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线虫群体化学感应偏好性实验的自动化分析

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DOI：

10.3791/55963

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2017年7月13日

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1Division of Biology and Bioengineering, California Institute of Technology, 2Howard Hughes Medical Institute, California Institute of Technology

本文内容

摘要

我们介绍了一种行为记录装置和实验方案，可实现对线虫Caenorhabditis elegans在基于群体的实验中对可溶性化合物偏好性的自动化分析。本文描述了行为检测室的构建方法、行为学实验方案以及视频分析软件的使用。

摘要

线虫， 秀丽隐杆线虫仅由302个神经元组成的紧凑神经系统支撑着多种多样的行为表现。为了促进对这些行为背后神经回路的解析，有必要开发出可靠且可重复的行为学检测方法。此前 秀丽隐杆线虫 行为学研究已采用“坠落试验”、“趋化性检测”和“滞留检测”的多种变体来研究生物体的反应 秀丽隐杆线虫 转化为可溶性化合物。本文所述方法旨在结合上述三种检测技术的互补优势。简言之，在每个检测平板中央绘制一个小圆圈，并将其分为四个象限，交替放置对照溶液与实验溶液。加入线虫后，将检测平板置入行为检测室，由显微镜摄像头记录线虫与处理区域的相互作用过程。随后进行自动视频分析，为每段视频生成一个偏好指数（PI）值。该方法的视频采集与自动化分析功能最大限度减少了实验人员的参与及由此可能引入的误差。此外，每次检测仅需使用极微量的实验化合物，且行为检测室配备的多摄像头系统可显著提高实验通量。该方法特别适用于对遗传突变体和新型化合物进行行为筛选。然而，由于对照区与实验区距离较近，该方法不适用于研究刺激梯度导航行为。当仅有少量线虫样本可用时，也不应采用此方法。目前该方法仅适用于检测对可溶性化合物的反应，但可轻松改进以适应多模态感官交互及光遗传学研究。该方法亦可调整用于检测其他线虫物种的化学感受反应。

引言

觅食动物必须整合来自多种感觉模式的输入，并选择适当的行为策略，才能成功地在其环境中进行导航。理解外部感觉输入如何被接收并转化为神经信息以指导行为选择，是神经生物学领域的一个核心目标。这种遗传上易于操作的线虫， 秀丽隐杆线虫是一种研究感觉生物学及多模态整合神经机制的优选模式生物。尽管 秀丽隐杆线虫 仅有302个神经元，却能够检测并区分多种环境刺激，包括可溶性化合物、挥发性气味分子以及环境温度1,2,3,4,5,6,7线虫 秀丽隐杆线虫 严重依赖其化学感受装置来定位食物来源并警示潜在威胁。因此，用于筛选野生型和突变型个体反应的行为学实验 秀丽隐杆线虫 对化学刺激的反应在解析遗传、细胞和神经机制中起着至关重要的作用 秀丽隐杆线虫出色的感官能力。

为了检测线虫对可溶性化合物的反应，已有三种检测方法被描述——液滴试验、趋化性实验和滞留实验。在液滴试验中，将少量待测化合物滴加至正在移动的线虫尾部，当液体到达线虫前端感觉器官时，记录线虫选择后退还是继续向前移动的行为4。液滴试验所需的实验准备较少，在线虫样本量较小时尤为适用，例如经激光操作处理的线虫。然而，由于每次只能检测一条线虫，且实验过程中需要研究人员全程在场，因此该方法耗时较长。此外，液滴试验还容易因每条线虫施加液滴时存在操作差异，从而影响整体实验结果。该方法的另一局限性在于，仅适用于检测线虫对厌恶性化合物的反应，因为无法通过线虫的前向运动区分化合物是具有吸引作用还是中性效应。

可溶性化合物的趋化性实验通常包括将琼脂平板分为四个象限，将实验溶液混入相对的两个象限的琼脂中，对照溶液则混入另外两个象限8,9。实验开始时，在平板中心放置一滴含有线虫的缓冲液，并在不同时间点统计各象限中的线虫数量。与滴加实验相比，趋化性实验具有更高的统计效力，因为每次实验可检测大量线虫。然而，该方法的一个局限性在于制备趋化性实验平板需要较大量的实验化合物。如果目标化合物的获取需要经过复杂的纯化过程且产率有限（例如ascaroside信号分子的情况），则难以开展大规模的行为筛选10。此外，实验过程中需人工计数线虫，容易引入误差，且计数时对平板的扰动可能影响实验结果。

