，每根铝条两端各一个。调整角码位置，使其垂直边与铝条端部对齐。通过拧紧螺钉至T型螺母中进行固定。
   2. 在每个角落依次安装一根额外的1英尺铝型材立柱，将型材套入角码两条支腿上的T型螺母。
   3. 通过拧紧紧固件将立杆固定在横杆上，从而连接两个相邻的横杆。
      注意：完成后，八个挤出部分（四个水平方向和四个垂直方向）将在桌面上形成一个方形环，四个柱体向上突出图1B第1层
   4. 将1.4节中“H”形相机支架组件的松动T型螺母从上一步骤中框架立柱的顶部插入。使“H”形支架完全下滑，直至其底部与框架每个角落的角码上表面贴合。通过拧紧四个角码上的螺钉，将相机支架组件固定到位。
   5. 使用最后四根1英尺长的挤压铝型材组装腔室的底层图1B第3层
      1. 将一个角码滑入每根1英尺长横杆的每一端，使角码的支脚与横杆末端对齐，然后拧紧螺丝以固定。
      2. 将横杆连同松动的T型螺母一起插入立柱框架的槽口中。调整横杆位置，使其角码的上边缘低于立柱开口端1英寸，然后拧紧角码螺钉以固定。
6. 将四个矩形聚酯片的T型螺母沿竖直挤压条上的槽滑入，以覆盖腔体侧面，并拧紧紧固件以固定。
7. 选择一侧作为进入腔室内部的门，拆下腔室底层的两个螺丝和T型螺母。
   注意：当框架直立时，此盖子的底部将悬垂于底部，可将其掀起以进入腔室内部。
8. 在每个角件的顶端安装一个塑料帽，作为完成后的框架支脚。将框架正面朝上放置。在框架底层内部每侧插入两个面板固定夹，并旋转以固定到位（图1B，第3层）。放置一张12英寸×12英寸² 在板架顶部放置一块透明丙烯酸板，作为检测板的承载平台（图1B第3层

2. 相机与载物台模板定位

1. 从制造商网站下载显微镜相机视频采集软件，并将其安装到计算机上。
2. 将显微镜相机插入三个相机固定套中，使相机光学镜头朝下对准亚克力载物台和背光源。将相机连接至计算机的USB端口。将红外LED背光板置于框架下方，居中对准载物台。接通背光板电源以开启。
3. 将提供的溶液放置和培养皿对齐模板打印在透明胶片上（见补充文件）。
   注意：在溶液放置模板上，培养皿轮廓圆的直径为3.8 cm，内部感兴趣区域圆的直径为0.9 cm。
4. 沿网格线裁剪，获得包含圆形模板的矩形透明胶片。
5. 启动视频采集软件，点击窗口顶部的编号缩略图以查看各相机的实时画面。
6. 调整显微镜相机的对齐和放大倍数。
   1. 将一个培养皿对齐模板置于显微镜相机镜头下方（图2B）。
   2. 通过沿相机支架杆垂直滑动相机固定套来调节工作距离，并旋转相机的放大倍数调节旋钮，直至模板上的数字标记在相机视野边缘清晰可见。
   3. 用胶带将培养皿对齐模板固定在亚克力载物台上。
   4. 将装有线虫样品的培养皿放置在显微镜相机下的对齐模板上，进一步微调放大倍数和工作距离，使线虫图像清晰，同时确保数字标记仍保留在视野范围内。
   5. 对另外两个显微镜相机重复步骤2.6.1–2.6.4。

3. 线虫的培养与同步化

1. 实验前四天，在24个60 mm线虫生长培养基（NGM）琼脂平板上，各接种50 µL含有OP50 Escherichia coli的LB（Luria-Bertani）液体培养基（配方见第5节）。
   注意：每个60 mm平板可提供足够用于一个检测平板的线虫。建议每种处理或基因型设置六个重复。
2. 将接种后的平板盖上盖子直立放置，在室温下过夜晾干。
3. 次日，将15只营养良好且处于产卵期的雌雄同体线虫转移至每个接种好的平板上，让其产卵6小时。每平板可获得>360枚卵。
4. 6小时后，从接种平板上移除成虫，将子代在20 °C条件下继续培养三天，至成虫期。

