本文描述了一种 体外 一种能够实现活细胞成像的胚珠培养方法 拟南芥 受精卵和胚胎。该方法用于观察受精卵极化过程中的细胞内动态以及发育中胚胎的细胞命运决定。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
体外 胚珠培养用于活细胞成像观察拟南芥Arabidopsis thaliana受精卵极性建立与胚胎模式形成
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
在大多数开花植物中，合子和胚胎深藏于母体组织内部，因此其动态发育过程长期以来一直是个谜；例如，合子如何极化以建立体轴，以及胚胎在器官形成过程中如何确定多种细胞命运。本文描述了一种 体外 胚珠培养方法用于对发育中的合子和胚胎进行活细胞成像 拟南芥优化的培养基可使合子或早期胚胎发育为可育植株。将其与聚二甲基硅氧烷（poly(dimethylsiloxane), PDMS）微柱阵列装置结合，可将胚珠固定在液体培养基中的同一位置。这种固定对于在数天内持续显微观察同一胚珠从合子分裂到胚胎晚期的发育过程至关重要。由此实现的活细胞成像可用于实时监测合子极性建立过程中的动态变化，如细胞核迁移和细胞骨架重排，以及胚胎模式形成过程中的细胞分裂时序和细胞命运决定。此外，该胚珠培养系统可结合抑制剂处理，用于分析各种因素对胚胎发育的影响；也可结合光学操控手段（如激光破坏）来研究细胞间通讯在发育中的作用。
引言
生物体的基本体轴结构起源于单细胞合子。在大多数开花植物中，合子分裂产生一个顶端细胞和一个基底细胞，分别发育为地上部分和根部1因此，了解植物在胚胎发生过程中如何形成具有重要意义，但由于合子和胚胎在花内部深处发育，目前尚缺乏有效工具来直接观察其活体动态。在玉米和水稻等一些单子叶植物物种中 体外 已建立受精方法2,3在此方法中，分离的精细胞和卵细胞通过电或化学方法融合，所形成的细胞可发育成可育植株。但在双子叶植物中，尚无 体外 一种能够产生正常胚胎的受精方法，推测是由于雄性和雌性配子的细胞周期状态不同步所致4,5此外，包裹胚胎的组织（胚乳）在胚胎发育过程中发挥着重要作用6.
在双子叶植物模式物种 A. thaliana 中，研究人员通过关注包含胚胎和胚乳的整个胚珠，建立了一种 体外 培养方法7。该体系已成功用于分析多种化学试剂对胚胎发生的影响，但由于存活率较低，不适合进行延时成像。因此，为了能够从合子阶段开始培养并以较高比例获得可育植株，研究人员开发了一种新型的 体外 胚珠培养系统8。经过多次试验发现，Nitsch 培养基和海藻糖显著提高了胚珠的存活率8。此外，由于胚珠在生长过程中会不断膨大，常常移出显微镜的观察视野，因此开发了一种 PDMS 装置以将胚珠固定在培养基中9。该 PDMS 装置实现了长达 3 至 4 天的长期成像，足以追踪从合子到心形胚阶段的发育过程。利用该方法，不仅可以在正常条件下，还可以在化学抑制剂存在或不同突变体背景下，可视化合子极化和胚胎模式形成的动态过程8,10,11。
图1：通过胚珠观察合子和胚胎所用特异性荧光标记物的示意图。
拟南芥合子在胚珠内发育成胚胎，而胚珠位于花的内部深处。在此体外培养系统中，需透过胚珠观察合子和胚胎，因此使用那些不在其他胚珠组织中表达的特异性荧光标记物至关重要。 请点击此处查看该图的放大版本。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 准备 体外 胚珠培养基
- 制备液体培养基体外 胚珠培养（“N5T培养基”），含1x Nitsch基础盐混合物、5% (w/v) 海藻糖二水合物、0.05% (w/v) 2-(N-吗啉代)乙磺酸-KOH (MES-KOH, pH 5.8)，以及1x Gamborg维生素溶液。
- 用KOH调节pH至5.8。
- 通过高压灭菌器对培养基进行灭菌（121 °C，20 分钟）或通过 0.22-µm 过滤器
注意：灭菌后的培养基可保存于 4 °C 2 - 3 个月。
2. PDMS 微柱阵列装置的制备
- 使用刀片、剃刀或剪刀将PDMS微柱装置裁剪至合适大小，以放入35 mm玻璃底培养皿的玻璃部分（直径14 mm）。
注意：PDMS装置的完整制备步骤已在先前的研究论文8,9中详细描述，因此此处省略具体细节。对于短期成像实验，也可使用体积较小的玻璃底培养器皿，例如4孔板或96孔板，无需使用该装置。 - 将PDMS装置的上表面置于紫外灯下照射15分钟进行灭菌。
- 使用方头镊子将PDMS装置翻转，使其底面朝上，并继续在紫外灯下照射15分钟以灭菌底部。