与前述两种方法不同，滞留实验利用机器视觉技术，可在评分过程中最大限度地减少误差，并降低实验人员在检测过程中的干扰11。对线虫行为视频记录的计算机分析还可能揭示出更细微的行为动态，而这些动态在仅于少数离散时间点进行评分时容易被忽略。在滞留实验中，将两种溶液液滴分别加在微小圆形细菌食物斑的相对两侧，随后将少量线虫放置于食物斑中央。然后对线虫行为进行视频记录和分析，并根据每种溶液区域中线虫像素的总数计算偏好指数值。尽管存在吸引性食物斑可使每次实验中使用的线虫群体数量减少，但先前研究已表明食物会增强线虫对可溶性驱避剂的回避行为12。此外，线虫对短波长光具有避光反应，在行为记录装置中使用发出白光的显微镜光源可能会影响其行为13。

本文所讨论方法的目的是利用基于群体的检测手段，记录并分析秀丽隐杆线虫（C. elegans）对可溶性化合物的偏好性。为此，本方法整合并改进了此前所述三种方法的各项优点。该方法能够检测大量线虫群体，且每次实验仅需使用少量待测溶液。此外，实验在定制的封闭式行为检测室中进行，并采用红外LED背光照明，以最大限度减少短波长光对线虫行为的影响。每个检测室还可配备多个显微镜摄像头，在不占用额外实验台空间的情况下提高实验通量。最后，视频分析软件会为每段视频输出一个偏好指数值，同时生成相应的线虫分布图，以可视化群体行为随时间的变化动态。该检测室装置和实验方案还可进一步修改，用于研究多模态行为反应，例如气味物质或温度对化学感受行为的影响。

本文介绍了行为检测室的构建方法和实验方案，展示了该方法在检测野生型线虫及化学感应缺陷突变体对已知可溶性驱避剂铜离子4反应中的应用。最后，详细说明了使用所提供软件进行视频分析的过程。

方案

1. 行为实验装置组装

注意：行为实验箱由挤压铝型材构成的大致呈立方体形状的框架组成，外部覆盖不透明织物罩，底部为透明亚克力板，并设有相机支撑结构。构成行为实验箱的挤压铝型材之间的连接均为直角，使用“L”形角码（1英寸宽，腿长1英寸）固定，通过螺丝和滑入式T型螺母将角码的一条腿固定在每根型材上。每个连接处根据下文描述使用一个或两个角码进行固定。织物罩通过织物角部的金属环，利用相同的螺丝和滑入式T型螺母固定在铝型材框架上。安装时，螺丝应正确插入滑入式T型螺母的沉孔一侧，而非带有凸起边缘的一侧。当将螺丝/T型螺母紧固组件安装到铝型材上时，应将T型螺母滑入型材相应表面的槽道内，使螺丝头部从槽口伸出。