4. 化感偏好实验

1. 实验前一天，准备35 mm NGM琼脂检测平板。
   1. 制备250 mL NGM琼脂（配方见第5节）。
   2. 将二十八个空的35 mm培养皿平放在桌面上，每堆不超过五个。每个检测平板中加入5 mL NGM琼脂。盖上皿盖，室温下直立放置过夜使其干燥。
      注意：作为经验法则，为每种待检测的处理条件或基因型额外多准备一个检测平板，以应对意外情况。
2. 实验当天，打开背光灯，启动计算机，并运行显微镜相机视频采集软件。
3. 将显微镜相机连接至计算机，并调整视频录制设置。
   1. 点击软件窗口顶部的编号相机缩略图，查看相机的实时画面。
   2. 点击相机画面左上角的“视频格式”下拉菜单，选择“MJPG 1280 x 1024”。再点击“视频格式”旁边的“文件夹”下拉菜单，选择用于保存视频文件的文件夹。
   3. 点击相机画面右上角的“自动曝光”图标，关闭自动曝光功能。紧接着点击“自动曝光”右侧的“LED”图标，关闭显微镜相机内置的LED灯。然后点击相邻的“设置”图标：选择“黑白”模式，将“对比度”调至最大，并调节“亮度”，使线虫与背景清晰区分。
4. 采集校准视频。
   1. 将溶液定位模板放置在载物台对齐模板上方（图2A）。点击相机画面左侧的“延时视频”录制图标，在持续时间中输入“5”秒，间隔输入“1”秒，以每秒1帧的速度录制5秒视频。点击“开始”以启动视频录制。
5. 对另外两台显微镜相机重复步骤4.3和4.4。
6. 从检测室中移除溶液定位模板。
7. 用洗涤缓冲液清洗线虫三次，以去除食物残留。
   1. 使用5 mL玻璃移液管向同步化线虫平板中加入1.2 mL NGM缓冲液，轻轻晃动平板使线虫悬浮于缓冲液中。用移液器吸取缓冲液，将含有线虫的液体转移至洁净的微量离心管中。
      注意：线虫对培养琼脂盐浓度的变化非常敏感¹⁴。为尽量减少线虫放置后琼脂盐浓度的变化，建议在洗涤过程中使用NGM缓冲液（配方见第5节）。请勿使用塑料移液管从平板中转移线虫，因为线虫会粘附在管壁上。准备的离心管数量应与同时进行检测的平板数量相等。
   2. 让三支离心管静置1–2分钟，使线虫沉降至管底。使用塑料移液枪头尽可能吸除上清洗涤缓冲液，注意不要扰动底部聚集的线虫沉淀。每管重新加入1 mL新鲜NGM缓冲液。
   3. 重复步骤4.7.2一次。
8. 向检测平板中加入10 mM CuCl₂和M13缓冲液（配方见第5节）。
   1. 将溶液定位模板固定在解剖显微镜载物台上表面。
   2. 在对齐模板两侧各贴一条双面胶带。确保胶带覆盖平板边缘圆圈区域，但不遮挡模板中心的记录兴趣区域。
   3. 将检测平板边缘与对齐模板上的圆圈对齐，并向下按压，使模板粘附在平板底部。将检测平板模板上的编号标记与解剖显微镜上溶液定位模板的标记对齐。
   4. 使用P2移液器和塑料枪头，在第1和第4象限各加入1 µL M13缓冲液（图2A）。更换新枪头后，在第2和第3象限各加入1 µL 10 mM CuCl₂溶液（图2A）。
   5. 对另外两个检测平板重复步骤4.8.2–4.8.4。
9. 待液滴完全被琼脂吸收后，使用玻璃巴斯德移液管将各微量离心管中的洗净线虫转移至对应的检测平板。
10. 在圆形处理区域的上下方各滴加一滴线虫悬液。将纸巾折叠四次，用其钝边吸除所有检测平板上的多余洗涤缓冲液。
11. 立即按照模板角上的编号，将三个检测平板放置在行为检测室内的显微镜相机下方。静置2–3分钟，使线虫适应检测平板环境。
    注意：在下一步开始视频录制前，请确保行为检测室的门帘已关闭。
12. 点击相机画面左侧的“延时视频”录制图标，输入“10”分钟作为持续时间，“1”秒作为间隔，以每秒1帧的速度录制10分钟视频。点击“开始”启动视频录制。视频录制完成后保存文件，随后将检测平板从检测室中取出。
13. 对下一批检测平板重复步骤4.7–4.12。每种处理条件或基因型至少进行六次重复或两轮录制。