- 将灭菌后的PDMS装置转移至35 mm培养皿中，加入N5T培养基，直至装置完全浸没于培养基中（约5–7 mL）。
- 将培养皿放入真空室中，降低压力以去除气泡。持续抽真空3小时至过夜，直至装置内的空气完全被培养基取代。
注意：在强真空条件下，装置可能因气泡产生而脱落。 - 用方头镊子夹取装置，从培养皿中取出并放置于纸巾上，以去除侧面和底部多余的培养基。
注意：微柱阵列部分（上表面）上的培养基不应去除，因其将用于后续胚珠的培养。 - 将装置转移至76 mm × 26 mm的载玻片上，确保微柱部分朝上，并用35 mm培养皿盖覆盖装置，以防止在后续胚珠提取过程中培养基干燥。
3. 荚果解剖与胚珠提取
- 用70%乙醇擦拭针头（0.40 mm G）和精细镊子进行消毒。可通过将针头固定在注射器或木棒上来方便操作。
- 检查植株的花序，选择适合实验的角果。约5 mm的角果中含有合子，而8–10 mm的角果包含年轻的球形胚胎。
- 用镊子切除角果，并将其放置在76 × 26 mm载玻片的双面胶带上。一个角果含有约40 - 60个胚珠，3 - 4个角果（即120 - 240 个胚珠足以用于一个装置。
- 在体视显微镜下，使用无菌的解剖针和镊子打开角果（子房壁），以观察内部的胚珠。仅切割子房壁，避免损伤胚珠。
- 将打开的角果转移至PDMS装置上的N5T培养基中（步骤2.7中制备），并用针或镊子将胚珠释放到培养基中。
- 将一块小盖玻片（18 mm × 18 mm）置于PDMS装置上，以将胚珠压入微柱阵列的间隙中。
- 用镊子或手指水平拉动盖玻片将其取下，以去除多余的培养基。
- 将PDMS装置倒置，放入35 mm玻璃底培养皿中，用方形尖头镊子轻轻按压装置，使其贴附在玻璃表面。
- 将N5T培养基轻轻倒入玻璃底培养皿中，倾斜培养基瓶直至PDMS装置完全浸没在培养基中，然后用石蜡膜密封培养皿。
注意：PDMS 装置可回收利用，但使用过久的装置容易从玻璃底部脱落。此外，若在步骤 2.5 中未完全脱气，或培养基加入过快，装置可能会漂浮。
图 2：样品制备的示意图流程。
该示意图流程对应步骤 3.5 至 4.1。请点击此处查看此图的放大版本。
4. 时间序列成像
- 将步骤 3.9 中制备的玻璃底培养皿置于倒置显微镜下，选择合适的胚珠进行聚焦。
注意：由于胚珠在发育阶段、位置和方向上存在差异，应通过观察其标记荧光来筛选合适的胚珠。 - 根据显微镜系统的制造商说明启动活体成像。
注意：显微镜设备和参数多种多样，用户应根据实验目的选择合适的设置。例如，本文所用的设置列于表 1中。
| 设备/设置 | 图3 (A) 及补充视频1和4 | 图3 (B) 及补充视频2 | 补充视频3 |
| 显微镜 | 激光扫描倒置显微镜 (A1R MP) | 转盘共聚焦倒置显微镜 (CSU-W1) | 带有稳定培养箱的箱式倒置共聚焦显微镜系统 (CV1000) |
| 激光器 | Ti:蓝宝石飞秒脉冲激光器 | 488 nm 和 561 nm LD 激光器 | 488 nm 和 561 nm LD 激光器 |
| 物镜 | 40倍水浸物镜 (NA = 1.15)，使用浸液介质 | 60倍硅油浸物镜 (NA = 1.30)，安装于压电聚焦驱动装置上 | 40倍物镜 (NA = 0.95) |
| 探测器 | 外置非扫描型GaAsP PMT探测器 | EMCCD相机 | EMCCD相机 |
| 二向色镜 | DM495 和 DM560 | DM488/561 | DM400-410/488/561 |
| 滤光片 | 带通滤光片；534/30 nm 和 578/105 nm | 带通滤光片；520/35 nm 和 593/46 nm | 带通滤光片；520/50 nm 和 617/73 nm |
| 沿z轴切片 | 31层z轴堆栈，间隔1 µm | 17层z轴堆栈，间隔3 µm | 7层z轴堆栈，间隔5 µm |
| 时间间隔 | 20 min | 5 min | 10 min |
表1：本论文中使用的显微镜系统及设置。
显微镜设备及参数各不相同，因此每位用户应根据实验选择合适的系统。
- 检查获取的图像序列，并将其转换为通用的视频格式，例如 .avi 或 .mov，以便展示。