  1. 制备织物覆盖物。
    1. 使用剪刀将不透明的聚酯织物剪成五块，以覆盖腔体的顶部和四个侧面。
      1. 裁剪一个14 x 14英寸的正方形2 用于培养室顶部的织物片。裁剪四块11 x 14英寸的矩形布料2 用于 chamber 侧面的织物片
    2. 在织物片的四个角安装环扣。
      1. 用铅笔和直尺在所有五块聚酯织物片的每一边边缘0.5英寸处标记参考线。
      2. 对于四块矩形布料，使用打眼钳在每个角落铅笔线交叉处的中心位置安装孔环（即每块布料安装 4 个孔环）。
      3. 对于方形布料，沿每条边各安装两个吊环，每个吊环居中于铅笔线，并位于四条铅笔线各自端点内侧1.5英寸处（即共安装8个吊环，每个角落附近各两个）。
    3. 在每个孔眼中插入一颗螺丝，并将T型螺母松松地固定在每个孔眼上。
  2. 制作相机支架杆。
    1. 使用带锯或同等工具，为每台相机切割一段2英寸长的铝制挤出条，确保切口端面与条状物长度方向垂直，以便后续组装。
    2. 使用台钻和直径为0.25英寸的钻头，在每个相机支架条的中心腹板上距一端0.75英寸处钻孔，使孔垂直于条的顶面和底面，并穿过条的中心线。也可选择使用手持式电钻和0.25英寸钻头钻孔，但需确保孔垂直于支架条的顶面和底面。
  3. 准备所有角撑板。
    1. 从角铁支架每条支腿的内角侧穿入螺钉，穿过支腿上的孔洞，并在每根螺钉上松松地拧上一个T型螺母。
  4. 准备相机支架组件（图1B第2层
    注意：相机支架组件为“H”形结构，用于支撑三个相机套座。
    1. 将相机支架的连接杆固定到相机支架组件的中心杆上。
      1. 将1.2步骤中制作的三根相机安装杆展开，使钻孔端垂直朝上。在每根安装杆远离钻孔的一端两侧，各套上两个角码。
      2. 将角撑板的支脚与杆的末端对齐并固定，拧紧螺丝以固定位置。这样可形成一个“T”形结构，其中“T”的底部为钻孔位置。
      3. 将一根1英尺长的铝型材放置在工作台面上。将上一步骤中的一个相机安装条组件的T型螺母滑入该1英尺长型材的一侧。使安装条在1英尺长型材的长度方向上居中，拧紧螺丝以固定。将另外两个安装条滑入1英尺长型材的另一侧。
      4. 将两根立柱对称地固定在1英尺长横杆的中点两侧，使其内侧角码相距约2.5英寸。在1英尺长横杆的两端各套上两个角码，将角码的支脚与横杆末端对齐，然后拧紧螺丝以固定。
    2. 将端杆连接到中心杆上。
      1. 将两根1英尺长的铝型材滑入上一步组装件两端的T型螺母中，形成“H”形结构。将两端的横杆居中对准中间横杆，并拧紧四颗螺丝加以固定。
      2. 将四个角支架滑入上一步中安装的两根端杆的顶部，每根杆的两端各一个。将角支架的支脚与杆的末端对齐，拧紧螺丝以固定。
    3. 将相机支架和固定套件安装到相机安装组件上。
      1. 对于三台显微镜相机支架中的每一台，松开拇指螺丝并从支架杆上滑下相机套筒，以取下相机套筒。
      2. 对于每个相机安装杆（现已固定在“H”形结构的中心杆上），将一个垫圈套入一个圆头螺钉，从相机安装杆的钻孔下方穿入螺钉，并在螺钉上方再放置一个垫圈。将相机支架杆的螺纹孔旋紧至该螺钉上，确保牢固地压紧相机安装杆。
      3. 重复步骤14.3.2，用于另外两个相机安装支架杆。
      4. 将相机套筒滑入每个相机支架的立杆上，宽口朝向相机安装杆和螺丝方向。使用套筒的拇指螺丝暂时将套筒固定在相机支架立杆上。
        注意：最终操作位置将在第 2 节中设定。
  5. 组装行为实验箱框架（图1A).
    注意：为便于组装，应将框架倒置安装，即从腔室框架的“顶部”开始，将其置于工作台面上图1B，第1层），并向上工作至框架的“脚”部（图1B第3层
    1. 组装行为实验箱的顶层时，将四根1英尺长的挤压铝条固定在方形聚酯板上（图1B第1层
      1. 将一根横杆沿织物片每侧边缘的两个T型螺母滑入，并使横杆位于织物宽度方向的中央。拧紧紧固件，将织物片固定在每根横杆上。
      2. 将方形聚酯薄膜平铺在工作台面上，四根附带的铝条朝上。将八个角码分别套在四根铝条的顶端表面，每根铝条两端各一个。调整角码位置，使其垂直边与铝条端部对齐，通过拧紧螺钉固定至T型螺母中。
    2. 在每个角落依次安装一根额外的1英尺铝型材立柱，将型材套入角码两条支腿上的T型螺母。
    3. 通过拧紧固定件将立杆与横杆连接，从而将两个相邻的横杆固定在一起。
      注意：完成后，八个挤出部分（四个水平方向和四个垂直方向）将在桌面上形成一个方形环，四个柱体向上突出（图1B第1层
    4. 将1.4节中“H”形相机支架组件的松动T型螺母从上一步骤中框架立柱的顶部插入。使“H”形支架完全下滑，直至其底部与框架每个角落的角码上表面贴合。通过拧紧四个角码上的螺钉，将相机支架组件固定到位。
    5. 使用最后四根1英尺长的挤压铝型材组装腔室的底层图1B第3层
      1. 将一个角码滑入每根1英尺长横杆的两端，使角码的支脚与横杆末端对齐，然后拧紧螺丝以固定。
      2. 将横杆连同位于立柱槽道内松动的T型螺母一起插入框架立柱之间。调整横杆位置，使其角码的上边缘低于立柱开口端1英寸，然后拧紧角码螺钉以固定位置。
  6. 将四个矩形聚酯片的T型螺母滑入立式挤压条的槽道中，以覆盖腔室的侧面，并拧紧紧固件以固定到位。
  7. 选择一侧作为进入腔室内部的门，拆下腔室底层的两个螺丝和T型螺母。
    注意：当框架直立时，此盖子的底部将悬垂于底部，可将其掀起以接触腔室内部。
  8. 在每个角件的顶端安装一个塑料帽，作为完成后的框架支脚。将框架正放。在框架底层内部每侧插入两个面板固定夹，并旋转以固定到位（图1B，第3层）。放置一张12英寸×12英寸2 在面板支架上方放置一块透明丙烯酸板，作为检测板的平台（图1B第3层