5. 试剂准备

1. 制备NGM琼脂和缓冲液。
   1. 在1 L玻璃瓶中加入1.5 g氯化钠、8.5 g琼脂和1.25 g蛋白胨。向瓶中加入500 mL蒸馏水和一个搅拌子。将瓶及其内容物进行高压灭菌。
   2. 将瓶子放在搅拌器上，并开启搅拌功能。
   3. 使用无菌操作技术依次加入：0.5 mL的5 mg/mL胆固醇溶液、0.5 mL的1 M氯化钙溶液、0.5 mL的1 M硫酸镁溶液，以及12.5 mL的1 M磷酸钾溶液。
   4. 重复步骤5.1.1至5.1.2以制备NGM缓冲液，但在步骤5.1.1中不加入琼脂和蛋白胨。
2. 制备LB肉汤。
   1. 在1 L玻璃瓶中加入5 g胰蛋白胨、2.5 g酵母提取物、2.5 g氯化钠、500 mL蒸馏水和0.5 mL的1 N氢氧化钠溶液。将瓶及其内容物进行高压灭菌。
3. 制备M13缓冲液。
   1. 在1 L玻璃瓶中加入1.817 g Tris、2.922 g氯化钠、0.373 g氯化钾和500 mL蒸馏水。将瓶及其内容物进行高压灭菌。
4. 制备氯化铜（CuCl₂）溶液。
   1. 称取0.134 g CuCl₂，将其溶质加入含有10 mL M13缓冲液的15 mL塑料管中，配制成100 mM CuCl₂储备液。反复倒置塑料管直至所有溶质完全溶解。
   2. 使用注射器和0.2 µm膜滤器将100 mM CuCl₂溶液过滤纯化至一个洁净的15 mL塑料管中。
   3. 为配制10 mM CuCl₂溶液，向一个微量离心管中加入900 µL M13缓冲液和100 µL 100 mM CuCl₂储备液。反复倒置微量离心管以充分混匀。

6. 视频分析

1. 下载 Python 3（https://www.python.org/downloads/）和 OpenCV 软件库（http://opencv.org/downloads.html）。
2. 下载用于分析的三个 Python 脚本（https://github.com/WormLabCaltech/ResidentWorm）。
   注意：在继续操作前，请确保所有要使用的视频文件均为 mp4 格式。
3. 要查看函数和参数说明，请在控制台中输入“help(输入函数名称)”并按回车键。例如，输入“help(calibration)”后按回车键。
4. 执行校准函数并输入参数以定义视频中的感兴趣区域（ROI）。
   1. 将第 4 节中拍摄的校准视频的文件名输入变量“mp4filename”。输入文件名时需包含引号。
   2. 将“Q*x”和“Q*y”变量的初始值设为 600 和 360。*输入象限编号 1 至 4。将“rad”变量的初始值设为 310。调整这些变量的值，直到 ROI 掩膜与模板上的象限轮廓对齐。
   3. 记录执行该函数后在控制台中打印出的每个 ROI 的总像素数。将此值作为“ROI_size”参数输入到 preference_index 函数中。
5. 执行 threshold_constant 函数以确定合适的阈值常数。调整“constant”值，直到蠕虫（白色）清晰可见，且背景（黑色）中的椒盐噪声最小。
6. 执行 preference_index 函数，以生成一个 csv 数据表、视频的偏好指数以及相应的蠕虫占据率图。
   1. 将步骤 6.4 和 6.5 中确定的“Q*x”、“Q*y”、“rad”、“ROI_size”和“constant”值作为输入参数传入 preference_index 函数。
      注意：对于每一视频帧，preference_index 函数会统计每个 ROI 中的蠕虫像素数量，并计算蠕虫像素占 ROI 总像素数的百分比。然后，函数使用以下公式为每一视频帧生成一个偏好指数值：
      
