用于可注射再生治疗和高通量药物筛选的三维微组织

摘要

本方案描述了一种结合微加工技术与冷冻凝胶化技术制备弹性三维大孔微凝胶的方法。在载入细胞后，可形成三维微组织，且易于注射 在体内 以促进再生治疗，或组装成阵列用于 体外 高通量药物筛选

摘要

为了将传统的二维细胞培养升级为三维细胞培养，我们结合了微加工技术与冷冻凝胶化技术，制备出具有大孔结构的微米级冷冻凝胶（microcryogels），该凝胶可负载多种类型的细胞以形成三维微组织。本文介绍了构建多功能三维微组织的实验方案，及其在再生治疗与药物筛选中的应用。可在阵列芯片上制备尺寸和形状可控的微冷冻凝胶，这些凝胶可从芯片上分离，作为单个负载细胞的载体用于可注射的再生治疗；也可进一步在芯片上组装成三维微组织阵列，用于高通量药物筛选。由于这些微米级冷冻凝胶具有高度弹性，三维微组织在注射过程中可有效保护细胞免受机械剪切力损伤，因而表现出优异的可注射性，适用于微创细胞治疗。这在中国台湾小鼠肢体缺血模型中显著提高了细胞存活率和治疗效果。同时，将三维微组织阵列组装于标准的384孔多孔板格式中，便于使用常规实验室设备与设施，从而可在这一多功能三维细胞培养平台上实现高通量药物筛选。

引言

传统的二维（2D）平面培养体系（如培养皿或多孔板）难以诱导细胞表现出接近其天然状态的生物学行为。准确模拟包含多种细胞类型、细胞外基质及生物活性可溶性因子的三维（3D）结构中的天然细胞微环境^1,2,3,4对于构建仿生组织至关重要 体外 在组织工程、再生医学、基础生物学研究和药物发现中的应用^5,6,7,8,9.

与二维细胞培养相比，三维细胞培养被广泛用于促进培养细胞的仿生微结构和功能特征 体外一种常用的三维细胞培养方法是将细胞聚集成球状体^7,8,9,

方案

动物实验遵循清华大学生物医学分析中心动物伦理委员会批准的严格方案。在伦理委员会批准下，通过患者知情同意，从北京协和医院整形外科获取人体脂肪组织。

1. 3D 微型冷冻凝胶的制备

1. 微模板阵列芯片的设计与制备
   1. 使用商业软件设计特定几何形状的阵列，例如圆形、椭圆形、三角形或三叶形¹⁴，具体形状根据后续应用而定。
      注意：有关再生医学的设计细节，请参见本方案第2节；有关药物筛选的设计细节，请参见本方案第3节。
   2. 将设计导入激光雕刻机配套的激光雕刻软件中。根据激光雕刻机厂家推荐的激光参数设置，将导入的设计图案激光雕刻至聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）板材上。
   3. 用去离子水清洗微模板阵列芯片，以去除激光雕刻产生的碎屑。在60 °C下干燥芯片，并于室温下密封保存数月。
2. 微冷冻凝胶阵列芯片的制备
   1. 将4个微模板阵列芯片放置于样品托盘上，插入等离子清洗机中。关闭清洗机门，开启真空泵抽真空2分钟，然后开启最大射频功率（18 W），在室温下对微模板阵列芯片进行3分钟的等离子处理，以增强其亲水性。
   2. 将0.06 g明胶加入1 mL去离子水中，配制成6%（wt/vol）的明胶前体溶液（足够制备5个芯片）....

结果

用于三维微组织形成的微冻胶的制备与表征。

根据本方案，制备了微冻凝胶以形成三维微组织，以及单个微冻凝胶或微冻凝胶阵列，并分别应用于再生治疗和药物筛选（图1）。由聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）制备的微模板阵列芯片被用作微冻凝胶阵列芯片的微模具。微模板阵列芯片可制备成多种几何形状。本文选择一种典型的45 mm × 14 mm微模板阵列芯片作为示例，其包含多种形状（即圆形、椭圆形、三角形和三叶形），以及一组不同尺寸的圆形微模板阵列芯片（直径分别为100、200、400和800 µm）。为了增强阵列芯片上微模具的可视性，采用了透射光照明成像（图2A、B）。从阵列芯片上收获的微冻凝胶呈现出预期的形状和尺寸（图2C

讨论

再生医学与 体外 用于药物筛选的模型是组织工程的两个重要应用^5,6,7,8,9尽管这两种应用的需求截然不同，但它们的共同之处在于需要更接近生物体内的培养条件，以增强细胞功能¹⁹只有通过提升研究中的细胞功能，我们才能更好地治疗疾病^20,21，如果培养的细胞能更准确地反映药物反应，我们是否能够加速药物发现进程^6,7移植后细胞存活率 体内 再生医学的关键要求是细胞载体具备体内移植的适用性，而药物筛选则需要高.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
明胶	sigma	G7041	所有其他试剂均购自 Sigma-Aldrich（St. Louis, MO），除非另有说明。
戊二醛	J&K	902042	用作材料制备过程中的交联剂。
玻璃盖玻片（24 × 50 mm）	CITOGLASS，中国	10212450C	将前驱体溶液刮涂到微模板阵列芯片上。
钠 硼氢化物，NaBH4	北京化工厂	116-8	凝胶化后洗去残留的戊二醛。
真空罐	中国台湾	VC8130	在真空条件下保存微凝胶。
聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）板材	新金电子有限公司，中国		普通PMMA板材。
Rayjet激光系统	雷捷特，澳大利亚	Rayjet 50 C30	对PMMA板材进行刻蚀以形成孔穴。
等离子清洗机	Mycro Technologies，美国	PDC-32G	为了使PMMA具有亲水性。
冻干机	中国博伊康	SC21CL	用于冻干材料。
0.4% 台盼蓝溶液	中国中科科奥	DA0065	对微凝胶进行染色。
盐酸多柔比星	ENERGY CHEMICAL，中国	A01E0801360010	在二维或三维微凝胶中检测细胞的耐药性。
活细胞/死细胞检测	Dojindo Molecular Technologies（日本熊本）	CS01-10	用于区分活细胞与死细胞。
Cell Titer-Blue	美国威斯康星州普洛麦格公司	G8080	检测细胞活力。
细胞筛	BD 生物科学公司，美国	352360	收集微凝胶。
D-荧光素	SYNCHEM（德国）	s039	贴壁细胞。
扫描电子显微镜	FEI，美国	Quanta 200	表征微凝胶形态。
力学测试机	Bose，美国	3230	用于测量机械特性。
可编程注射泵	美国 World Precision Instruments 公司	ALADINI 1000	测试可注射性。
数字测力计	HBO，中国乐清海宝仪器有限公司	H-50	测试可注射性。
环氧乙烷灭菌系统	Anprolene，Anderson Sterilization, Inc.，北卡罗来纳州霍河	AN74i	使用环氧乙烷气体对微凝胶进行灭菌。
酶标仪	Molecular Devices，美国	M5	测量微阵列中的荧光强度
共聚焦显微镜	日本尼康	A1Rsi	观察细胞在三维空间中的分布。
Xenogen  Lumina II 成像系统	美国Caliper生命科学公司	IVIS	在动物体内追踪细胞
液体处理工作站	美国杏仁设计	S-移液管	用于高通量加载培养基或细胞悬液。