2. 相机与载物台模板定位

  1. 从制造商网站下载显微镜相机视频采集软件，并将其安装到计算机上。
  2. 将显微镜相机插入三个相机固定套筒中，使相机光学镜头朝下对准亚克力载物台和背光源。将相机连接至计算机的 USB 接口。将红外 LED 背光板置于框架下方，居中对准载物台。接通背光板电源以开启。
  3. 将提供的溶液放置和培养皿对齐模板打印在透明胶片上（见补充文件）。
    注意：在溶液放置模板上，培养皿轮廓圆的直径为 3.8 cm，内部感兴趣区域圆的直径为 0.9 cm。
  4. 沿网格线剪切，获得包含圆形模板的矩形透明胶片。
  5. 启动视频采集软件，点击窗口顶部的编号缩略图以查看各相机的实时画面。
  6. 调整显微镜相机的对齐和放大倍数。
    1. 将一个培养皿对齐模板置于显微镜相机镜头下方（图 2B）。
    2. 通过沿相机支架杆垂直滑动相机固定套筒来调节工作距离，并旋转相机的放大倍数调节旋钮，直至模板上的数字标记在相机视野边缘清晰可见。
    3. 用胶带将培养皿对齐模板固定在亚克力载物台上。
    4. 将装有线虫样本的培养皿放置在显微镜相机下的对齐模板上，进一步微调放大倍数和工作距离，使线虫图像清晰，同时确保数字标记仍保留在视野范围内。
    5. 对另外两个显微镜相机重复步骤 2.6.1–2.6.4。

3. 线虫的培养与同步化

  1. 实验开始前四天，在二十四个 60 mm 线虫生长培养基（NGM）琼脂平板上接种 50 µL OP50的 大肠杆菌 在LB（Luria-Bertani）肉汤中（配方见第5节）。
    注意：每个60毫米培养皿可提供足够用于一个检测培养皿的线虫。建议每种处理或基因型设置六个重复。
  2. 将接种好的平板盖上皿盖，室温下正置过夜晾干。
  3. 第二天，将十五只喂养良好且带有卵的雌雄同体线虫转移至每个接种的培养板上，让线虫产卵六小时。这将产生 >每板 360 枚卵。
  4. 6 小时后，将线虫从接种平板上移出，让子代在平板上继续生长三天至成虫期 20 °C.