      注意：当程序完成对视频中所有帧的分析后，将生成该视频的平均偏好指数值。程序运行结束后，会在指定文件夹中保存一张蠕虫占据率图（视频的偏好指数显示在图顶部）以及一个包含每帧视频的蠕虫像素数、蠕虫占据率百分比和偏好指数的 csv 数据表。

结果

图3A展示了不同基因型与处理组合所获得的偏好指数值。偏好指数为1表示对实验感兴趣区域（ROI）中溶液具有强烈吸引力，而偏好指数为-1则表示强烈排斥。当M13缓冲液同时置于对照和实验ROI中时，获得的偏好指数为0.02，表明对任一ROI均无空间偏好性。N2线虫对铜离子表现出强烈回避，偏好指数为-0.67，这与先前研究结果一致，即铜离子是一种强排斥性刺激（补充视频1）⁴。osm-3突变体由于感觉纤毛远端结构发育异常，对铜离子的回避反应显著减弱（PI = -0.19）¹⁵。ocr-2突变体在多种ASH介导的伤害感受反应（包括回避铜离子）方面存在缺陷，也表现出显著降低的回避行为，甚至对铜离子表现出轻微的吸引（PI = 0.19）（补充视频2）¹⁶。

图3B展示了代表性的线虫占据图，显示了在每段视频中，对照组与实验组感兴趣区域（ROI）内线虫密度随时间的变化情况。绘图区域颜色越深，表示该ROI内的线虫像素数量越多。经M13缓冲液对照处理的N2线虫占据图显示，在整个实验过程中，两个ROI内的线虫数量始终保持相近。然而，经铜离子处理的N2线虫占据图表明，线虫在整个实验过程中强烈且持续地回避实验组ROI。

图1：行为观测室设计的照片与示意图。（A）行为观测室装置的正面视图（左）及其对应的观测室框架示意图（右）。除底面外，观测室的所有侧面均被不透光的聚酯板封闭，底面允许来自红外背光板的光线透过。数字1、2和3对应于（B）中的挤出层结构。（B）构成行为观测室框架的挤出层顶部视图示意图。包括顶层（1）、中间相机安装组件层（2）和底部载物台层（3）。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：溶液放置与培养皿对齐模板。（A）溶液放置模板包含四个象限和数字对齐标记。对照溶液置于左上和右下象限，实验溶液置于右上和左下象限。（B）培养皿对齐模板仅包含数字对齐标记，以在视频录制和分析过程中尽量减少对视野中线虫的遮挡。请点击此处查看此图的放大版本。

图3：使用本检测方法采集的示例数据。 (A偏好指数（PI）值，针对野生型 N2 及突变体 秀丽隐杆线虫 在 M13 缓冲液和 10 mM CuCl 处理下的反应₂N2线虫在两个兴趣区域（ROI）均放置M13对照溶液时，对对照和实验ROI无偏好性；但当实验ROI中放置铜离子时，线虫显著回避该区域（偏好指数PI分别为0.02和-0.67）。 osm-3 (p802) 突变体和 ocr-2 (ak47) 突变体对铜离子的回避能力相较于N2显著降低（PI分别为-0.1和0.2）。每种基因型-处理组合进行6次重复实验。 >每次实验使用360条线虫，误差线表示±1标准误（SEM），***p < 0.001 <0.001，采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行事后Tukey显著性差异检验（HSD）。(B) N2线虫在两个兴趣区域（ROIs）均含有M13缓冲液（上图），以及N2线虫在对照兴趣区域含有M13缓冲液、实验兴趣区域含有铜离子（下图）的代表性线虫占据图。每个占据图下方的颜色标尺表示线虫像素的数量。 请点击此处查看此图的放大版本。

补充视频1：N2线虫对10 mM氯化铜的行为反应。 线虫被含有M13缓冲液的对照象限（左上和右下）吸引，但强烈回避含有溶解于M13缓冲液中铜离子的象限（右上和左下）。视频以每秒1帧的速度录制，并加速15倍。 请点击此处下载该文件。