注意：如果显微镜软件无法直接输出视频格式，可先将图像保存为 .tif 格式，然后使用 ImageJ（一个受 NIH Image 启发的开源程序）打开并转换文件类型。ImageJ 可从以下网址获取：https://imagej.nih.gov/ij/。此外，ImageJ 还可用于生成 Z 轴堆叠视频，例如最大强度投影，具体操作方法见：https://imagej.net/Z-functions。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
利用该胚珠培养系统，本方法能够追踪合子极化和胚胎图式形成的动态过程。这一成果具有重要意义，因为此前尚无技术可实时观察深藏于母体组织内部的合子与胚胎的行为。图3A 和 补充视频1 显示，年轻合子中的微管（MTs）在亚顶端区域聚集形成一个横向环状结构10。在合子向顶端方向伸长的过程中，该微管环结构得以维持。当合子伸长完成且细胞核迁移至顶端区域后，微管环消失，微管重新组装成纺锤体以实现DNA分离。图3B 和 补充视频2 显示，胚胎细胞协调分裂，形成具有辐射对称性的球形结构8。该方法适用于药理学实验。例如，在含有合子的胚珠液体培养基中加入肌动蛋白聚合抑制剂（latrunculin B；Lat B）后，极性核迁移受到抑制，导致合子以更对称的方式分裂，表明肌动蛋白丝在合子极化过程中的作用（...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文介绍了一种简单的方法 体外 一种适用于受精卵和胚胎发育过程活细胞成像的高效胚珠培养方案。
PDMS 装置的设计可能需要根据胚胎发育阶段进行优化。最初开发的装置是微笼阵列，用于调整胚珠的方向并固定其位置9，随后构建了一种微柱装置，以更高效地捕获胚珠8。此外，微柱比微笼更细更柔软，因此在长期观察过程中不会阻碍胚珠的膨胀。该微柱装置可固定胚珠数天，从合子期直至胚胎心脏期8。然而，最终完全膨胀的胚珠高度会超过微柱的高度，从而将装置顶起。因此，若研究重点为较晚阶段的胚胎，则应调整微柱的高度和间距。
由于胚珠位于培养皿底部，必须使用倒置显微镜。共聚焦显微镜足以用于监测细胞分裂模式，如图所示 图3B 和 补充视频 2 和 38,...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究的显微镜实验在名古屋大学变革性生物分子研究所（WPI-ITbM）完成，并得到日本先进植物科学网络的支持。本研究获得了日本科学技术振兴机构（T.H. 和 M.U. 的 ERATO 项目）以及日本学术振兴会的资助：创新科学领域研究资助（M.U. 项目编号：JP24113514、JP26113710、JP15H05962 和 JP15H05955；T.H. 项目编号：JP16H06465、JP16H06464 和 JP16K21727），青年科学家研究资助（B 类，M.U. 项目编号：JP24770045 和 JP26840093），以及挑战性探索研究资助（M.U. 项目编号：JP16K14753）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 尼奇基本盐混合物 | Duchefa | N0223 | |
| 海藻糖二水合物 | Wako Pure Chemical | 206-18455 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| 甘伯格’s 维生素溶液 | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| 35 mm 玻璃底培养皿 | Matsunami Glass | D111300 | |
| 35 mm 培养皿 | Corning | 430588 | |
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| 76 × 26 mm 载玻片 | Matsunami Glass | S1225 | |
| 18 × 18 mm 载玻片 | Matsunami Glass | C018181 | |
| 针头（规格 0.40 mm） | Terumo | NN-2719S | |
| 浸油介质 Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| A1R MP | Nikon | A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | 该设备为定制仪器，因此无目录编号。 | |
| CV1000 | Yokogawa Electric | CV1000-SP84 |