4. 化感偏好实验

  1. 实验前一天，准备35 mm NGM琼脂检测平板。
    1. 制备250 mL NGM琼脂（配方见第5节）。
    2. 将二十八个空的35 mm培养皿平放在平面上，每堆不超过五个。每个检测平板中加入5 mL NGM琼脂。将检测平板盖上盖子直立放置，在室温下过夜晾干。
      注意：作为经验法则，为每种待检测的处理或基因型额外准备一个检测平板，以应对意外情况。
  2. 实验当天，打开背光灯，启动计算机，并运行显微镜相机视频采集软件。
  3. 将显微镜相机连接至计算机，并调整视频录制设置。
    1. 点击软件窗口顶部的编号相机缩略图，以查看相机的实时画面。
    2. 点击相机画面左上角的“视频格式”下拉菜单，选择“MJPG 1280 x 1024”。点击“视频格式”菜单旁边的“文件夹”下拉菜单，选择用于保存视频文件的文件夹。
    3. 点击相机画面右上角的“自动曝光”图标，关闭自动曝光功能。点击紧邻“自动曝光”图标的“LED”图标，关闭显微镜相机内置的LED灯。点击相邻的“设置”图标：选择“黑白”模式，将“对比度”调至最大，并调节“亮度”，使线虫与背景清晰可辨。
  4. 采集校准视频。
    1. 将溶液放置模板对齐放置在载物台对齐模板上方（图2A）。点击相机画面左侧的“延时视频”录制图标，在持续时间中输入“5”秒，间隔输入“1”秒，以每秒1帧的速度录制5秒视频。点击“开始”以开始录制视频。
  5. 对另外两台显微镜相机重复步骤4.3和4.4。
  6. 从检测室中移除溶液放置模板。
  7. 用洗涤缓冲液清洗线虫三次，以去除食物残留。
    1. 使用5 mL玻璃移液管向同步化线虫平板中加入1.2 mL NGM缓冲液，并轻轻晃动平板，使线虫悬浮于缓冲液中。用移液器吸取平板中的缓冲液，将含有线虫的缓冲液转移至洁净的微量离心管中。
      注意：线虫对培养琼脂中盐浓度的偏离较为敏感14。为尽量减少线虫放置后琼脂盐浓度的变化，建议在洗涤过程中使用NGM缓冲液（配方见第5节）。不要使用塑料移液管从平板中转移线虫，因为线虫会粘附在管壁上。准备与同时运行的检测平板数量相等的离心管。
    2. 让三支离心管静置1-2分钟，使线虫沉降至管底。使用塑料移液枪头尽可能多地吸除洗涤缓冲液，注意不要扰动管底聚集的线虫沉淀。然后向每支离心管中重新加入1 mL新鲜NGM缓冲液。
    3. 重复步骤4.7.2一次。
  8. 向检测平板中加入10 mM CuCl2和M13缓冲液溶液（配方见第5节）。
    1. 将溶液放置模板用胶带固定在解剖显微镜载物台上方。
    2. 在对齐模板两侧贴上双面胶带。确保胶带覆盖平板的边缘圆圈，但不遮挡模板中心的记录兴趣区域。
    3. 将检测平板的边缘与对齐模板上的圆圈对齐，并向下按压，使模板粘附在平板底部。将检测平板模板上的编号标记与解剖显微镜上的溶液放置模板标记对齐。
    4. 使用P2移液器和塑料枪头，在第1和第4象限各加入1 µL M13缓冲液（图2A）。使用新的枪头，在第2和第3象限各加入1 µL 10 mM CuCl2溶液（图2A）。
    5. 对另外两个检测平板重复步骤4.8.2–4.8.4。
  9. 待液滴完全被琼脂吸收后，使用玻璃巴斯德移液管将各微量离心管中已洗涤的线虫转移至对应的检测平板。
  10. 在圆形处理区域的上方和下方各滴加一滴线虫。将纸巾折叠四次，使用其钝边吸除所有检测平板上的过量洗涤缓冲液。
  11. 立即将在行为检测室中将三个检测平板按照模板角落的编号与显微镜相机对齐放置。静置2-3分钟，使线虫适应检测平板环境。
    注意：在下一步开始视频录制前，确保行为检测室的门帘已关闭。
  12. 点击相机画面左侧的“延时视频”录制图标，在持续时间中输入“10”分钟，间隔输入“1”秒，以每秒1帧的速度录制10分钟视频。点击“开始”以启动视频录制。视频录制并保存完成后，从检测室中取出检测平板。
  13. 对下一组检测平板重复步骤4.7–4.12。每种处理或基因型至少进行六次重复或两轮录制。