补充视频 2：行为反应 ocr-2 (ak47) 线虫暴露于10 mM氯化铜。 线虫在记录期间对含有M13缓冲液的对照象限（左上和右下）与含有溶于M13缓冲液的铜离子的象限（右上和左下）的探索范围大致相等。突变体在记录初期对含铜离子的象限表现出轻微偏好。视频以每秒1帧的速度录制，并加速15倍播放。 请点击此处下载该文件。

补充文件：溶液放置与板对齐模板。 请点击此处下载该文件。

讨论

该实验方案中的一个关键步骤是确保在不同实验日之间，检测平板的干燥程度保持一致。干燥程度不同会导致溶液在琼脂中的扩散速率不同，从而引起行为结果的差异。因此，检测平板应始终在实验前一天下午新鲜制备。每个检测中所用线虫的数量也应加以控制，以便于不同处理组之间的比较。作为参考，若按照上述线虫同步化方案操作，野生型线虫平均每小时产卵4-10枚，每个检测可获得>360条子代线虫¹⁷。若某些突变品系存在产卵缺陷，则应挑选更多的怀卵成虫进行产卵，以达到目标子代数量。该实验方案中的另一个重要步骤是在洗涤和转移线虫过程中动作轻柔。线虫对机械刺激敏感，机械刺激会引发应激反应，例如反向运动和产卵抑制¹⁸。此外，在进行视频分析之前，应准确界定感兴趣区域（ROI），并针对特定光照条件确定最佳的阈值常数。如果距离上一次实验已过去较长时间，建议重新进行校准和阈值设定过程。

该方法的一个局限性是不适用于检测小型线虫群体。然而，如果设置了适当的对照以确定食物存在对感觉行为的影响，则利用食物限制线虫的空间探索区域（如保留实验中所用的方法）在此装置中也是可行的。此外，由于所用对照和实验溶液液滴间距较近且体积较小，该方法不适用于研究刺激梯度导航行为。

未来，可将支持多虫体追踪和单个虫体特征提取的编程软件整合到本系统中^19,20。记录单个线虫行为的细微行为参数，例如倒退速度和身体弯曲幅度，将能够在基于群体的实验背景下更详细地描绘个体线虫的化学感应行为。该实验方法还可通过使用适当规格的注射器针头在感兴趣区域（ROI）打孔，并用含有实验化合物或对照缓冲液的琼脂填充孔洞，从而改造用于研究习惯化现象。这将确保在较长的记录时间内化合物表面浓度更加稳定，满足习惯化研究的需要。该方法的另一个潜在应用是开展不同线虫物种间的比较行为研究。此外，行为室可通过多种方式改造，以研究动物对多模态刺激的行为响应。对于光遗传学应用，可在相机支架旁安装高亮度LED阵列，以便在实验过程中选择性激活特定神经元。还可向系统中添加加热元件、冷却装置和温度传感器，以研究温度对感觉行为的影响。此外，可在行为室内安装气味递送系统，用于探究嗅觉与化学感应模态之间的相互作用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
铝制T型槽框架型材	McMaster-Carr	47065T101	单根型材，1"尺寸，实心
连接角码	McMaster-Carr	47065T236	1"长，适用于1"高的单根型材
紧凑型端部进给紧固件	McMaster-Carr	47065T139	1"（单个），每包4个
旋入式实心板固定座	McMaster-Carr	47065T251	适用于1"高的型材
塑料端盖	McMaster-Carr	47065T91	适用于1"高的型材
光学透明浇铸亚克力板	McMaster-Carr	8560K211	3/16"厚，12" × 12"
涂层聚酯纤维布	McMaster-Carr	88505K57	0.027"厚，61"宽，黑色
黄铜衬套	McMaster-Carr	9604K22	标准尺寸0，外径0.545"
钢制垫圈	McMaster-Carr	90107A029	适用于1/4"螺钉
圆头螺钉	McMaster-Carr	90272A546	1/4" - 20螺纹规格，1 - 1/2"长
标准操作背光源	Smart Vision Lights	参见本地供应商	8" × 8"，红外850 nm
IVP-C1可变控制电位器	Smart Vision Lights	参见本地供应商
T1电源	Smart Vision Lights	参见本地供应商
Dino lite Pro AM4113T	Dino-Lite数字显微镜	参见本地供应商
MS09B显微镜支架	Dino-Lite数字显微镜	参见本地供应商