参考文献
- Natesh, S., Rau, M. A. Embryology of Angiosperms. Johri, B. M. , Springer. Berlin Heidelberg. 377-443 (1984).
- Kranz, E., Lorz, H. In vitro fertilisation of maize by single egg and sperm cell protoplast fusion mediated by high calcium and high pH. Zygote. 2 (2), 125-128 (1994).
- Uchiumi, T., Uemura, I., Okamoto, T. Establishment of an in vitro fertilization system in rice (Oryza sativa L.). Planta. 226 (3), 581-589 (2007).
- Sun, M. X., Moscatelli, A., Yang, H. Y., Cresti, M. In vitro double fertilization in Nicotiana tabacum (L.): the role of cell volume in cell fusion. Sex Plant Rep. 13 (4), 225-229 (2001).
- Tian, H. Q., Yuan, T., Russell, S. D. Relationship between double fertilization and the cell cycle in male and female gametes of tobacco. Sex Plant Rep. 17 (5), 243-252 (2004).
- Costa, L. M., et al. Central cell-derived peptides regulate early embryo patterning in flowering plants. Science. 344 (6180), 168-172 (2014).
- Sauer, M., Friml, J. In vitro culture of Arabidopsis embryos within their ovules. Plant J. 40 (5), 835-843 (2004).
- Gooh, K., et al. Live-cell imaging and optical manipulation of Arabidopsis early embryogenesis. Dev Cell. 34 (2), 242-251 (2015).
- Park, J., Kurihara, D., Higashiyama, T., Arata, H. Fabrication of microcage arrays to fix plant ovules for long-term live imaging and observation. Sens Act B-Chem. 191, 178-185 (2014).
- Kimata, Y., et al. Cytoskeleton dynamics control the first asymmetric cell division in Arabidopsis zygote. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14157-14162 (2016).
- Nambo, M., et al. Combination of Synthetic Chemistry and Live-Cell Imaging Identified a Rapid Cell Division Inhibitor in Tobacco and Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 57 (11), 2255-2268 (2016).
- Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues. Protoplasma. 252 (5), 1231-1240 (2015).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