5. 试剂制备

  1. 制备 NGM 琼脂和缓冲液。
    1. 在 1 L 玻璃瓶中加入 1.5 g 氯化钠、8.5 g 琼脂和 1.25 g 蛋白胨。向瓶中加入 500 mL 蒸馏水和一个搅拌子。将瓶连同内容物一起高压灭菌。
    2. 将瓶子放在搅拌器上，并开启搅拌功能。
    3. 使用无菌操作技术依次加入：0.5 mL 的 5 mg/mL 胆固醇溶液、0.5 mL 的 1 M 氯化钙溶液、0.5 mL 的 1 M 硫酸镁溶液，以及 12.5 mL 的 1 M 磷酸钾溶液。
    4. 重复步骤 5.1.1 至 5.1.2 以制备 NGM 缓冲液，但在步骤 5.1.1 中省略琼脂和蛋白胨。
  2. 制备 LB 肉汤。
    1. 在 1 L 玻璃瓶中加入 5 g 胰蛋白胨、2.5 g 酵母提取物、2.5 g 氯化钠、500 mL 蒸馏水和 0.5 mL 的 1 N 氢氧化钠溶液。将瓶连同内容物一起高压灭菌。
  3. 制备 M13 缓冲液。
    1. 在 1 L 玻璃瓶中加入 1.817 g Tris、2.922 g 氯化钠、0.373 g 氯化钾和 500 mL 蒸馏水。将瓶连同内容物一起高压灭菌。
  4. 制备氯化铜（CuCl2）溶液。
    1. 称取 0.134 g CuCl2，将溶质加入含有 10 mL M13 缓冲液的 15 mL 塑料管中，配制成 100 mM CuCl2 储存液。反复倒置塑料管直至所有溶质完全溶解。
    2. 使用注射器和 0.2 µm 膜滤器将 100 mM CuCl2 溶液过滤纯化至洁净的 15 mL 塑料管中。
    3. 为配制 10 mM CuCl2 溶液，向一个微量离心管中加入 900 µL M13 缓冲液和 100 µL 100 mM CuCl2 储存液。反复倒置微量离心管以充分混匀。

6. 视频分析

  1. 下载 Python 3（https://www.python.org/downloads/）和 OpenCV 软件库（http://opencv.org/downloads.html）。
  2. 下载用于分析的三个 Python 脚本（https://github.com/WormLabCaltech/ResidentWorm）。
    注意：请确保所有待使用的视频文件均为 mp4 格式，然后再继续操作。
  3. 要查看函数和参数说明，请在控制台中输入“help(函数名)”并按回车键。例如，输入“help(calibration)”后按回车键。
  4. 执行校准函数，并输入参数以定义视频中的感兴趣区域（ROI）。
    1. 将第 4 节中拍摄的校准视频的文件名输入变量“mp4filename”中。输入文件名时需包含引号。
    2. 将“Q*x”和“Q*y”变量的初始值设为 600 和 360。*输入象限编号 1 至 4。将“rad”变量的初始值设为 310。调整这些变量的值，直到 ROI 掩膜与模板上的象限轮廓对齐。
    3. 记录执行该函数后在控制台中打印出的每个 ROI 的总像素数。将此值作为“ROI_size”参数输入到 preference_index 函数中。
  5. 执行 threshold_constant 函数以确定合适的阈值常数。调整“constant”值，直到 worms（白色）清晰可见，且背景（黑色）中的椒盐噪声最小。
  6. 执行 preference_index 函数，以生成一个 csv 数据表、视频的偏好指数以及相应的 worms 占据图。
    1. 将步骤 6.4 和 6.5 中确定的“Q*x”、“Q*y”、“rad”、“ROI_size”和“constant”值作为输入参数用于 preference_index 函数。
      注意：对于每一视频帧，preference_index 函数会统计每个 ROI 中的 worms 像素数量，并计算 worms 像素占 ROI 总像素数的百分比。然后，函数使用以下公式为每一视频帧生成偏好指数值：
      用于 worms 行为分析的偏好指数（PI）公式；研究中使用的数学方程
      注意：程序分析完视频中的所有帧后，将生成该视频的平均偏好指数值。程序运行结束后，将在指定文件夹中保存一张 worms 占据图（顶部显示该视频的偏好指数）以及一个包含每帧视频的 worms 像素数、worms 占据百分比和偏好指数的 csv 数据表。

