3D Microtissues 用于可注射再生疗法和高通量药物筛选

摘要

本协议描述了通过将微细加工与 cryogelation 技术相结合的方法制备弹性3D 大孔 microcryogels。在加载与细胞, 3D microtissues 生成, 这可以很容易地注入在体内, 以促进再生治疗或组装成阵列的体外高通量药物筛选。

摘要

为了将传统的2D 细胞培养技术升级到3D 细胞培养, 我们将微加工与 cryogelation 工艺相结合, 生产出大孔微尺度 cryogels (microcryogels), 可加载多种细胞类型, 形成 3D microtissues。在此, 我们提出了制造多功能 3D microtissues 及其在再生疗法和药物筛选中的应用的协议。尺寸和形状可控 microcryogels 可以在一个阵列芯片上制作, 可以被捕获片作为单独的细胞负载载体的可注射再生疗法或进一步组装在芯片上 3D microtissue 阵列的高通量药物筛选。由于这些微型 cryogels 的高弹性性质, 3D microtissues 在注射过程中保护细胞免受机械剪切力的侵袭, 为微创细胞治疗提供了巨大的可。这就保证了小鼠肢体缺血模型中细胞存活率的提高和治疗效果。同时, 以标准的 384-井格式组装 3D microtissue 阵列, 便于使用通用的实验室设施和设备, 使高通量的药物筛选在这个多才多艺的3D 细胞培养平台。

引言

传统的细胞培养在平坦的 two-dimensional (2D) 表面, 如培养皿或井板, 很难引出细胞行为接近他们的本土状态。在三维 (3D) 体系结构中包含各种细胞类型、胞外基质和生物活性可溶性因子的环境的精确重述^{1,2,3 ,4}, 对于组织工程、再生医学、基础生物学研究和药物发现的应用 (^5、6、7),在体外构建 biomimicking 组织是必不可少的. ^,8,9。

在2D 细胞培养中, 3D 细胞培养被广泛应用于培养细胞的仿生微结构和功能性特征的体外。流行的3D 单元格区域性方法是将单元格聚合为椭球^7、8、

方案

动物实验遵循了清华大学生物医学分析中心动物伦理委员会批准的严格的协议。在伦理委员会的批准下, 从北京协和医院整形外科部门获得了患者的知情同意, 得到了人体脂肪组织.

1. 制作 3D Microcryogels

1. microstencil 阵列芯片的设计和制作
   1. 使用商用软件设计特定几何图形的数组, 如圆、椭圆、三角形或草 ¹⁴ , 具体取决于后续应用程序.
      注: 请参阅《再生医学议定书》2节和《药物筛选议定书》3节的设计细节.
   2. 将设计导入激光雕刻机随附的激光雕刻软件中。根据工厂推荐的激光雕刻机, 将进口的设计用激光刻在聚 (methymethacrylate) (PMMA) 片上.
   3. 用去离子水清洗 microstencil 阵列芯片, 清除激光雕刻的碎片。在60和 #176 中烘干 microstencil 阵列芯片; c. 在室温下存放几个月的密封袋.
2. 制作 microcryogel 阵列芯片
   1. 将 4 microstencil 阵列芯片放在样品托盘上, 并插入等离子清洗器中。关闭清洁器的门, 打开真空泵2分钟, 然后打开最大的射频功率 (18 W), 以处理等离子清洗....

结果

3D microtissue 形成的 microcryogels 的制备和表征。

根据该协议, microcryogels 是捏造的, 形成 3D microtissues 和个人 microcryogels 或 microcryogel 阵列, 并分别用于再生疗法和药物筛选 (图 1)。用 PMMA 制备的 Microstencil 阵列芯片作为 microcryogel 阵列芯片的 micromolds。microstencil 阵列芯片可进行可变几何设计。我们选择了一个代表性的 45 mm x 14 mm microstencil 阵列芯片作为一个例子, 其中包含各种形状 (即, 圆形, 椭圆形, 三角形和三叶草) 和一个圆形的 microstencil 阵列芯片的大小不同 (直径 = 100, 200, 400 和800µm). 为了.......

讨论

再生医学和体外药物筛选模型是组织工程的两个重要应用:^5,6,7,8,9。虽然这两种应用有着截然不同的需求, 但它们之间的共同点在于需要一个更具仿生的培养条件来增强细胞功能¹⁹。只有改进的细胞功能研究才能更好的治疗疾病^20,21, 如果培养细胞反映药物反应更准确, 我们可以加速药物发现^6,7。细胞存活后, 植入在体内是一个关键的要求, 再生医学, 而吞吐量是重要的药物筛选, 以处理数以千计的化合物, 在.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
明胶	sigma	G7041	除非另有说明，否则所有其他试剂均购自 Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）。
戊二醛	J&K	902042	用作制备材料的交联剂。
玻璃盖玻片 （24 x 50 mm）	CITOGLASS， 中国	10212450C	将 prcursor 溶液刮到微模板阵列芯片上。
钠 硼氢化物，NaBH4	北京化工厂	116-8	将凝胶化后剩余的戊二醛洗去。
真空罐	asperts， 中国	VC8130	在真空下保存微凝胶。
聚甲基丙烯酸甲酯 （PMMA） 片材	Sunjin Electronics Co.， Ltd， 中国		普通 PMMA 片材。
Rayjet 激光系统	Rayjet，澳大利亚 Rayjet	50 C30	雕刻 PMMA 片材以形成井。
等离子清洗剂	美国 Mycro Technologies	PDC-32G	使 PMMA 具有亲湿性。
冻干机	Boyikang， China	SC21CL	冻干材料。
台盼蓝溶液 （0.4%）	Zhongkekeao， China	DA0065	染色微凝胶。
盐酸阿霉素	ENERGY CHEMICAL， 中国	A01E0801360010	在 2D 或 3D 微凝胶中测试细胞的耐药性。
活/死测定	Dojindo Molecular Technologies （Kumamoto， Japan）	CS01-10	区分活细胞和死细胞。
Cell Titer-Blue	Promega（美国威斯康星州）。	G8080	测试细胞活力。
细胞过滤器	BD Biosciences， USA	352360	收集微凝胶。
D-Luciferin	SYNCHEM （Germany）	s039	粘结细胞。
扫描电子显微镜	FEI，美国	Quanta 200	表征微凝胶形态。
机械试验机	Bose， USA	3230	测量机械特性。
可编程注射泵	世界精密仪器公司，美国	ALADINI 1000	测试精干。
数字测力计	HBO， 乐清市海宝仪表有限公司， 中国	H-50	测试 injactabiliy.
环氧乙烷灭菌系统	Anprolene， Anderson Sterilization， Inc.， Haw River， NC	AN74i	用环氧乙烷气体对微凝胶进行灭菌。
酶标仪	Molecular Devices，USA	M5	测量微阵列中的荧光强度。
共聚焦显微镜	尼康，日本	A1Rsi	观察 3D 细胞分布。
异种 Lumina II 成像系统	Caliper Life Sciences，美国	IVIS	追踪动物体内的细胞。
液体工作状态	杏色设计，美国	S-移液器	用于高浓度加载培养基或细胞悬液。