结果

图 3A 显示了不同基因型与处理组合所获得的偏好指数值。偏好指数值为 1 表示对实验 ROI 中溶液具有强烈趋近性，而偏好指数值为 -1 表示强烈回避。当 M13 缓冲液同时置于对照和实验 ROI 时，获得的偏好指数为 0.02，表明对任一 ROI 均无空间偏好偏倚。N2 蚯蚓对铜离子表现出强烈回避，偏好指数为 -0.67，这与先前研究结果一致，即铜离子是一种强效驱避剂（补充影片 1）4。osm-3 突变体因感觉纤毛远端节段无法正常形成，对铜离子的回避反应显著降低（PI = -0.19）15。ocr-2 突变体在多种由 ASH 神经元介导的伤害感受反应（包括回避铜离子）中存在缺陷，也表现出显著降低的回避行为，甚至对铜离子产生轻微趋向性（PI = 0.19）（补充影片 2）16。

图3B展示了典型的线虫分布图，显示了在每个视频的时间过程中，对照区域与实验区域中线虫密度的变化情况。绘图区域颜色越深，表示该区域内线虫像素数量越多。N2线虫经M13缓冲液对照处理后的分布图显示，在整个实验过程中，两个区域内的线虫数量保持相近。然而，N2线虫经铜离子处理后的分布图表明，线虫在整个实验过程中对实验区域表现出强烈且持续的回避行为。

细胞追踪显微镜装置示意图，包含相机、铝制框架和背光板。
图1：行为观测室设计的照片与示意图。（A）行为观测室装置的正面视图（左）及其对应的框架示意图（右）。除底面外，观测室的所有侧面均被不透光的聚酯板封闭，底面允许来自红外背光板的光线透过。数字1、2和3对应于（B）中的挤出层。（B）构成行为观测室框架的挤出层的俯视示意图。包括顶层（1）、中间相机安装组件层（2）和底部载物台层（3）。请点击此处查看此图的放大版本。

对照组与实验组象限图；用于比较分析的显微镜设置。
图 2：溶液放置与培养皿对齐模板。（A）溶液放置模板分为四个象限，并带有数字对齐标记。对照溶液置于左上和右下象限，实验溶液置于右上和左下象限。（B）培养皿对齐模板仅保留数字对齐标记，以在视频录制和分析过程中尽量减少对视野中线虫的遮挡。请点击此处查看此图的放大版本。

Cu²⁺处理条件下比较不同基因型的偏好指数图表与时间序列热图
图3：使用本检测方法采集的示例数据。 (A) 野生型 N2 与突变体的偏好指数（PI）值 秀丽隐杆线虫 在 M13 缓冲液和 10 mM CuCl 处理下的反应2N2 蠕虫在两个 ROI 中均放置 M13 对照溶液时，对对照和实验 ROI 无偏好性；但当实验 ROI 中放置铜离子时，N2 蠕虫显著回避该区域（偏好指数 PI 分别为 0.02 和 -0.67）。 osm-3 (p802) 突变体和 ocr-2 (ak47) 与N2相比，突变体对铜离子的回避显著降低（PI分别为-0.1和0.2）。每种基因型-处理组合进行6次重复实验。 >每次实验使用360条线虫，误差线表示±1标准误（S.E.M.），***p < 0.001 <0.001，采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行事后 Tukey 真实显著性差异（HSD）检验。B代表性线虫分布图：上图为在两个感兴趣区域（ROIs）中均含有M13缓冲液的N2线虫，下图为在对照ROIs中含M13缓冲液、在实验ROIs中含铜离子的N2线虫。每个分布图下方的颜色标尺表示线虫像素的数量。 请点击此处以查看此图的放大版本。

补充视频 1：N2 线虫对 10 mM 氯化铜的行为反应。线虫被含有 M13 缓冲液的对照象限（左上和右下）吸引，但强烈回避含有溶解于 M13 缓冲液中铜离子的象限（右上和左下）。视频以每秒 1 帧的速度录制，并加速 15 倍。请点击此处下载该文件。

补充视频 2：行为反应的 ocr-2 (ak47) 蠕虫暴露于10 mM氯化铜。 线虫在记录期间对含有M13缓冲液的对照象限（左上和右下）与含有溶于M13缓冲液的铜离子的象限（右上和左下）的探索范围大致相等。突变体在记录初期对含铜离子的象限表现出轻微偏好。视频以每秒1帧的速度录制，并加速15倍播放。 请点击此处下载此文件。

补充文件：溶液放置与板对齐模板。 请点击此处下载该文件。

讨论

该实验方案中的一个关键步骤是确保在不同实验日之间，检测平板的干燥程度保持一致。干燥程度不同会导致溶液在琼脂中的扩散速率不同，从而引起行为结果的差异。因此，检测平板应始终在实验前一天下午新鲜制备。每个检测中所用线虫的数量也应加以控制，以便于不同处理组之间的比较。作为参考，若按照上述线虫同步化方案操作，野生型线虫平均每小时产卵4–10枚，每个检测可获得>360条子代线虫17。若某些突变品系存在产卵缺陷，则应挑选更多怀卵成虫进行产卵，以达到目标子代数量。本方案中的另一个重要步骤是在洗涤和转移线虫过程中动作轻柔。线虫对机械刺激敏感，机械刺激可能引发应激反应，如反向运动和产卵抑制18。此外，在进行视频分析之前，应准确界定感兴趣区域（ROI），并针对特定光照条件确定最佳的阈值常数。如果距离上次实验已过去较长时间，建议重新进行校准和阈值设定过程。

该方法的一个局限性是，它不适用于检测小型线虫群体。然而，如果设置了适当的对照以确定食物存在对感觉行为的影响，那么利用食物限制线虫的空间探索位置（如保留实验中所采用的方法）在此装置中也是可行的。此外，由于所使用的对照和实验溶液液滴间距较近且体积较小，该方法并不适用于研究刺激梯度导航行为。

未来，可将支持多虫体追踪和单虫体特征提取的编程软件整合到该系统中19,20。记录单个线虫行为的细微行为参数，例如倒退速度和身体弯曲幅度，将能够在基于群体的检测背景下更详细地描绘个体线虫的化学感受行为。该检测方法还可通过使用适当规格的注射器针头在感兴趣区域（ROI）打孔，并用含有实验化合物或对照缓冲液的琼脂填充孔洞，从而改造用于研究习惯化现象。这将确保在较长记录时间内化合物表面浓度更加稳定，满足习惯化研究的需要。该方法的另一个潜在应用是开展不同线虫物种间的比较行为学研究。此外，行为检测室可通过多种方式改造，以研究生物对多模态刺激的行为响应。对于光遗传学应用，可在相机支架旁安装高亮度LED阵列，以便在检测过程中选择性激活目标神经元。还可向装置中添加加热元件、冷却系统和温度传感器，以研究温度对感觉行为的影响。此外，可在检测室内安装气味递送系统，用于探究嗅觉与化学感受模态之间的相互作用。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

部分菌株由线虫遗传学中心（CGC）提供，该中心由美国国立卫生研究院研究基础设施项目（P40 OD010440）资助。本工作由霍华德·休斯医学研究所支持，P.W.S. 为该研究所的研究员。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
铝制T型槽框架型材McMaster-Carr47065T101单根型材，1"尺寸，实心
连接角码McMaster-Carr47065T2361"长，适用于1"高单根型材
紧凑型端部进给紧固件McMaster-Carr47065T1391"（单个），每包4个
旋入式实心板固定夹McMaster-Carr47065T251适用于1"高型材
塑料端盖McMaster-Carr47065T91适用于1"高型材
光学透明浇铸亚克力板McMaster-Carr8560K2113/16"厚，12" × 12"
涂层聚酯纤维布McMaster-Carr88505K570.027"厚，61"宽，黑色
黄铜衬套McMaster-Carr9604K22标准尺寸0，外径0.545"
钢制垫圈McMaster-Carr90107A029适用于1/4"螺钉
圆头螺钉McMaster-Carr90272A5461/4" - 20螺纹，1 - 1/2"长
标准操作背光源Smart Vision Lights参见本地供应商8" × 8"，红外850 nm
IVP-C1可变控制电位器Smart Vision Lights参见本地供应商
T1电源Smart Vision Lights参见本地供应商
Dino lite Pro AM4113TDino-Lite数字显微镜参见本地供应商
MS09B显微镜支架Dino-Lite数字显微镜参见本地供应商

参考文献

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线虫群体化学感应偏好性实验的自动化分析
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